Summary
En metod för att återaktivera vilande neurala stamceller i odlade Drosophila hjärnplanter har etablerats. Med hjälp av denna metod kan systemiska signalers roll kopplas bort från vävnadsinboende signaler vid reglering av neural stamcells lugn, inträde och utgång.
Abstract
Neurala stamceller (NSC) har förmågan att föröka sig, differentiera, genomgå apoptos och till och med gå in och ut ur lugn. Många av dessa processer styrs av det komplexa samspelet mellan NSC:s inneboende genetiska program och NSC:s yttre faktorer, lokala och systemiska. I den genetiska modellorganismen, Drosophila melanogaster, NSC, känd som neuroblaster (NG), växlar från lugn till spridning under embryonal till larvövergång. Under denna tid kommer larver ut ur sina äggskal och börjar krypa och söka efter näringsämnen i kosten. Som svar på djurfoder producerar fettkroppen, ett endokrint organ med lipidlagringskapacitet, en signal som frigörs systemiskt i den cirkulerande hemolymfen. Som svar på den feta kroppshärledda signalen (FBDS) produceras drosophila insulinliknande peptider (Dilps) och frigörs från hjärnans neurosekretoriska neuroner och glia, vilket leder till nedströms aktivering av PI3-kinas tillväxtsignalering i NBs och deras glial- och trakealnisch. Även om detta är den nuvarande modellen för hur NBs byter från lugn till spridning, är FBDS- yttre cue fortfarande svårfångad. För att bättre förstå hur NB yttre systemiska signaler reglerar utträde från lugn, utvecklades en metod för att odla tidiga larvhjärn in vitro före djurfoder. Med denna metod kan exogena faktorer tillföras kulturmedierna och NB-utgång från lugn analyseras. Vi fann att exogent insulin är tillräckligt för att återaktivera NBs från lugn i hela hjärnans explanter. Eftersom den här metoden är väl lämpad för storskaliga skärmar strävar vi efter att identifiera ytterligare yttre signaler som reglerar NB-lugn kontra spridningsbeslut. Eftersom generna och vägarna som reglerar NSC-spridningsbeslut är evolutionärt bevarade, kan resultaten från denna analys ge insikt i att förbättra regenerativa terapier i kliniken.
Introduction
Stamceller är av stort intresse på grund av deras potential för användning inom regenerativ medicin 1,2. Många djur, särskilt de som är långlivade, upprätthåller stamceller i sina vuxna vävnader. Dessa bosatta stamceller fungerar för att upprätthålla vävnadshomeostas och används för reparation efter fysisk skada eller sjukdom 3,4. De flesta stamceller hos vuxna djur är vilande, ett relativt vilande tillstånd som kännetecknas av cellcykelstopp och inaktivering av tillväxtsignalering5. Som svar på yttre signaler lämnar stamceller från lugn, går in i cellcykeln och börjar generera dotteravkomma som är specifik för deras vävnadstyp. Till exempel, för att montera ett effektivt immunsvar, inducerar antigenpresenterande celler vilande naiva T-celler att komma in i cellcykeln och klonalt expandera6. Som svar på skelettmuskelskador kommer muskelsatellitstamceller in i cellcykeln och genererar dottermycoblaster för att ersätta skadade myofibriller 5,7. Även om det är uppenbart att vilande stamceller svarar på yttre signaler, är arten av den yttre signalen i många fall fortfarande oklar liksom mekanismen för cue-inducerad stamcellsaktivering. Att få en bättre förståelse för hur vilande stamceller svarar på yttre signaler och går in i cellcykeln kommer att bidra till utvecklingen av bättre stamcellsterapier i kliniken och öka den vetenskapliga kunskapen.
I årtionden har modellorganismer använts för att avslöja de gener och cellsignalvägar som reglerar stamcellsproliferation under utveckling och i vuxen ålder. I Drosophila delar neurala stamceller (NSC), kända som neuroblaster (NBs), under hela utvecklingen för att generera alla neuroner och glia som i slutändan integreras och bildar den neurala kretsen som krävs för hjärnfunktion 8,9. Liksom andra stamceller delar sig NBs asymmetriskt för att självförnya och i vissa fall symmetriskt expandera stamcellspoolen. CB specificeras under embryogenesen och de flesta går in i lugn mot slutet, samtidigt som de minskar moderns näringslager (figur 1). När embryogenesen är klar kläcker larverna och börjar mata. Som svar på utfodring av djur återaktiveras NBs från lugn och återupptar celldelningar 10,11,12,13,14,15,16. Eftersom Drosophila CNS är relativt enkelt och eftersom NBs går in och ut ur lugn vid definierade tidpunkter, använder Drosophila för att undersöka regleringen av lugn, inresa och utgång, visar sig vara idealisk.
