Summary
Det er etablert en metode for å reaktivere passiviserende nevrale stamceller i dyrkede Drosophila hjerneutløp. Ved hjelp av denne metoden kan rollen til systemiske signaler løsnes fra vevsintrinsiske signaler i reguleringen av nevral stamcelle passivis, inngang og utgang.
Abstract
Nevrale stamceller (NSC) har evnen til å spre seg, differensiere, gjennomgå apoptose, og til og med gå inn og ut av passiviteten. Mange av disse prosessene styres av det komplekse samspillet mellom NSC iboende genetiske programmer med NSC-ekstrinsiske faktorer, lokale og systemiske. I den genetiske modellorganismen bytter Drosophila melanogaster, NSC, kjent som nevroblaster (NBs), fra passiviteten til spredning under embryonal til larvalovergang. I løpet av denne tiden kommer larver ut av eggeskallene sine og begynner å krype, oppsøke diettnæringsstoffer. Som svar på dyrefôring produserer fettlegemet, et endokrine organ med lipidlagringskapasitet, et signal som frigjøres systemisk inn i den sirkulerende hemolymfen. Som svar på det fett kroppsavledede signalet (FBDS) produseres og frigjøres Drosophila insulinlignende peptider (Dilps) fra hjernens nevrosekretoriske nevroner og glia, noe som fører til nedstrøms aktivering av PI3-kinase vekstsignalering i NBs og deres glial og trakeal nisje. Selv om dette er den nåværende modellen for hvordan NBs bytter fra passiviteten til spredning, forblir arten av FBDS ekstrinsiske signal unnvikende. For bedre å forstå hvordan NB ekstrinsiske systemiske signaler regulerer utgang fra passiviteten, ble det utviklet en metode for å dyrke tidlige larvalhjerner in vitro før dyrefôring. Med denne metoden kan eksogene faktorer leveres til kulturmediene og NB-utgangen fra passivitet analysert. Vi fant at eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere NBs fra passiviteten i hele hjernens eksplanter. Fordi denne metoden er velegnet for skjermer i stor skala, tar vi sikte på å identifisere flere ekstrinsiske signaler som regulerer NB-passiviteten kontra spredningsbeslutninger. Fordi genene og veiene som regulerer NSC-spredningsbeslutninger er evolusjonært bevart, kan resultater fra denne analysen gi innsikt i å forbedre regenerative terapier i klinikken.
Introduction
Stamceller er av stor interesse på grunn av deres potensial for bruk i regenerativ medisin 1,2. Mange dyr, spesielt de som er lang levetid, opprettholder stamceller i deres voksne vev. Disse residente stamcellene fungerer for å opprettholde vev homeostase og brukes til reparasjon etter fysisk skade eller sykdom 3,4. De fleste stamceller hos voksne dyr er passiviserende, en relativt sovende tilstand preget av cellesyklusstans og inaktivering av vekstsignalering5. Som svar på ekstrinsiske signaler går stamceller ut av passiviteten, går inn i cellesyklusen og begynner å generere datteravkom som er spesifikk for deres vevstype. For eksempel, for å montere en effektiv immunrespons, induserer antigen-presenterende celler passiv naive T-celler for å komme inn i cellesyklusen og clonally utvide6. Som svar på skjelettmuskulaturskader, kommer muskelsatellitt stamceller inn i cellesyklusen og genererer datter myoblaster for å erstatte skadede myofibrils 5,7. Selv om det er klart at passive stamceller reagerer på ekstrinsiske signaler, forblir arten av den ekstrinsiske signalet i tillegg til mekanismen for cue-indusert stamcelleaktivering. Å få en bedre forståelse av hvordan passive stamceller reagerer på ekstrinsiske signaler og gå inn i cellesyklusen, vil bidra til utvikling av bedre stamcellebehandlinger i klinikken og øke vitenskapelig kunnskap.
I flere tiår har modellorganismer blitt brukt til å avdekke genene og cellesignalveiene som regulerer stamcelleproliferasjon under utvikling og i voksen alder. I Drosophila deler nevrale stamceller (NSC), kjent som nevroblaster (NBs), gjennom hele utviklingen for å generere alle nevroner og glia som til slutt integreres, og danner nevralkretsen som kreves for hjernefunksjon 8,9. I likhet med andre stamceller deler NBs asymmetrisk for å fornye seg selv og i noen tilfeller symmetrisk for å utvide stamcellebassenget. NBs er spesifisert under embryogenese og de fleste går inn passivitet mot slutten, sammenfallende med fallende mors næringsbutikker (figur 1). Etter at embryogenesen er fullført, klekker larver og begynner å mate. Som svar på dyrefôring reaktiverer NBs fra passiviteten og gjenopptar celledelinger 10,11,12,13,14,15,16. Fordi Drosophila CNS er relativt enkel og fordi NBs inn- og utgangs passiviteten på definerte tidspunkter, ved hjelp av Drosophila for å undersøke reguleringen av passiviteten, inngangen og utgangen, viser seg å være ideell.
