Det er etablert en metode for å reaktivere passiviserende nevrale stamceller i dyrkede Drosophila hjerneutløp. Ved hjelp av denne metoden kan rollen til systemiske signaler løsnes fra vevsintrinsiske signaler i reguleringen av nevral stamcelle passivis, inngang og utgang.
Nevrale stamceller (NSC) har evnen til å spre seg, differensiere, gjennomgå apoptose, og til og med gå inn og ut av passiviteten. Mange av disse prosessene styres av det komplekse samspillet mellom NSC iboende genetiske programmer med NSC-ekstrinsiske faktorer, lokale og systemiske. I den genetiske modellorganismen bytter Drosophila melanogaster, NSC, kjent som nevroblaster (NBs), fra passiviteten til spredning under embryonal til larvalovergang. I løpet av denne tiden kommer larver ut av eggeskallene sine og begynner å krype, oppsøke diettnæringsstoffer. Som svar på dyrefôring produserer fettlegemet, et endokrine organ med lipidlagringskapasitet, et signal som frigjøres systemisk inn i den sirkulerende hemolymfen. Som svar på det fett kroppsavledede signalet (FBDS) produseres og frigjøres Drosophila insulinlignende peptider (Dilps) fra hjernens nevrosekretoriske nevroner og glia, noe som fører til nedstrøms aktivering av PI3-kinase vekstsignalering i NBs og deres glial og trakeal nisje. Selv om dette er den nåværende modellen for hvordan NBs bytter fra passiviteten til spredning, forblir arten av FBDS ekstrinsiske signal unnvikende. For bedre å forstå hvordan NB ekstrinsiske systemiske signaler regulerer utgang fra passiviteten, ble det utviklet en metode for å dyrke tidlige larvalhjerner in vitro før dyrefôring. Med denne metoden kan eksogene faktorer leveres til kulturmediene og NB-utgangen fra passivitet analysert. Vi fant at eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere NBs fra passiviteten i hele hjernens eksplanter. Fordi denne metoden er velegnet for skjermer i stor skala, tar vi sikte på å identifisere flere ekstrinsiske signaler som regulerer NB-passiviteten kontra spredningsbeslutninger. Fordi genene og veiene som regulerer NSC-spredningsbeslutninger er evolusjonært bevart, kan resultater fra denne analysen gi innsikt i å forbedre regenerative terapier i klinikken.
Stamceller er av stor interesse på grunn av deres potensial for bruk i regenerativ medisin 1,2. Mange dyr, spesielt de som er lang levetid, opprettholder stamceller i deres voksne vev. Disse residente stamcellene fungerer for å opprettholde vev homeostase og brukes til reparasjon etter fysisk skade eller sykdom 3,4. De fleste stamceller hos voksne dyr er passiviserende, en relativt sovende tilstand preget av cellesyklusstans og inaktivering av vekstsignalering5. Som svar på ekstrinsiske signaler går stamceller ut av passiviteten, går inn i cellesyklusen og begynner å generere datteravkom som er spesifikk for deres vevstype. For eksempel, for å montere en effektiv immunrespons, induserer antigen-presenterende celler passiv naive T-celler for å komme inn i cellesyklusen og clonally utvide6. Som svar på skjelettmuskulaturskader, kommer muskelsatellitt stamceller inn i cellesyklusen og genererer datter myoblaster for å erstatte skadede myofibrils 5,7. Selv om det er klart at passive stamceller reagerer på ekstrinsiske signaler, forblir arten av den ekstrinsiske signalet i tillegg til mekanismen for cue-indusert stamcelleaktivering. Å få en bedre forståelse av hvordan passive stamceller reagerer på ekstrinsiske signaler og gå inn i cellesyklusen, vil bidra til utvikling av bedre stamcellebehandlinger i klinikken og øke vitenskapelig kunnskap.