Figur 1: Relativ proliferation av CB NBs (centrala hjärnneuroblaster, röda) och MB NBs (svampkroppsneuroblaster, blå) över utvecklingstiden. I slutet av embryogenesen upphör de flesta NBs (röda linjen) proliferation och går in i lugn. Quiescence fortsätter tills nykläckta larver konsumerar sin första kompletta måltid. Fokuspunkterna för denna metod betecknas i röda cirklar (1, lugn och 2, reaktivering). MB NBs (blå) är en delmängd av centrala hjärnans NABs som delar sig kontinuerligt under hela utvecklingen (4 per hjärnhalvklot). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som svar på djurfoder blir PI3-kinas och TOR tillväxtsignalvägar aktiva i NBs och i deras glial- och trakealnisch 10,11,15,16. När näringsämnen i kosten dras tillbaka eller när nivåerna av PI3-kinas reduceras, misslyckas NBs med att återaktivera och tillväxten av glia och luftstrupen minskar också 10,11,15,16. Den nuvarande modellen hävdar att NB-reaktivering är kopplad till larvtillväxt av fettkroppen, vilket frigör en systemisk signal som svar på djurfoder 12,17,18. Denna signal, som förblir svårfångad, främjar sannolikt uttrycket och frisättningen av Drosophila insulinliknande peptid (Dilps) i hjärnan, vilket leder till nedströms aktivering av PI3-kinas i NBs och deras glial och trakeal nisch. För att bättre förstå arten av de systemiska signalerna utvecklade vi en metod för att återaktivera vilande NA i odlade hjärnutplantningar. Med denna metod kan reaktivering av NBs analyseras i frånvaro av systemiska signaler för hela djur. Exogena faktorer kan återföras till odlingsmediet och NB-reaktivering analyseras baserat på införlivandet av tymidinanalogen, EdU. Med hjälp av denna metod bestämde vi att exogent insulin är tillräckligt för att återaktivera vilande NK i hjärnutplanteringar. Framtida arbete kommer att syfta till att identifiera ytterligare faktorer som, när de läggs tillbaka, antingen positivt eller negativt reglerar NB-lugn i hjärnutplantningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila larver samling
OBS: Förbered jästplattan, druvpasta och Fly-lägenheten innan du börjar:
- Jästpasta: Blanda 5 g aktiv torrjäst i en liten behållare med 10 ml vatten för att bilda en pasta som har konsistensen av jordnötssmör. Täck jästpastan med plastfolie och använd ett gummiband för att fästa den ordentligt i behållaren.
OBS: Färsk jästpasta kommer att expandera i behållaren och kommer att dyka upp från locket om den inte är ordentligt fastsatt. Jästpasta kommer att pågå i flera dagar vid rumstemperatur (RT). - Druvplattor: Följ receptet för att göra druvplattor (tabell 1). Om du använder plattor som förvaras vid 4 ° C, se till att förvärma plattorna före användning genom att placera dem vid RT i 1 timme.
- Blanda vatten (750 ml) och agar (18,75 g) i en 4 L kolv, virvla och autoklav i 20 min (vätskecykel).
- Blanda druvsaften (250 ml) och sackaros (25 g) i en 1 L kolv med en stor omrörningsstång på en uppvärmd platta (låg värme). När sackarosen är upplöst, stäng av värmen, vänta tills kolven kan röras innan du tillsätter Tegosept (10%, 4 ml) och propionsyra (5 ml). Håll omrörningsfältet på.
- När autoklavningen är klar, låt den svalna tills kolven kan vidröras (~ 60 ° C) och blanda sedan i druvsaftblandningen.
- Kombinera alla lösningar i en kolv och låt röra om på tallriken.
- Pipettera lösningen i lock av små petriskålar (35 mm). Pipett ungefär 9 ml per lock eller tills en konvex kupol erhålls.
- VALFRITT: Flamma locken för att bli av med eventuella bubblor.
- När plattorna stelnar, stapla druvplattorna i en låda med ett lufttätt lock och placera lådan vid 4 °C. Plattor kan förvaras i upp till 1 månad.
- Fly condo: Stans ~ 20 hål i en 6-ounce kvadratisk botten polypropen Drosophila flaska med en 18 G nål.
- Överför vuxna flugor (~ 100 OregonR eller någon genotyp) till en fluglägenhet och täck lägenheten med en druvagarplatta toppad med en klick jästpasta. Placera dab mot mitten av plattan och fäst plattan på lägenheten med labbtejp.
- Invertera behållaren så att druvagarplattan ligger på botten och placera den i en 25 °C inkubator i 24 timmar (figur 2).
Figur 2: Visuell representation av inverterad flugflaska (lägenhet) med manliga och kvinnliga Drosophila vuxna. Plastflaskan har små punkteringar, genererade med en 18 G nål, för syreutbyte. Flaskans mun förseglas med ett agardruvsaftslock och inverteras och förvaras i en 25 °C inkubator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Efter 24 timmar byter du druvagarplattan och ersätter den med en ny tallrik toppad med jästpasta. Byt snabbt de två plattorna medan du kontinuerligt knackar lätt på lägenheten på bänken så att de vuxna flugorna inte flyr.
- Undersök plattan för ögat och bedöm antalet embryon på plattan. Drosophila embryon är avlånga och vita med två strängliknande bilagor.
- Om det finns mycket få embryon på plattan (mindre än 100), kassera plattan (skrapa ut agaren i flugskräpet och spara plastlocket för återanvändning). I många fall kommer vuxna kvinnor inte att lägga många embryon den första natten i en ny lägenhet. Om så är fallet, ge de vuxna flugorna ytterligare 24 timmar för att acklimatisera.
- Om det finns ett stort antal embryon på plattan (minst 100), behåll den och ta försiktigt bort jästpastan med en platt bottenspatel.
- När jästpastan har tagits bort, använd en metallplockning för att manuellt ta bort alla larver från druvplattan under ett dissekerande mikroskop. När man tittar på plattan under ett dissekerande mikroskop bör krypande larver observeras såväl som embryon.
- Ta bort alla larver genom att borsta metallplockningen mot sidan av en larva. Larver är klibbiga och kommer att hålla fast vid plockningen. När en larv är på plockningen kan ytterligare larver enkelt plockas upp genom att använda larven på verktyget för att fästa mer.
OBS: Larver gillar att hålla sig till varandra. Vid denna tidpunkt spelar det ingen roll om larver skadas. Dessa larver kommer att kasseras. - Efter att ha plockat och tagit bort alla larver, placera plattan tillbaka i 25 ° C inkubatorn. Se till att placera plattan i en större behållare som kan förseglas. Placera våta pappershanddukar i botten av den större behållaren för att hålla i fukt.
- Efter 30-60 min, ta tillbaka plattan till dissekeringsmikroskopet och plocka nu försiktigt ~ 20-25 larver från samma druvagarplatta för att säkerställa att de plockade larverna är nykläckta inom ett 30-60 minuters tidsfönster.
- Sänk ner verktygets spets med de 20-25 nykläckta larverna i en petriskål (60 mm) fylld med 1-2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 2 min.
- Efter 2 minuter, tippa skålen i en vinkel för att poola vätskan i botten. Pensla larverna ur vätskan med en liten pensel upp i botten av petriskålen.
- Samla alla larver på penseln och överför larverna till en ny petriskål (60 mm) som innehåller 1-2 ml 70% etanol. Upprepa steg 1.15 för att samla larver med en pensel och överföra dem till en ny petriskål med 1-2 ml 1x PBS.
2. Kulturmedier och verktygsberedning
- Spraya bänken och arbetsområdet med 70% etanol och låt torka.
- Spraya dissektionsverktygen, tångarna och två glasklockor med 70% etanol och låt dem torka på bänken.
- Gör det kompletterade Schneiders media (SSM, tabell 2) och lägg det på is.
- Pipettera 1 ml SSM i var och en av glasklockskålarna.
- Använd en mikropipett med en steril spets och överför de nykläckta larverna från PBS-plattan till SSM i den första glasklockan. Använd en mikropipett med en steril spets och överför de nykläckta larverna till SSM i den andra glasklockan.
3. Dissektioner och hjärnkulturer
- När larverna är i den andra glasklockskålen med SSM, dissekera hjärnorna ur larverna med hjälp av pincett och ett dissekerande mikroskop. Justera förstoringen efter behov.
- Använd en tång för att ta tag i munkrokarna och med den andra, ta försiktigt tag i kroppen halvvägs ner och dra i motsatt riktning (figur 3) för att dela larven i två delar.
OBS: Hjärnan kommer att ligga precis bakom munkrokarna. Observera att det kan finnas andra vävnader som omger hjärnan. Var mycket försiktig när du tar bort dessa vävnader eftersom det kan leda till att hjärnan skadas
Figur 3: Drosophila larver i en glasklocka med SSM. Tången är korrekt placerad för dissektion. Larvhjärnans placering (mörkgrå) är bakom munkrokarna (svart), och båda visas inuti larven. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- När 15-20 hjärnor har dissekerats, tillsätt 1 ml SSM i en brunn i en steril 12-brunns odlingsbricka. Överför de nydissekerade hjärnorna till SSM med hjälp av en mikropipett och en steril spets (figur 4A).
- Placera hjärnorna i SSM-mediet i odlingsbrickan med 12 brunnar i en inkubator vid 25 °C i 24 timmar (figur 4A).
Figur 4: Hjärnodling och immunfärgning. (A) Hela hjärnor i en 12-brunns odlingsrätt som innehåller 1 ml SSM. Odlingsskålen placeras sedan i en 25 ° C inkubator i 24 timmar. (B) 72-brunns minibricka som håller hjärnutväxter under immunfärgning. Hjärnor tvättas och lösningar överförs med hjälp av en P20-mikropipett inställd på 10 μL. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Spridningsanalys, hjärnfixering och antikroppsfärgning
- Dagen efter, gör 1 ml EdU SSM-lösning. Pipett 10 μL av ett 10 mM-bestånd av 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) med 990 μL SSM (slutlig EdU-koncentration motsvarar 0,1 mM) i ett sterilt mikrocentrifugrör och blandas. När inkubationen på 24 timmar är klar pipetterar du 1 ml EdU SSM i en brunn i den sterila odlingsbrickan med 12 brunnar.
- Överför hjärnorna med hjälp av en mikropipett med en steril spets från brunnen som innehåller SSM endast till den nya brunnen som innehåller EdU SSM-lösningen. Inkubera i 1 timme vid 25 °C.
- Överför sedan de EdU-märkta hjärnorna till en annan brunn i samma odlingsbricka som innehåller 1 ml fixeringsmedel (4% paraformaldehyd, se tabell 3 för recept) i 20 minuter.
VARNING: Paraformaldehyd är en biologisk fara och måste kasseras på rätt sätt. - Efter fixering överför du snabbt hjärnorna till brunnarna i en 72-brunns minibricka med en mikropipett. Varje brunn kan rymma 10 hjärnor och 10-15 μL vätska (figur 4B). När hjärnorna har överförts till minifacket (högst 10 hjärnor per brunn), ta bort fixen och skölj hjärnorna 3 gånger i 10 μL 1x PBT (fosfatbuffert, pH 7,4 innehållande 0,1% Triton-X 100).
OBS: Sköljning innebär pipettering av 10 μL 1x PBT på hjärnan, avlägsnande och upprepning 3 gånger. - Tvätta sedan hjärnorna 3 gånger i 10 minuter vardera, igen i 10 μL 1x PBT. Se till att hjärnorna är täckta med lite vätska hela tiden.
- När tvättarna är klara, pipettera 10 μL blockerande lösning (1x PBT med 10% normalt getserum) på hjärnan. Täck brickan och försegla den med en remsa parafilm runt kanten.
- När den är förseglad, placera minibrickan i en förseglad låda med våta handdukar för att ge en fuktig miljö för att förhindra avdunstning. Placera lådan som innehåller brickan vid 4 °C över natten.
- Följande dag, gör en primär antikroppslösning.
OBS: I detta protokoll användes kaninantiklotter för att märka cellmembran och råtta anti-deadpan för att märka neuroblaster, även om ett antal andra primära antikroppar kunde användas.- För att göra den primära antikroppslösningen, gör först utspädningar av primära antikroppar i den blockerande lösningen. Till exempel används kanin anti-klotter vid en slutlig koncentration av 1:1000. Späd därför först kaninens antiklotterantikropp vid 1:100 (1 μL antikropp plus 99 μL blockerande lösning). Rat-deadpan används i en slutlig koncentration av 1:100. Späd därför först rått-deadpan-antikroppen vid 1:10 (1 μL antikropp plus 9 μL blockerande lösning).
OBS: Dessa utspädningar kan lagras långsiktigt vid 4 °C om natriumazid (0,05 %) också tillsätts för att hämma bakterietillväxten. - Räkna sedan antalet brunnar som innehåller hjärnor. Antalet brunnar bestämmer volymen av primär antikroppslösning som ska tillverkas. Till exempel, om det finns 2 brunnar av hjärnor, förbered 20 μL primär antikroppslösning (för 10 brunnar, 100 μL, etc.). För att göra en 20 μL primär antikroppslösning, tillsätt 2 μL av varje primär antikroppsutspädning och 16 μL av den blockerande lösningen.
OBS: Den slutliga koncentrationen av var och en av de primära antikropparna är 1: 1000 respektive 1: 100. Kort sagt, gör den första utspädningen av primära antikroppar i en koncentration så att den andra utspädningen alltid är 1:10 för att komma fram till respektive slutliga koncentrationer. I detta fall 1:1000 för kanin anti-klotter och 1:100 för råtta anti-deadpan.
- För att göra den primära antikroppslösningen, gör först utspädningar av primära antikroppar i den blockerande lösningen. Till exempel används kanin anti-klotter vid en slutlig koncentration av 1:1000. Späd därför först kaninens antiklotterantikropp vid 1:100 (1 μL antikropp plus 99 μL blockerande lösning). Rat-deadpan används i en slutlig koncentration av 1:100. Späd därför först rått-deadpan-antikroppen vid 1:10 (1 μL antikropp plus 9 μL blockerande lösning).
- Ta bort blockeringslösningen med mikropipetten inställd på 10 μL och pipetten 10 μL primär antikroppslösning i varje brunn.
- Täck över och försegla brickan med parafilm och lägg tillbaka den i den förseglade lådan med våta handdukar. Inkubera över natten vid 4 ° C.
OBS: Skakning krävs inte och är starkt avskräckt. Antikroppar kommer att tränga in i hjärnan utan att skaka eller blanda. - Följande dag, ta bort den primära antikroppslösningen med en mikropipett och skölj hjärnan 3 gånger med 10 μL 1x PBT. Tvätta sedan hjärnorna 4 gånger med 10 μL 1x PBT i 10 minuter vardera. Under 10 minuters tvätt, förbered den sekundära antikroppslösningen.
- För att göra den sekundära antikroppslösningen, välj sekundära antikroppar som känner igen de primära antikropparna. I detta protokoll användes getantikanin Alexa Fluor 488 och getantiråtta Alexa 555.
- Pipettera 1 μL av var och en av de sekundära antikropparna i ett mikrocentrifugrör med 298 μL av den blockerande lösningen för att göra den slutliga koncentrationen 1:300 för varje sekundär antikropp.
- Efter den sista 10 minuters tvätten, ta bort 1x PBT och pipetten 10 μL av den sekundära antikroppslösningen i varje brunn. Försegla brickan med parafilm och lägg tillbaka den i lådan med fuktiga handdukar. Inkubera över natten vid 4 ° C.
OBS: Oroa dig inte för att ta bort varje sista μL i brunnarna mellan sköljningar, tvättar eller när du lägger till primära och sekundära antikroppslösningar. Hjärnorna kommer alltid att förbli nedsänkta i några μL vätska, vilket är bra. - Följande dag, ta bort den sekundära antikroppslösningen med en mikropipett och skölj hjärnan 3 gånger med 10 μL vardera av 1x PBT. Tvätta sedan hjärnorna 4 gånger med 10 μL vardera av 1x PBT i 10 min vardera.
- Under de 10 minuters tvättarna, förbered EdU-reaktionsblandningen för att detektera EdU-införlivande. Förbered EdU-reaktionsblandningen enligt tillverkarens riktlinjer.
- Efter den sista tvätten, ta bort 1x PBT och pipetten 10 μL av EdU-reaktionsblandningen i varje brunn med hjärnor. Försegla mikrobrunnsplattan med parafilm och täck med aluminiumfolie. Låt tallriken stå på bänken i 30 min.
- Efter 30 min, skölj hjärnorna 3 gånger med 10 μL vardera av 1x PBT och tvätta hjärnorna 3 gånger med 10 μL vardera av 1x PBT i 5 min vardera.
- Efter den sista tvätten, ta bort 1x PBT och pipetten 10 μL av en glycerolbaserad monteringsmedielösning. Försegla plattan och lägg vid 4 °C över natten.
5. Montering och avbildning av hjärnorna
- Följande dag, förbered mikroskopglas (25 mm x 75 mm x 1 mm): Lim (t.ex. superlim) ett 22 mm x 22 mm x 1 mm fyrkantigt täckglas i varje ände av mikroskopbilden för att skapa en "bro" över vilken den större 22 mm x 50 mm x 1 mm täckglaset kommer att placeras för att göra ett utrymme mellan bilden och den större täckglaset (figur 5A). Detta utrymme gör att hjärnan kan vara tillräckligt med rörelse för att vara korrekt orienterad samtidigt som den förhindrar att den krossas.
Figur 5: Schematisk som visar mikroskopbild, orientering och celltyper i larvhjärnan. (A) Visuell representation av mikroskopglidning på vilken en larvhjärna är monterad och är redo att avbildas. (B) En riktlinje har också visat sig användas för vävnadsorientering. (C) Mikroskopglidning redo för avbildning på ett konfokalmikroskop. (D) Tecknad film som visar några av celltyperna i larvhjärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Efter limning av 22 mm x 22 mm x 1 mm täckglas på mikroskopbilden, pipett 9,3 μL av den glycerolbaserade monteringsmedielösningen som innehåller en hjärna från en brunn på mikrobrunnsplattan och placera den på mitten av bilden (figur 5A).
OBS: Larvhjärnorna kan fästa vid pipettspetsen, så var försiktig. För att undvika vidhäftning, börja med att aspirera antifaden och sedan aspirera den enda hjärnan mot slutet av 9,3 μL-volymen. - När hjärnan är på glid, placera försiktigt 22 mm x 50 mm x 1 mm täckglas ovanpå. Placera hjärnan enligt figur 5B. Flytta försiktigt täckglaset runt för att orientera hjärnan. Provet är sedan klart för avbildning.
- Använd ett konfokalmikroskop utrustat med hög förstoring och ett högt numeriskt bländarmål (figur 5C) för att få de bästa bilderna. Till exempel: 60x eller 63x, 1,4 NA oljenedsänkningslins.
- Föreställ dig hjärnorna med ryggytan närmast täckglaset (och objektivt). Förvärva Z-staplarna genom hela hjärnhalvan med början vid den ventrala ytan (längst bort från målet) med 1 μm intervall eller Z-stegstorlek.
OBS: Lasrar som används beror på de sekundära antikropparna. I detta protokoll var laserlinjerna som användes 488 nm för att detektera Scribble-färgning, 555 nm för att detektera Deadpan och 633 nm för att detektera EdU.
- Föreställ dig hjärnorna med ryggytan närmast täckglaset (och objektivt). Förvärva Z-staplarna genom hela hjärnhalvan med början vid den ventrala ytan (längst bort från målet) med 1 μm intervall eller Z-stegstorlek.
6. Dataanalys
- Använd Fiji programvara med öppen källkod för att analysera hjärnhalvor och använd Fiji cell counter plugin för att räkna cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nykläckta OregonR-hjärnor dissekerades och odlades i 24 timmar i kompletterade Schneiders media (SSM) med insulin. Vävnader fixerades och färgades enligt protokollet. Primära antikroppar genererade mot Deadpan (Dpn) för att detektera NBs och Scribble för att märka cellmembran användes. Tymidinanalogen 5-etynyl-2′-deoxiuridin (Edu) tillsattes för att detektera S-fasingång och NB-reaktivering. Vi fann stora Edu positiva och Dpn positiva NBs efter 24 timmar i kultur (Figur 6A-C). Därefter odlades nykläckta OregonR-hjärnor av vild typ i 24 timmar i kompletterade Schneiders-medier utan insulin. Efter 24 timmar i kultur fann vi inga stora Edu-positiva och Dpn-positiva NB: er förutom de fyra svampkropps-NB: erna och en ventrolateral NB (Figur 6D-F). Svampkroppen och de ventrolaterala neuroblasterna är en delmängd av de centrala hjärnneuroblasterna som delar sig kontinuerligt under embryonal till larvövergång. Vi drar slutsatsen att exogent insulin är tillräckligt för att reaktivera neuroblaster från lugn i hjärnutplanter odlade i Schneiders media.
Under konfokal avbildning observerades ibland vissa hjärnhalvor med skador. Skadorna vi hittade bestod av små till stora hål i den utplanterade hjärnvävnaden (figur 6G,H). Dessa vävnader exkluderades från analysen. Förutom 24-timmarstidpunkten odlades hjärnor också framgångsrikt i 48 timmar (data visas inte). Efter 48 timmar i odling fann vi en ytterligare ökning av antalet Dpn-positiva EdU-positiva CB-AB och en ökning av antalet hjärnor med vävnadsskada. Detta tyder på att det sannolikt är möjligt att odla hjärnor på lång sikt; Stor försiktighet måste dock iakttas för att undvika vävnadsskador.
Figur 6: Konfokal avbildning. (A-C) Exogent insulin är tillräckligt för att återaktivera vilande NBs. (A) En maximal intensitetsprojektion av en hjärnhalvklot som visar Deadpan (Dpn) och Edu positiva NBs efter 24 timmars odling i närvaro av insulin. (B) En enda Z-skivbild av samma hjärnhalva med Scribble (Scrib) immunfärgning av märkningscellmembran. (C) Hög förstoring av NB i insatsen i panel B. Enkanaliga gråskalebilder med färgsammanslagning nere till höger. (D-F) NBs förblir vilande i frånvaro av exogent insulin. (D) En maximal intensitetsprojektion av en hjärnhalva som visar Dpn- och Edu-positiva NBs efter 24 timmars odling i frånvaro av insulin. (E) En enda Z-stack av samma hjärnhalva med Scrib-immunfärgning. (F) Hög förstoring av NB i insatsen i panel E. Enkanaliga gråskalebilder med färgsammanslagning nere till höger. Pilspetsen betecknar en av de 4 MB MB som delar sig kontinuerligt och inte går in och ut ur lugn (se figur 1). (G,H) Exempel på skadade hjärnexplanter, som inte används i analysen. (G) En enda Z-skiva av en hjärnhalva med stora hål i vävnaden. (H) En enda Z-skiva av hjärnhalvan visar små hål i vävnaden. Skalstång: 10 μm. Den vita streckade linjen indikerar mittlinjen. Främre är upp och bakre är nere. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Ingrediens/mängd | 1 L (~ 125 druvplattor) |
| Druvsaft | 250 ml |
| Sackaros | 25 g |
| Vatten | 750 ml |
| Bacto Agar | 18,75 g |
| Tegosept (10%) | 4 ml |
| Propionsyra | 5 ml |
Tabell 1: Recept för att göra druvplattor. Följ stegen som beskrivs i avsnitt 1.2.
| Ingrediens (startkoncentration) | Att göra 5 ml | Slutlig koncentration |
| Schneiders Drosophila media | 3,89 ml | |
| Serum från fetalt nötkreatur (100%) | 500 μL | 10% |
| Glutamin (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Penicillin (5000 enheter/ml), streptomycin (50 000 μg/ml) | 100 μL | 1000 U/ml penna, 1 mg/ml Strep |
| Insulin (10 mg/ml) | 10 μL | 0,02 mg/ml |
| glutation (50 mg/ml) | 5 μL | 0,05 mg/ml |
| I en steril huva, med steril teknik, tillsätt alla ingredienser tillsammans i ett 14 ml koniskt rör. Lägg den på is tills den används. | ||
Tabell 2: Recept för att göra kompletterade Schneiders media (SSM). Tabellen visar volymen av alla ingredienser som krävs för beredning av 5 ml SSM.
| Recept för att göra fixativ | ||
| Ingrediens (startkoncentration) | Att göra 40 ml | Slutlig koncentration |
| Formaldehyd av EM-kvalitet 16% | 10 ml | 4% |
| PEM-buffert pH 7,0 | 29,96 ml | |
| Triton X-100 | 40 ml | 0.10% |
| Blanda alla ingredienser tillsammans. Alikvot 1 ml i mikrocentrifugrör och förvaras vid -20 °C. Frys inte alikvoterna igen efter upptining. | ||
| Recept för PEM-buffert | ||
| Ingrediens (startkoncentration) | Att göra 100 ml | Slutlig koncentration |
| RÖR pH 6,8 (500 mM) | 20 ml | 100 mM |
| EGTA (500 mM) | 2 ml | 10 mM |
| MgSO4 (1 m) | 100 ml | 1 mM |
| Vatten | 77,9 ml | |
Tabell 3: Recept för att göra fixativ och PEM-buffert. I tabellen anges kemikalierna och deras respektive koncentrationer för beredning av fixeringsmedel och PEM-buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs här för att odla hjärnplanter kan utföras i de flesta laboratoriemiljöer. De verktyg som krävs, liksom förfarandet och datainsamlingen, är enkla och okomplicerade. Med denna metod kan man testa en mängd olika hypoteser, inklusive de som är relaterade till cellsignalkaskaderna och yttre faktorer som reglerar NB-reaktivering och proliferation. Här, med hjälp av oregonrdjur av vild typ, fann vi att exogent insulin var tillräckligt för att återaktivera NBs från lugn oberoende av andra djurspecifika systemiska signaler. Med hjälp av GAL4 / UAS-systemet kan man också slå ner eller överuttrycka insulinvägskomponenter på ett celltypspecifikt sätt för att bättre förstå pi3-kinassignaleringens roll vid NB-reaktivering. Förutom att använda genetik kan komponenterna i media också manipuleras för att ytterligare testa yttre signaler eller signaler som främjar NB-reaktivering och spridning. Till exempel kan man testa hypotesen att tillsatsen av steroidhormonet ekdyson skulle öka andelen NB-reaktivering och proliferation i kulturen.