Figur 1: Relativ spredning av CB NBs (sentrale hjerne neuroblaster, rød) og MB NBs (sopp kroppen nevroblaster, blå) over utviklingstid. På slutten av embryogenesen opphører de fleste NBs (rød linje) spredning og går inn i passivitet. Passivence fortsetter til nyutviklede larver bruker sitt første komplette måltid. Fokuspunktene for denne metoden er betegnet i røde sirkler (1, passiviscens og 2, reaktivering). MB NBs (blå) er en undergruppe av sentrale hjerne-NBer som deler seg kontinuerlig gjennom hele utviklingen (4 per hjernehalvdel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som svar på dyrefôring blir PI3-kinase og TOR vekstsignalveier aktive i NBs og i deres glial og trakeal nisje 10,11,15,16. Når næringsstoffene trekkes tilbake eller når nivåene av PI3-kinase reduseres, unnlater NBs å reaktivere og veksten av glia og luftrør reduseres også 10,11,15,16. Den nåværende modellen hevder at NB-reaktivering er koblet til larvvekst av fettlegemet, som frigjør et systemisk signal som svar på dyrefôring 12,17,18. Dette signalet, som forblir unnvikende, fremmer sannsynligvis uttrykket og frigjøringen av Drosophila insulinlignende peptid (Dilps) i hjernen, noe som fører til nedstrøms aktivering av PI3-kinase i NBs og deres glial og trakeal nisje. For bedre å forstå arten av de systemiske signalene, utviklet vi en metode for å reaktivere passiviserende NBs i kultiverte hjerneutløp. Med denne metoden kan reaktivering av NBs analyse i fravær av hele animalske systemiske signaler. Eksogene faktorer kan leveres på nytt til kulturmediene og NB-reaktivering analysert basert på innlemmelsen av tymidanalogen, EdU. Ved hjelp av denne metoden bestemte vi oss for at eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere passivisere NBs i hjerneeksektiver. Fremtidig arbeid vil være rettet mot å identifisere ytterligere faktorer som, når det legges tilbake, enten positivt eller negativt regulerer NB-passivence i hjerneutløp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila larver samling
MERK: Forbered gjærplaten, druepastaen og Fly-leiligheten før du starter:
- Gjærpasta: Bland i en liten beholder 5 g aktiv tørr gjær med 10 ml vann for å danne en pasta som har konsistensen av peanøttsmør. Dekk gjærpastaen med plastfolie og bruk et gummibånd for å feste det fast til beholderen.
MERK: Fersk gjærpasta vil ekspandere i beholderen og vil sprette av lokket med mindre den er godt festet. Gjærpasta vil vare i flere dager ved romtemperatur (RT). - Drueplater: Følg oppskriften på å lage drueplater (tabell 1). Hvis du bruker plater som er lagret ved 4 °C, må du sørge for å forvarme platene før bruk ved å plassere dem i RT i 1 time.
- Bland vann (750 ml) og agar (18,75 g) i en 4 L kolbe, virvel og autoklav i 20 minutter (flytende syklus).
- Bland druesaften (250 ml) og sukrose (25 g) i en 1 L kolbe med en stor rørestang på en oppvarmet plate (lav varme). Når sukrose er oppløst, slå av varmen, vent til kolben kan berøres før du tilsetter Tegosept (10%, 4 ml) og propionsyre (5 ml). Hold rørestangen på.
- Når autoklaven er fullført, la den avkjøles til kolben kan berøres (~ 60 °C), og bland deretter inn druejuiceblandingen.
- Kombiner alle løsningene i en kolbe og la røre på platen.
- Pipette løsningen i lokk av små petriske retter (35 mm). Pipette omtrent 9 ml per lokk eller til en konveks kuppel er oppnådd.
- VALGFRITT: Flamme dekslene for å kvitte seg med eventuelle bobler.
- Når platene størkner, stabler du drueplatene i en boks med et lufttett lokk og plasserer esken ved 4 °C. Plater kan lagres i opptil 1 måned.
- Fly leilighet: Punch ~ 20 hull i en 6-unse firkantet bunn polypropylen Drosophila flaske ved hjelp av en 18 G nål.
- Overfør voksne fluer (~ 100 OregonR eller hvilken som helst genotype) til en flyleilighet og cap leiligheten med en drue agar plate toppet med en dab gjærpasta. Plasser dab mot midten av platen og fest platen til leiligheten med lab tape.
- Snu beholderen slik at drueagarplaten er på bunnen og legg den i en inkubator på 25 °C i 24 timer (figur 2).
Figur 2: Visuell representasjon av invertert flueflaske (leilighet) med mannlige og kvinnelige Drosophila voksne. Plastflasken har små punkteringer, generert med en 18 G nål, for oksygenutveksling. Munnen på flasken er forseglet med en agar drue juice cap og er invertert og lagret i en 25 °C inkubator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Etter 24 timer, bytt drue agar plate og erstatt den med en ny tallerken toppet med gjærpasta. Bytt raskt de to platene mens du kontinuerlig banker leiligheten lett på benken slik at de voksne fluene ikke unnslipper.
- Undersøk platen med øye og vurder antall embryoer på platen. Drosophila embryoer er avlange og hvite med to strenglignende vedlegg.
- Hvis det er svært få embryoer på platen (mindre enn 100), kast platen (skrap ut agaren i flyavfallet og lagre plastlokket for gjenbruk). I mange tilfeller vil voksne kvinner ikke legge mange embryoer den første natten i en ny leilighet. Hvis dette er tilfelle, gi de voksne fluene ytterligere 24 timer for å akklimatisere.
- Hvis det er et stort antall embryoer på platen (minst 100), hold det, og fjern gjærpastaen forsiktig ved hjelp av en flat bunnspatel.
- Når gjærpastaen er fjernet, bruk et metallplukk for å fjerne alle larver manuelt fra drueplaten under et dissekeringsmikroskop. Når du ser på platen under et dissekerende mikroskop, bør krypende larver observeres så vel som embryoer.
- Fjern alle larver ved å pusse metallplukkingen mot siden av en larve. Larver er klissete og vil holde seg til plukkingen. Når en larve er på plukkingen, kan flere larver lett plukkes opp ved å bruke larven på verktøyet for å feste mer.
MERK: Larver liker å holde seg til hverandre. På dette tidspunktet spiller det ingen rolle om larver blir skadet. Disse larver vil bli kassert. - Etter å ha plukket og fjernet alle larver, plasser platen tilbake i 25 °C inkubatoren. Sørg for å plassere platen i en større beholder som kan forsegles. Legg våte papirhåndklær i bunnen av den større beholderen for å holde dem i fuktighet.
- Etter 30-60 min, ta platen tilbake til dissekering mikroskopet og nå, forsiktig plukke ~ 20-25 larver fra samme drue agar plate for å sikre at de plukkede larver er fersk klekket innen et 30-60 min vindu av tid.
- Senk spissen av verktøyet med de 20-25 nyutviklede larver i en Petri-tallerken (60 mm) fylt med 1-2 ml 1x fosfat bufret saltvann (PBS) i 2 minutter.
- Etter 2 min tipper du parabolen i en vinkel for å samle væsken nederst. Bruk en liten pensel, pensle larvene ut av væsken opp på bunnen av Petri-parabolen.
- Samle alle larver på penselen og overfør larver til en ny Petri-tallerken (60 mm) som inneholder 1-2 ml 70% etanol. Gjenta trinn 1,15 for å samle larver med pensel og overfør dem til en ny Petri-tallerken med 1-2 ml 1x PBS.
2. Kulturmedier og verktøyforberedelse
- Spray benken og arbeidsområdet med 70% etanol og la tørke.
- Spray disseksjonsverktøyene, tangene og to glassurretter, med 70% etanol og la dem tørke på benken.
- Lag de supplerte Schneiders medier (SSM, tabell 2) og legg det på is.
- Pipette 1 ml SSM i hver av glassklokkerettene.
- Bruk en mikropipette med en steril spiss, overfør de nyutviklede larver fra platen av PBS til SSM i den første glassklokkefatet. Bruk en mikropipette med en steril spiss, overfør de nyutviklede larver til SSM i den andre glassklokkeretten.
3. Disseksjoner og hjernekulturer
- Når larvene er i den andre glassklokkeretten med SSM, dissekerer hjernen ut av larvene ved hjelp av tang og et dissekerende mikroskop. Juster forstørrelsen etter behov.
- Bruk en tang til å ta tak i munnkrokene, og med den andre, ta forsiktig tak i kroppen halvveis ned og trekk i motsatt retning (figur 3) for å dele larven i to stykker.
MERK: Hjernen vil være plassert rett bak munnkrokene. Vær oppmerksom på at det kan være andre vev rundt hjernen. Vær veldig forsiktig når du fjerner disse vevene, da det kan føre til skade på hjernen
Figur 3: Drosophila larver i en glassklokkerett med SSM. Tang er riktig plassert for disseksjon. Plasseringen av larvalhjernen (mørkegrå) er bakre til munnkrokene (svart), og begge vises inne i larven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Når 15-20 hjerner er dissekert, tilsett 1 ml SSM i en brønn av et sterilt 12-brønns kulturbrett. Overfør de ny dissekerte hjernene til SSM ved hjelp av en mikropipette og en steril spiss (figur 4A).
- Plasser hjernen i SSM-mediet i 12-brønns kulturbrettet i en inkubator ved 25 °C i 24 timer (figur 4A).
Figur 4: Hjernekultur og immunstaining. (A) Hele hjerner i en 12-brønns kulturrett som inneholder 1 ml SSM. Kulturretten plasseres deretter i en 25 °C inkubator i 24 t. (B) 72-brønns minibrett som holder hjernens utvisning under immunoppfatning. Hjerner vaskes og løsninger overføres ved hjelp av en P20 mikropipette satt til 10 μL. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Spredningsanalyse, hjernefiksering og antistofffarging
- Neste dag lager du 1 ml EdU SSM-løsning. Pipette 10 μL av en 10 mM lager av 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) med 990 μL SSM (endelig EdU konsentrasjon tilsvarer 0,1 mM) i et sterilt mikrocentrifuge rør og blanding. Etter at inkubasjonen på 24 timer er fullført, pipetterer du 1 ml EdU SSM i en brønn på den sterile 12-brønns kulturbrettet.
- Overfør hjernen ved hjelp av en mikropipette med en steril spiss fra brønnen som bare inneholder SSM til den nye brønnen som inneholder EdU SSM-løsningen. Inkuber i 1 time ved 25 °C.
- Deretter overfører du den EdU-merkede hjernen til en annen brønn i samme kulturbrett som inneholder 1 ml fikseringsmiddel (4% paraformaldehyd, se tabell 3 for oppskrift) i 20 minutter.
FORSIKTIG: Paraformaldehyd er en biologisk fare og må kastes på riktig måte. - Etter fiksering, overfør hjernen raskt til brønnene i en 72-brønns minibrett ved hjelp av en mikropipette. Hver brønn kan romme 10 hjerner og 10-15 μL væske (figur 4B). Når hjernene er overført til minibrettet (ikke mer enn 10 hjerner per brønn), fjern løsningen og skyll hjernen 3 ganger i 10 μL 1x PBT (fosfatbuffer, pH 7,4 som inneholder 0,1% Triton-X 100).
MERK: Skylling betyr pipettering 10 μL 1x PBT på hjernen, fjerning og gjentakelse 3 ganger. - Deretter vasker du hjernen 3 ganger i 10 minutter hver, igjen i 10 μL 1x PBT. Forsikre deg om at hjernene er dekket med litt væske til enhver tid.
- Etter at vaskene er fullført, pipette 10 μL blokkeringsløsning (1x PBT med 10% normalt geitserum) på hjernen. Dekk skuffen og forsegle den ved hjelp av en stripe med parafilm rundt kanten.
- Når den er forseglet, plasserer du minibrettet i en forseglet boks med våte håndklær for å gi et fuktig miljø for å forhindre fordampning. Plasser esken som inneholder brettet ved 4 °C over natten.
- Neste dag lager du en primær antistoffløsning.
MERK: I denne protokollen ble kanin anti-skribleri brukt til å merke cellemembraner og rotte anti-deadpan for å merke nevroblaster, selv om en rekke andre primære antistoffer kunne brukes.- For å lage den primære antistoffløsningen, gjør du først fortynning av primære antistoffer i blokkeringsløsningen. For eksempel brukes kanin anti-skribleri i en endelig konsentrasjon på 1:1000. Derfor fortynn først kaninen anti-skrible antistoff ved 1:100 (1 μL antistoff pluss 99 μL blokkeringsløsning). Rotte-deadpan brukes ved en endelig konsentrasjon på 1:100. Derfor fortynn først rotte-deadpan-antistoffet ved 1:10 (1 μL antistoff pluss 9 μL blokkeringsløsning).
MERK: Disse fortynningene kan lagres på lang sikt ved 4 °C hvis natriumazid (0,05 %) også tilsettes for å hemme bakterievekst. - Deretter teller antall brønner som inneholder hjerner. Antall brønner bestemmer volumet av primær antistoffløsning å lage. For eksempel, hvis det er 2 brønner med hjerner, lag 20 μL primær antistoffløsning (for 10 brønner, 100 μL, etc.). For å lage en 20 μL primær antistoffløsning, tilsett 2 μL av hver primære antistofffortynning og 16 μL av blokkeringsløsningen.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av hvert av de primære antistoffene er henholdsvis 1:1000 og 1:100. Kort sagt, gjør den første fortynning av primære antistoffer i en konsentrasjon slik at den andre fortynning alltid er 1:10 for å komme til de respektive endelige konsentrasjonene. I dette tilfellet, 1:1000 for kanin anti-skribleri og 1:100 for rotte anti-deadpan.
- For å lage den primære antistoffløsningen, gjør du først fortynning av primære antistoffer i blokkeringsløsningen. For eksempel brukes kanin anti-skribleri i en endelig konsentrasjon på 1:1000. Derfor fortynn først kaninen anti-skrible antistoff ved 1:100 (1 μL antistoff pluss 99 μL blokkeringsløsning). Rotte-deadpan brukes ved en endelig konsentrasjon på 1:100. Derfor fortynn først rotte-deadpan-antistoffet ved 1:10 (1 μL antistoff pluss 9 μL blokkeringsløsning).
- Fjern blokkeringsløsningen med mikropipetten satt til 10 μL og pipette 10 μL primær antistoffløsning i hver brønn.
- Dekk og forsegle brettet ved hjelp av parafilm og legg det tilbake i den forseglede boksen med våte håndklær. Inkuber over natten ved 4 °C.
MERK: Risting er ikke nødvendig og frarådes sterkt. Antistoffer vil trenge inn i hjernen uten å riste eller blande. - Neste dag, fjern den primære antistoffløsningen ved hjelp av en mikropipette og skyll hjernen 3 ganger med 10 μL 1x PBT. Deretter vasker du hjernen 4 ganger med 10 μL 1x PBT i 10 minutter hver. I løpet av de 10 min vasker, forberede den sekundære antistoffoppløsningen.
- For å lage den sekundære antistoffløsningen, velg sekundære antistoffer som gjenkjenner de primære antistoffene. I denne protokollen ble geit anti-kanin Alexa Fluor 488 og geit anti-rotte Alexa 555 brukt.
- Pipette 1 μL av hvert av de sekundære antistoffene i et mikrocentrifugerør med 298 μL av blokkeringsløsningen for å gjøre den endelige konsentrasjonen 1:300 for hvert sekundære antistoff.
- Etter de siste 10 min vask, fjern 1x PBT og pipette 10 μL av sekundær antistoffoppløsningen i hver brønn. Forsegle brettet med parafilm og legg det tilbake i esken med fuktige håndklær. Inkuber over natten ved 4 °C.
MERK: Ikke bekymre deg for å fjerne hver eneste μL i brønnene mellom skylling, vask eller når du tilsetter primære og sekundære antistoffløsninger. Hjernene vil alltid forbli nedsenket i noen få μL væske, noe som er helt greit. - Neste dag, fjern den sekundære antistoffløsningen ved hjelp av en mikropipette og skyll hjernen 3 ganger med 10 μL hver av 1x PBT. Deretter vasker du hjernen 4 ganger med 10 μL hver av 1x PBT i 10 minutter hver.
- I løpet av de 10 minvaskene, klargjør EdU-reaksjonsblandingen for å oppdage EdU-inkorporering. Forbered EdU-reaksjonsblandingen i henhold til produsentens retningslinjer.
- Etter den endelige vasken, fjern 1x PBT og pipette 10 μL av EdU-reaksjonsblandingen i hver brønn med hjerner. Forsegle mikrowellplaten med parafilm og dekk med aluminiumsfolie. La platen stå på benken i 30 min.
- Etter 30 min, skyll hjernen 3 ganger med 10 μL hver av 1x PBT og vask hjernen 3 ganger med 10 μL hver av 1x PBT i 5 min hver.
- Etter siste vask, fjern 1x PBT og pipette 10 μL av en glyserolbasert monteringsmedieløsning. Forsegle platen og plasser den ved 4 °C over natten.
5. Montering og avbildning av hjernen
- Neste dag forbereder du mikroskopskliser (25 mm x 75 mm x 1 mm): Lim (f.eks. superlim) en 22 mm x 22 mm x 1 mm firkantet dekselglass til hver ende av mikroskopet for å skape en "bro" over hvilken de større 22 mm x 50 mm x 1 mm dekslene vil bli plassert for å lage et mellomrom mellom lysbildet og de større dekslene (figur 5A). Dette rommet vil tillate hjernen akkurat nok bevegelse til å være riktig orientert mens du forhindrer at den blir knust.