I flere tiår har modellorganismer blitt brukt til å avdekke genene og cellesignalveiene som regulerer stamcelleproliferasjon under utvikling og i voksen alder. I Drosophila deler nevrale stamceller (NSC), kjent som nevroblaster (NBs), gjennom hele utviklingen for å generere alle nevroner og glia som til slutt integreres, og danner nevralkretsen som kreves for hjernefunksjon 8,9. I likhet med andre stamceller deler NBs asymmetrisk for å fornye seg selv og i noen tilfeller symmetrisk for å utvide stamcellebassenget. NBs er spesifisert under embryogenese og de fleste går inn passivitet mot slutten, sammenfallende med fallende mors næringsbutikker (figur 1). Etter at embryogenesen er fullført, klekker larver og begynner å mate. Som svar på dyrefôring reaktiverer NBs fra passiviteten og gjenopptar celledelinger 10,11,12,13,14,15,16. Fordi Drosophila CNS er relativt enkel og fordi NBs inn- og utgangs passiviteten på definerte tidspunkter, ved hjelp av Drosophila for å undersøke reguleringen av passiviteten, inngangen og utgangen, viser seg å være ideell.
Figur 1: Relativ spredning av CB NBs (sentrale hjerne neuroblaster, rød) og MB NBs (sopp kroppen nevroblaster, blå) over utviklingstid. På slutten av embryogenesen opphører de fleste NBs (rød linje) spredning og går inn i passivitet. Passivence fortsetter til nyutviklede larver bruker sitt første komplette måltid. Fokuspunktene for denne metoden er betegnet i røde sirkler (1, passiviscens og 2, reaktivering). MB NBs (blå) er en undergruppe av sentrale hjerne-NBer som deler seg kontinuerlig gjennom hele utviklingen (4 per hjernehalvdel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som svar på dyrefôring blir PI3-kinase og TOR vekstsignalveier aktive i NBs og i deres glial og trakeal nisje 10,11,15,16. Når næringsstoffene trekkes tilbake eller når nivåene av PI3-kinase reduseres, unnlater NBs å reaktivere og veksten av glia og luftrør reduseres også 10,11,15,16. Den nåværende modellen hevder at NB-reaktivering er koblet til larvvekst av fettlegemet, som frigjør et systemisk signal som svar på dyrefôring 12,17,18. Dette signalet, som forblir unnvikende, fremmer sannsynligvis uttrykket og frigjøringen av Drosophila insulinlignende peptid (Dilps) i hjernen, noe som fører til nedstrøms aktivering av PI3-kinase i NBs og deres glial og trakeal nisje. For bedre å forstå arten av de systemiske signalene, utviklet vi en metode for å reaktivere passiviserende NBs i kultiverte hjerneutløp. Med denne metoden kan reaktivering av NBs analyse i fravær av hele animalske systemiske signaler. Eksogene faktorer kan leveres på nytt til kulturmediene og NB-reaktivering analysert basert på innlemmelsen av tymidanalogen, EdU. Ved hjelp av denne metoden bestemte vi oss for at eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere passivisere NBs i hjerneeksektiver. Fremtidig arbeid vil være rettet mot å identifisere ytterligere faktorer som, når det legges tilbake, enten positivt eller negativt regulerer NB-passivence i hjerneutløp.
Metoden beskrevet her for å dyrke hjerneutløp kan utføres i de fleste laboratoriemiljøer. Verktøyene som kreves, samt prosedyren og datainnsamlingen, er enkle og enkle. Med denne metoden kan man teste en rekke hypoteser, inkludert de som er relatert til cellesignalerende kaskader og ekstrinsiske faktorer som regulerer NB-reaktivering og spredning. Her, ved hjelp av wild-type OregonR dyr, fant vi ut at eksogent insulin var tilstrekkelig til å reaktivere NBs fra passiviteten uavhengig av andre dyrespesifikke systemis…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner LSAMP Bridges to Doctorate program for finansiering (CNK) samt NIH/NIGMS (R01-GM120421 og R35-GM141886). Vi er takknemlige til Dr. Conor Sipe for figur 1. Vi takker også alle Siegrist labmedlemmer for deres fortsatte støtte og mentorskap. Vi takker spesielt Chhavi Sood og Gary Teeters for deres nøye lesning av manuskriptet og for å gi kommentarer.
10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
63x Objective | Lecia | ||
Active dry yeast | Most supermarkets | ||
Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Superglue | Most supermarkets | ||
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |