Summary

Neurale stamcelreactivatie in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten

Published: May 18, 2022
doi:

Summary

Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.

Abstract

Neurale stamcellen (NSC’s) hebben het vermogen om zich te vermenigvuldigen, te differentiëren, apoptose te ondergaan en zelfs rust in en uit te gaan. Veel van deze processen worden gecontroleerd door het complexe samenspel tussen NSC intrinsieke genetische programma’s met NSC extrinsieke factoren, lokaal en systemisch. In het genetische modelorganisme, Drosophila melanogaster, schakelen NSC’s, bekend als neuroblasten (NBs), over van rust naar proliferatie tijdens de embryonale naar larvale overgang. Gedurende deze tijd komen larven uit hun eierschalen en beginnen te kruipen, op zoek naar voedingsstoffen in de voeding. Als reactie op diervoeding produceert het vetlichaam, een endocriene orgaan met lipideopslagcapaciteit, een signaal, dat systemisch wordt vrijgegeven in de circulerende hemolymfe. Als reactie op het van het vetlichaam afgeleide signaal (FBDS) worden Drosophila insuline-achtige peptiden (Dilps) geproduceerd en vrijgegeven uit neurosecretoire neuronen en glia in de hersenen, wat leidt tot downstream activering van PI3-kinase groeisignalering in NBs en hun gliale en tracheale niche. Hoewel dit het huidige model is voor hoe NB’s overschakelen van rust naar proliferatie, blijft de aard van de extrinsieke cue van FBDS ongrijpbaar. Om beter te begrijpen hoe NB extrinsieke systemische signalen de exit van rust reguleren, werd een methode ontwikkeld om vroege larvale hersenen in vitro te kweken voordat dieren zich voeden. Met deze methode kunnen exogene factoren worden geleverd aan de cultuurmedia en NB exit uit rusttest. We ontdekten dat exogene insuline voldoende is om NBs te reactiveren vanaf rust in explantaten van de hele hersenen. Omdat deze methode zeer geschikt is voor grootschalige schermen, streven we ernaar om extra extrinsieke signalen te identificeren die NB-rust versus proliferatiebeslissingen reguleren. Omdat de genen en routes die NSC-proliferatiebeslissingen reguleren evolutionair geconserveerd zijn, kunnen de resultaten van deze test inzicht geven in het verbeteren van regeneratieve therapieën in de kliniek.

Introduction

Stamcellen zijn van groot belang vanwege hun potentieel voor gebruik in regeneratieve geneeskunde 1,2. Veel dieren, vooral die met een lang leven, onderhouden stamcellen in hun volwassen weefsels. Deze residente stamcellen functioneren om weefselhomeostase te behouden en worden gebruikt voor reparatie na lichamelijk letsel of ziekte 3,4. De meeste stamcellen bij volwassen dieren zijn rustig, een relatief slapende toestand die wordt gekenmerkt door celcyclusstop en inactivatie van groeisignalering5. Als reactie op extrinsieke signalen verlaten stamcellen de rust, gaan ze de celcyclus in en beginnen ze dochter nakomelingen te genereren die specifiek zijn voor hun weefseltype. Om bijvoorbeeld een effectieve immuunrespons op te zetten, induceren antigeen-presenterende cellen rustige naïeve T-cellen om de celcyclus binnen te gaan en klonaal uit te breiden6. Als reactie op schade aan de skeletspieren komen spiersatellietstamcellen in de celcyclus en genereren dochtermyoblasten om beschadigde myofibrillen te vervangen 5,7. Hoewel het duidelijk is dat rustige stamcellen reageren op extrinsieke signalen, blijft in veel gevallen de aard van de extrinsieke cue onduidelijk, evenals het mechanisme van cue-geïnduceerde stamcelactivering. Het verkrijgen van een beter begrip van hoe rustige stamcellen reageren op extrinsieke signalen en de celcyclus ingaan, zal helpen bij de ontwikkeling van betere stamceltherapieën in de kliniek en de wetenschappelijke kennis vergroten.

Al tientallen jaren worden modelorganismen gebruikt om de genen en celsignaleringsroutes bloot te leggen die de proliferatie van stamcellen tijdens de ontwikkeling en op volwassen leeftijd reguleren. In Drosophila delen neurale stamcellen (NSC’s), bekend als neuroblasten (NBs), zich tijdens de ontwikkeling om alle neuronen en glia te genereren die uiteindelijk integreren en het neurale circuit vormen dat nodig is voor de hersenfunctie 8,9. Net als andere stamcellen delen NB’s zich asymmetrisch om zichzelf te vernieuwen en, in sommige gevallen, symmetrisch om de stamcelpool uit te breiden. NBs worden gespecificeerd tijdens embryogenese en de meeste komen tegen het einde in rust, samenvallend met afnemende maternale voedingsvoorraden (figuur 1). Nadat de embryogenese is voltooid, komen de larven uit en beginnen ze zich te voeden. Als reactie op diervoeding reactiveren NB’s uit rust en hervatten celdelingen 10,11,12,13,14,15,16. Omdat het Drosophila CNS relatief eenvoudig is en omdat NBs op bepaalde tijden rust in- en uitstappen, blijkt het gebruik van Drosophila om de regulatie van rust, in- en uitgang te onderzoeken, ideaal.

Figure 1
Figuur 1: Relatieve proliferatie van CB NBs (centrale hersen neuroblasten, rood) en MB NBs (mushroom body neuroblasts, blauw) over ontwikkelingstijd. Aan het einde van de embryogenese stoppen de meeste NB’s (rode lijn) met proliferatie en komen ze in rust. De rust gaat door totdat vers uitgekomen larven hun eerste volledige maaltijd consumeren. De tijdsfocuspunten voor deze methodologie worden aangegeven in rode cirkels (1, rust en 2, reactivering). MB NBs (blauw) zijn een subset van centrale hersenen NBs die zich voortdurend verdelen tijdens de ontwikkeling (4 per hersenhelft). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als reactie op diervoeding worden PI3-kinase- en TOR-groeisignaleringsroutes actief in NBs en in hun gliale en tracheale niche 10,11,15,16. Wanneer voedingsstoffen uit de voeding worden teruggetrokken of wanneer de niveaus van PI3-kinase worden verlaagd, slagen DE’s er niet in om te reactiveren en wordt de groei van glia en luchtpijp ook verminderd 10,11,15,16. Het huidige model stelt dat NB-reactivering wordt gekoppeld aan larvale groei door het vetlichaam, dat een systemisch signaal afgeeft als reactie op diervoeding 12,17,18. Dit signaal, dat ongrijpbaar blijft, bevordert waarschijnlijk de expressie en afgifte van Drosophila insuline-achtig peptide (Dilps) in de hersenen, wat leidt tot de stroomafwaartse activering van PI3-kinase in NB’s en hun gliale en tracheale niche. Om de aard van de systemische cue(s) beter te begrijpen, ontwikkelden we een methode om rustige NB’s in gekweekte hersenexplantaten te reactiveren. Met deze methode kan reactivering van NBs worden getest in afwezigheid van systemische signalen van het hele dier. Exogene factoren kunnen worden teruggeleverd aan de kweekmedia en NB-reactivering getest op basis van de opname van het thymidine-analoog, EdU. Met behulp van deze methode hebben we vastgesteld dat exogene insuline voldoende is om rustige NB’s in hersenexplantaten te reactiveren. Toekomstig werk zal gericht zijn op het identificeren van aanvullende factoren die, wanneer ze weer worden toegevoegd, nb-rust in hersenexplantaten positief of negatief reguleren.

Protocol

1. Drosophila larven collectie OPMERKING: Bereid de gistplaat, druivenpasta en het Fly-appartement voordat u begint: Gistpasta: Meng in een kleine container 5 g actieve droge gist met 10 ml water om een pasta te vormen die de consistentie van pindakaas heeft. Bedek de gistpasta met plasticfolie en gebruik een elastiekje om het stevig aan de container te bevestigen.OPMERKING: Verse gistpasta zal uitzetten in de container en zal van het deksel springen ten…

Representative Results

Vers uitgekomen OregonR wild-type hersenen werden ontleed en gedurende 24 uur gekweekt in aangevulde Schneider’s media (SSM) met insuline. Weefsels werden gefixeerd en gekleurd volgens het protocol. Primaire antilichamen gegenereerd tegen Deadpan (Dpn) om NBs te detecteren en Scribble om celmembranen te labelen werden gebruikt. Het thymidine-analoog 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (Edu) werd toegevoegd om S-fase entry en NB-reactivering te detecteren. We vonden grote Edu positieve en Dpn positieve OS’s na 24 uur in cultuur (…