Figur 5: Skjematisk som viser mikroskopskred, orientering og celletyper i larvalhjernen. (A) Visuell representasjon av mikroskopskred som en larvalhjerne er montert på og er klar til å bli avbildet. (B) En retningslinje er også vist å brukes til vevsorientering. (C) Mikroskopet glir klart for avbildning på et konfokalt mikroskop. (D) Tegneserie som viser noen av celletypene i larvalhjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Etter liming av 22 mm x 22 mm x 1 mm dekselglass til mikroskopet, pipette 9,3 μL av den glyserolbaserte monteringsmedieløsningen som inneholder en hjerne fra en brønn på mikrowellplaten og plasser den på midten av lysbildet (figur 5A).
MERK: Larvalhjernen kan holde seg til pipettespissen, så vær forsiktig. For å unngå vedheft, begynn med å aspirere antifaden og deretter aspirere den ene hjernen mot slutten av 9,3 μL-volumet. - Når hjernen er på gliden, plasserer du forsiktig 22 mm x 50 mm x 1 mm dekslene på toppen. Plasser hjernen som vist i figur 5B. Beveg dekslene forsiktig rundt for å orientere hjernen. Eksemplet er da klart for avbildning.
- Bruk et konfokalt mikroskop utstyrt med høy forstørrelse og et høyt numerisk blendermål (figur 5C) for å skaffe de beste bildene. For eksempel: 60x eller 63x, 1.4 NA olje-nedsenking linse.
- Bilde hjernene med dorsal overflaten nærmest coverlip (og objektiv). Skaff Z-stablene gjennom hele hjernehalvøya som starter ved ventraloverflaten (lengst borte fra målet) med 1 μm intervaller eller Z-trinnstørrelse.
MERK: Lasere som brukes avhenger av sekundære antistoffer. I denne protokollen var laserlinjene som ble brukt 488 nm for å oppdage Skrible flekker, 555 nm for å oppdage Deadpan, og 633 nm for å oppdage EdU.
- Bilde hjernene med dorsal overflaten nærmest coverlip (og objektiv). Skaff Z-stablene gjennom hele hjernehalvøya som starter ved ventraloverflaten (lengst borte fra målet) med 1 μm intervaller eller Z-trinnstørrelse.
6. Dataanalyse
- Bruk Fiji åpen kildekode-programvare for å analysere hjernehalvdeler og bruke Fiji-celleteller-plugin for å telle cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyutviklede OregonR villtype hjerner ble dissekert og dyrket i 24 timer i supplerte Schneiders medier (SSM) med insulin. Vev ble fikset og farget i henhold til protokollen. Primære antistoffer generert mot Deadpan (Dpn) for å oppdage NBs og Scribble for å merke cellemembraner ble brukt. Thymidine analog 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (Edu) ble lagt til for å oppdage S-fase oppføring og NB reaktivering. Vi fant stor størrelse Edu positiv og Dpn positive NBs etter 24 h i kultur (Figur 6A-C). Deretter ble nyutviklede OregonR wild-type hjerner dyrket i 24 timer i supplerte Schneiders media uten insulin. Etter 24 timer i kultur fant vi ingen store Edu-positive og Dpn positive NBs annet enn de fire sopplegemet NBs og en ventrolateral NB (Figur 6D-F). Soppkroppen og de ventrolaterale nevroblaster er en undergruppe av de sentrale hjerne neuroblaster som deler seg kontinuerlig under embryonal til larvalovergang. Vi konkluderer med at eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere nevroblaster fra passiviteten i hjernens eksplanter dyrket i Schneiders medier.
Under konfektavbildning ble noen hjernehalvdeler med skade av og til observert. Skaden vi fant besto av små til store hull i det utplantede hjernevevet (figur 6G,H). Disse vevene ble utelukket fra analysen. I tillegg til 24 h-tidspunktet ble hjernen også vellykket dyrket i 48 timer (data ikke vist). Etter 48 timer i kultur fant vi en ytterligere økning i antall Dpn positive EdU positive CB NBs og en økning i antall hjerner med vevsskade. Dette antyder at kultivering av hjerner på lang sikt sannsynligvis er mulig; Det må imidlertid utvises stor forsiktighet for å unngå vevsskade.