Även om denna metod är enkel upplevde vi tidigt flera tekniska svårigheter. Den första tekniska svårigheten var skador på dissekerade, ofixade hjärnor under medieförändringar. Vi fann att överföring av hjärnor till en ny brunn i odlingsskålen istället för att ändra mediet i brunnen resulterade i mindre vävnadsskador eftersom hål i hjärnor uppstod när media avlägsnades från brunnen och explanterna fastnade i botten av brunnen. För att lösa detta problem överfördes hjärnor i lösning med hjälp av en pipett och förblev därför kontinuerligt nedsänkta. En annan teknisk aspekt som ändrades var sterilisering av dissekeringsverktyg. En mask och handskar användes hela tiden. Etanol (70%) användes för att spruta dissektionsverktygen och dissektionsbrickorna. Detta gjorde det möjligt för bakteriebelastningen att hållas till ett minimum. Stegen före fixering bör utföras i en miljö så steril som möjligt, helst en steril huva, och med exakta och extremt skonsamma rörelser. Den sista svårigheten vi stötte på var att hjärnorna var klibbiga. Ofta skulle hjärnor fästa vid pipettspetsens inre väggar när vi försökte placera dem på mikroskopbilden för avbildning. För att åtgärda detta problem modifierade vi hjärnöverföringsmetoden mellan mikrobrunnsminifacket till mikroskopbilden som beskrivits ovan och fyllde pipettspetsen med monteringsmedia innan vi aspirera hjärnan i pipettspetsen. Denna metod smörjde pipettspetsen med det glycerolbaserade monteringsmediet och minskade kraftigt stickningen.
Metoder för att odla Drosophila hjärnutväxter har publicerats tidigare 12,19,20,21,22. En metod publicerad av Prithviraj et al. rapporterar odling av sena larver och tidiga pupalhjärn. I detta fall tillsattes steroidhormonet ekdyson till odlingsmediet och hjärnorna upprätthölls i kultur i upp till 10 h20. Bobstock et al. rapporterar odling av hjärnor från sena L1 / tidiga L2-djur och levande avbildning av NBs i flera timmar i den ventrala nervkabeln. De rapporterar också svårigheter att hantera hjärnor från unga larver21. Siller et al. rapporterar odling av larvhjärtor och användning av levande cellavbildning för att analysera spindeldynamik under neuroblastdelningar i mitten till sena larvstadier19. Alla metoder som publicerats tidigare fokuserar på tidpunkter efter det nykläckta larvstadiet före djurfoder, med ett undantag. I Britton et al. rapporteras att NBs återaktiveras från lugn när hjärnväxter samodlats med fettkropp12. Överraskande nog rapporterar Britton et al. också att exogent insulin inte var tillräckligt för att återaktivera vilande NK, i motsats till vad som rapporteras här. Därför lägger grunden för idén att en FBDS krävs för NB-reaktivering. Vid tidpunkten för Britton-papperet var NB-specifika molekylära markörer ännu inte tillgängliga och det är uppenbart att hjärnmorfologin äventyras efter 3 dagar i odling. Här tillhandahåller vi en enkel metod för att återaktivera NBs i hjärnutplantningar genom att helt enkelt tillsätta exogent insulin till odlingsmediet. En viktig anmärkning om försiktighet är att mängden insulin som tillsätts till kulturen långt överstiger fysiologiska förhållanden. Höga nivåer av insulin kan leda till högre nivåer av PI3-kinasvägsaktivitet i hjärncellstyper in vitro jämfört med in vivo-tillstånd.
Eftersom kulturmedierna lätt kan manipuleras genom att lägga till olika faktorer kan denna teknik användas för att ta itu med framtida hypoteser om yttre signalering och NB-lugn, in- och utgång. Denna metod kan också användas för storskalig screening, antingen RNAi eller läkemedelsbaserad. För screening i stor skala skulle det vara bäst att använda transgena djur som uttrycker fluorescerande reportrar. Detta kan göra det möjligt för en att kringgå antikroppsfärgning, vilket är tidskrävande. I allmänhet, efter övning, kunde man ställa in 10 kulturer med 3 hjärnor vardera på 30 minuter. På en vecka kan det vara rimligt att screena 150 olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner LSAMP Bridges to Doctorate-programmet för finansiering (CNK) samt NIH / NIGMS (R01-GM120421 och R35-GM141886). Vi är tacksamma för Dr. Conor Sipe för figur 1. Vi tackar också alla Siegrist lab-medlemmar för deras fortsatta stöd och mentorskap. Vi tackar särskilt Chhavi Sood och Gary Teeters för deras noggranna läsning av manuskriptet och för att ha gett kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