Discussion

De hier beschreven methode om hersenexplantaten te kweken, kan in de meeste laboratoriumomgevingen worden uitgevoerd. De benodigde tools, evenals de procedure en gegevensverzameling, zijn eenvoudig en ongecompliceerd. Met deze methode kan men een verscheidenheid aan hypothesen testen, waaronder die met betrekking tot de celsignaleringscascades en extrinsieke factoren die NB-reactivering en proliferatie reguleren. Hier, met behulp van wild-type OregonR-dieren, vonden we dat exogene insuline voldoende was om NBs te reactiv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We erkennen het LSAMP Bridges to Doctorate-programma voor financiering (CNK) en NIH / NIGMS (R01-GM120421 en R35-GM141886). We zijn Dr. Conor Sipe dankbaar voor figuur 1. We bedanken ook alle Siegrist-lableden voor hun voortdurende steun en mentorschap. We bedanken in het bijzonder Chhavi Sood en Gary Teeters voor hun zorgvuldige lezing van het manuscript en voor het geven van commentaar.

Materials

10 µL Pipette tips Denville Sci P2102
1000 µL Pipette tips Denville Sci P2103-N
1000 µL Pipettor Gilson P1000
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) Electron Microscopy Sciences 2912.60.0000 Used for Fixation of Larval Brains
20 µL Pipette Gilson P20
200 µL Pipette tips Gilson P200
200 µL Pipette tips Denville Sci 1158U56
24-well multiwell culture plates Fisher Scientific 50-197-4477
35 mm Petri dishes Fisher Scientific 08-757-100A Grape Plate Ingredients
4 °C refrigerator Fisher Scientific Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution
63x Objective Lecia
Active dry yeast Most supermarkets
Agarose Fisher Scientific 214010 Grape Plate Ingredients
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye Thermo Fisher Scientific C10340 to label proliferating cells
Confocal Microscope Leica SP8
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz Fisher Scientific 12-544-10 Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged.
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm Fisher Scientific 12-545E The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging.
Dissecting microscope Zeiss Stemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle Fisher Scientific 2701 Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium
Fetal Bovine Serum (10%) Sigma F4135-100ML Supplement for cell culture media.
Fine forceps for dissection Fine Science Tools 11295-20 Forcepts used in disections. They work best when sharpened.
Fly Bottles for Crossing Genessee Scientific 32-130 This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate.
Glass Dissection Dish (3 well) These are no longer available
Glutathione Sigma G6013 Provides oxidative protection during cell culture.
Goat Serum Sigma G9023- 10ML Blocking Agent
Grape Plates Made in house Made in house Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs
Image J Imagej.net/fiji/downloads Free Download:  https://fiji.sc Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation
Incubator Thermo Fisher Scientific Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Insulin Sigma I0516 Independant variable of the experiment
Laminar flow hood For aliquoting culture media
L-Glutamine Sigma G7513 Provides support during cell culture
Nunc 72-well Microwell Mini Trays Fisher Scientific 12-565-154 Immunostaining steps are performed in this tray
Parafilm Fisher Scientific S37440 Film used to seal plates in order to prevent evaporation
Pen-Strep Sigma P4458-100ml Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
Phosphate Buffer, pH7.4 Made in house Made in house Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps
Pick Fine Science Tools 10140-01 Used to pick larvae off of the grape plate
Propionic acid Fisher Scientific A-258 Grape Plate Ingredients
Rabbit 405 Abcam ab175653 Antibodies used for immunostaining
Rat 555 Abcam ab150166 Antibodies used for immunostaining
Rb Scribble A Gift from Chris Doe Antibodies used for immunostaining
Rt Deadpan Abcam ab195173 Antibodies used for immunostaining
Schneiders Culture Medium Life Tech 21720024 Contains nutrients that help the cells grow and proliferate
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) Life Tech S36963 Reagent that provides protection against fading fluorophores
Sterile Water Autoclave Milli-Q water made in house Needed for Solutions
Sucrose Fisher S2-12 Grape Plate Ingredients
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Superglue Most supermarkets
Tegosept Genesee Scientific 20-259 Grape Plate Ingredients
Triton-X 100 Sigma T9284-100ML PBT
Welch's 100% grape grape juice Most supermarkets Grape Plate Ingredients

References

  1. Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
  4. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
  5. van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
  6. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
  7. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  9. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
  10. Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
  11. Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
  12. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  13. Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
  14. Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
  15. Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
  16. Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
  17. Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
  18. Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
  19. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
  20. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
  21. Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
  22. Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).

Play Video

Cite This Article
Naomi Keliinui, C., Doyle, S. E., Siegrist, S. E. Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants. J. Vis. Exp. (183), e63189, doi:10.3791/63189 (2022).

View Video