Figur 6: Konfokal avbildning. (A-C) Eksogent insulin er tilstrekkelig til å reaktivere passiviserende NBs. (A) En maksimal intensitetsprojeksjon av en hjernehalvdel som viser Deadpan (Dpn) og Edu positive NBs etter 24 timers kultur i nærvær av insulin. (B) Et enkelt Z-stykkebilde av samme hjernehalvdel med Scribble (Scrib) immundempende markeringscellemembraner. (C) Høy forstørrelse av NB i innfelt i panel B. Enkanals gråtonebilder med farge slås sammen nederst til høyre. (D-F) NBs forblir passiv i fravær av eksogent insulin. (D) En maksimal intensitetsprojeksjon av en hjernehalvdel som viser Dpn og Edu positive NBs etter 24 timers kultur i fravær av insulin. (E) En enkelt Z-stabel med samme hjernehalvdel med Scrib-immunisering. (F) Høy forstørrelse av NB i innfelt i panelet E. Enkanals gråtonebilder med farge slås sammen nederst til høyre. Pilspiss angir en av de 4 MB NB-ene, som deler seg kontinuerlig og ikke går inn og ut av passiviteten (se figur 1). (G,H) Eksempler på skadede hjerneeksempler, ikke brukt i analysen. (G) En enkelt Z-skive av en hjernehalvdel med store hull i vevet. (H) En enkelt Z-skive av en hjernehalvdel viser små hull i vevet. Skala bar: 10 μm. Den hvite stiplede linjen angir midtlinjen. Fremre er oppe, og bakre er nede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ingrediens/beløp | 1 L (~125 druetallerkener) |
| Druejuice | 250 ml |
| Sukrose | 25 g |
| Vann | 750 ml |
| Bacto Agar | 18,75 g |
| Tegosept (10%) | 4 ml |
| Propionsyre | 5 ml |
Tabell 1: Oppskrift på å lage drueplater. Følg trinnene som er beskrevet i avsnitt 1.2.
| Ingrediens (startkonsentrasjon) | For å lage 5 ml | Endelig konsentrasjon |
| Schneiders Drosophila-medier | 3,89 ml | |
| Fetal bovin serum (100%) | 500 μL | 10% |
| Glutamin (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Penicillin (5000 enheter/ml), Streptomycin (50 000 μg/ml) | 100 μL | 1000 U/ml penn, 1 mg/ml strep |
| Insulin (10 mg/ml) | 10 μL | 0,02 mg/ml |
| glutathione (50 mg/ml) | 5 μL | 0,05 mg/ml |
| I en steril hette, ved hjelp av steril teknikk, tilsett alle ingrediensene sammen i et 14 ml konisk rør. Plasser den på is til bruk. | ||
Tabell 2: Oppskrift på å lage supplerte Schneiders medier (SSM). Tabellen viser volumet av alle ingrediensene som kreves for å forberede 5 ml SSM.
| Oppskrift på å lage fikseringsmiddel | ||
| Ingrediens (startkonsentrasjon) | For å lage 40 ml | Endelig konsentrasjon |
| EM klasse formaldehyd 16% | 10 ml | 4% |
| PEM buffer pH 7.0 | 29,96 ml | |
| Triton X-100 | 40 ml | 0.10% |
| Bland alle ingrediensene sammen. Aliquot 1 ml i mikrocentrifuge rør og lagre ved -20 °C. Ikke frys aliquots på nytt etter opptining. | ||
| Oppskrift på PEM-buffer | ||
| Ingrediens (startkonsentrasjon) | For å lage 100 ml | Endelig konsentrasjon |
| RØR pH 6,8 (500 mM) | 20 ml | 100 mM |
| EGTA (500 mM) | 2 ml | 10 mM |
| MgSO4 (1 M) | 100 ml | 1 mM |
| Vann | 77,9 ml | |
Tabell 3: Oppskrift på å lage fixative og PEM buffer. Tabellen viser kjemikaliene og deres respektive konsentrasjoner for å forberede fixative og PEM buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her for å dyrke hjerneutløp kan utføres i de fleste laboratoriemiljøer. Verktøyene som kreves, samt prosedyren og datainnsamlingen, er enkle og enkle. Med denne metoden kan man teste en rekke hypoteser, inkludert de som er relatert til cellesignalerende kaskader og ekstrinsiske faktorer som regulerer NB-reaktivering og spredning. Her, ved hjelp av wild-type OregonR dyr, fant vi ut at eksogent insulin var tilstrekkelig til å reaktivere NBs fra passiviteten uavhengig av andre dyrespesifikke systemiske signaler. Ved hjelp av GAL4/UAS-systemet kan man også slå ned eller overekspressere insulinbanekomponenter på en celletypespesifikk måte for bedre å forstå rollen som PI3-kinase-signalering i NB-reaktivering. I tillegg til å bruke genetikk, kan komponentene i media også manipuleres for å teste ekstrinsiske signaler eller signaler som fremmer NB-reaktivering og spredning ytterligere. For eksempel kan man teste hypotesen om at tilsetningen av steroidhormonet ecdysone ville øke prosentandelen av NB-reaktivering og spredning i kulturen.
Selv om denne metoden er grei, opplevde vi flere tekniske problemer tidlig. Den første tekniske vanskeligheten var skade på dissekerte, uløste hjerner under medieforandringer. Vi fant at overføring av hjerner til en ny brønn av kulturretten i stedet for å endre media i brønnen resulterte i mindre vevsskader fordi hull i hjernen oppsto da media ble fjernet fra brønnen og utviskene satt fast på bunnen av brønnen. For å løse dette problemet ble hjernen overført i løsning ved hjelp av en pipette og forble derfor kontinuerlig nedsenket. Et annet teknisk aspekt som ble endret var sterilisering av dissekeringsverktøy. En maske og hansker ble brukt til enhver tid. Etanol (70%) ble brukt til å sprøyte disseksjonsverktøyene og disseksjonsbrettene. Dette gjorde det mulig å holde bakteriebelastningen på et minimum. Trinnene før fiksering bør utføres i et miljø så sterilt som mulig, helst en steril hette, og med presise og ekstremt milde bevegelser. Den siste vanskeligheten vi opplevde var at hjernen var klissete. Ofte ville hjernene holde seg til pipettespissens indre vegger da vi forsøkte å plassere dem på mikroskopet for avbildning. For å løse dette problemet endret vi hjernens overføringsmetode mellom microwell mini-brettet til mikroskopet lysbilde som beskrevet ovenfor, fylle pipettespissen med monteringsmedier før vi aspirerer hjernen inn i pipettespissen. Denne metoden smurte pipettespissen med det glyserolbaserte monteringsmediet og reduserte stikket kraftig.
Metoder for å dyrke Drosophila hjerneutløp har blitt publisert tidligere 12,19,20,21,22. En metode publisert av Prithviraj et al. rapporterer kultivering av sen larval og tidlig pupal hjerne. I dette tilfellet ble steroidhormonet ecdysone lagt til kulturmediene og hjernene ble opprettholdt i kultur i opptil 10 timer20. Bobstock og medarbeidere rapporterer kultivering av hjerner fra sen L1/tidlig L2 dyr og lever bildebehandling NBs i flere timer i ventral nerve ledning. De rapporterer også vanskeligheter med å håndtere hjerner fra unge larver21. Siller et al. rapporterer dyrking av larvalhjerner og bruk av levende celleavbildning for å analysee spindeldynamikk under nevroblåsedelinger i midten til slutten av larvalstadiene19. Alle metoder publisert tidligere fokuserer på tidspunkter etter det nyutviklede larvestadiet før dyrefôring, med ett unntak. I Britton et al., det er rapportert at NBs reaktivere fra passiviteten når hjernen explants er co-kulturer med fett kroppen12. Overraskende nok rapporterer Britton et al. også at eksogent insulin ikke var tilstrekkelig til å reaktivere passiviserende NBs, i motsetning til det som rapporteres her. Derfor legger grunnlaget for ideen om at en FBDS er nødvendig for NB-reaktivering. På tidspunktet for Britton-papiret var NB-spesifikke molekylære markører ennå ikke tilgjengelige, og det er klart at hjernemorfologi er kompromittert etter 3 dager i kulturen. Her tilbyr vi en enkel metode for å reaktivere NBs i hjerneekster ved ganske enkelt å legge til eksogent insulin til kulturmediene. Et viktig notat er at mengden insulin som legges til kulturen langt overstiger fysiologiske forhold. Høye nivåer av insulin kan føre til høyere nivåer av PI3-kinase pathway aktivitet i hjernecelle typer in vitro sammenlignet med in vivo forhold.
Fordi kulturmediene lett kan manipuleres ved å legge til forskjellige faktorer, kan denne teknikken brukes til å adressere fremtidige hypoteser om ekstrinsisk signalering og NB-passivisering, inngang og utgang. Denne metoden kan også brukes til storskala screening, enten RNAi eller narkotikabasert. For screening i stor skala ville det være best å bruke transgene dyr som uttrykker fluorescerende reportere. Dette kan tillate en å omgå antistofffarging, noe som er tidkrevende. Generelt, etter praksis, kan man sette opp 10 kulturer på 3 hjerner hver på 30 minutter. Om en uke kan det være rimelig å screene 150 forskjellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkjenner LSAMP Bridges to Doctorate program for finansiering (CNK) samt NIH/NIGMS (R01-GM120421 og R35-GM141886). Vi er takknemlige til Dr. Conor Sipe for figur 1. Vi takker også alle Siegrist labmedlemmer for deres fortsatte støtte og mentorskap. Vi takker spesielt Chhavi Sood og Gary Teeters for deres nøye lesning av manuskriptet og for å gi kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
