En metod för att återaktivera vilande neurala stamceller i odlade Drosophila hjärnplanter har etablerats. Med hjälp av denna metod kan systemiska signalers roll kopplas bort från vävnadsinboende signaler vid reglering av neural stamcells lugn, inträde och utgång.
Neurala stamceller (NSC) har förmågan att föröka sig, differentiera, genomgå apoptos och till och med gå in och ut ur lugn. Många av dessa processer styrs av det komplexa samspelet mellan NSC:s inneboende genetiska program och NSC:s yttre faktorer, lokala och systemiska. I den genetiska modellorganismen, Drosophila melanogaster, NSC, känd som neuroblaster (NG), växlar från lugn till spridning under embryonal till larvövergång. Under denna tid kommer larver ut ur sina äggskal och börjar krypa och söka efter näringsämnen i kosten. Som svar på djurfoder producerar fettkroppen, ett endokrint organ med lipidlagringskapacitet, en signal som frigörs systemiskt i den cirkulerande hemolymfen. Som svar på den feta kroppshärledda signalen (FBDS) produceras drosophila insulinliknande peptider (Dilps) och frigörs från hjärnans neurosekretoriska neuroner och glia, vilket leder till nedströms aktivering av PI3-kinas tillväxtsignalering i NBs och deras glial- och trakealnisch. Även om detta är den nuvarande modellen för hur NBs byter från lugn till spridning, är FBDS- yttre cue fortfarande svårfångad. För att bättre förstå hur NB yttre systemiska signaler reglerar utträde från lugn, utvecklades en metod för att odla tidiga larvhjärn in vitro före djurfoder. Med denna metod kan exogena faktorer tillföras kulturmedierna och NB-utgång från lugn analyseras. Vi fann att exogent insulin är tillräckligt för att återaktivera NBs från lugn i hela hjärnans explanter. Eftersom den här metoden är väl lämpad för storskaliga skärmar strävar vi efter att identifiera ytterligare yttre signaler som reglerar NB-lugn kontra spridningsbeslut. Eftersom generna och vägarna som reglerar NSC-spridningsbeslut är evolutionärt bevarade, kan resultaten från denna analys ge insikt i att förbättra regenerativa terapier i kliniken.
Stamceller är av stort intresse på grund av deras potential för användning inom regenerativ medicin 1,2. Många djur, särskilt de som är långlivade, upprätthåller stamceller i sina vuxna vävnader. Dessa bosatta stamceller fungerar för att upprätthålla vävnadshomeostas och används för reparation efter fysisk skada eller sjukdom 3,4. De flesta stamceller hos vuxna djur är vilande, ett relativt vilande tillstånd som kännetecknas av cellcykelstopp och inaktivering av tillväxtsignalering5. Som svar på yttre signaler lämnar stamceller från lugn, går in i cellcykeln och börjar generera dotteravkomma som är specifik för deras vävnadstyp. Till exempel, för att montera ett effektivt immunsvar, inducerar antigenpresenterande celler vilande naiva T-celler att komma in i cellcykeln och klonalt expandera6. Som svar på skelettmuskelskador kommer muskelsatellitstamceller in i cellcykeln och genererar dottermycoblaster för att ersätta skadade myofibriller 5,7. Även om det är uppenbart att vilande stamceller svarar på yttre signaler, är arten av den yttre signalen i många fall fortfarande oklar liksom mekanismen för cue-inducerad stamcellsaktivering. Att få en bättre förståelse för hur vilande stamceller svarar på yttre signaler och går in i cellcykeln kommer att bidra till utvecklingen av bättre stamcellsterapier i kliniken och öka den vetenskapliga kunskapen.
I årtionden har modellorganismer använts för att avslöja de gener och cellsignalvägar som reglerar stamcellsproliferation under utveckling och i vuxen ålder. I Drosophila delar neurala stamceller (NSC), kända som neuroblaster (NBs), under hela utvecklingen för att generera alla neuroner och glia som i slutändan integreras och bildar den neurala kretsen som krävs för hjärnfunktion 8,9. Liksom andra stamceller delar sig NBs asymmetriskt för att självförnya och i vissa fall symmetriskt expandera stamcellspoolen. CB specificeras under embryogenesen och de flesta går in i lugn mot slutet, samtidigt som de minskar moderns näringslager (figur 1). När embryogenesen är klar kläcker larverna och börjar mata. Som svar på utfodring av djur återaktiveras NBs från lugn och återupptar celldelningar 10,11,12,13,14,15,16. Eftersom Drosophila CNS är relativt enkelt och eftersom NBs går in och ut ur lugn vid definierade tidpunkter, använder Drosophila för att undersöka regleringen av lugn, inresa och utgång, visar sig vara idealisk.
Figur 1: Relativ proliferation av CB NBs (centrala hjärnneuroblaster, röda) och MB NBs (svampkroppsneuroblaster, blå) över utvecklingstiden. I slutet av embryogenesen upphör de flesta NBs (röda linjen) proliferation och går in i lugn. Quiescence fortsätter tills nykläckta larver konsumerar sin första kompletta måltid. Fokuspunkterna för denna metod betecknas i röda cirklar (1, lugn och 2, reaktivering). MB NBs (blå) är en delmängd av centrala hjärnans NABs som delar sig kontinuerligt under hela utvecklingen (4 per hjärnhalvklot). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som svar på djurfoder blir PI3-kinas och TOR tillväxtsignalvägar aktiva i NBs och i deras glial- och trakealnisch 10,11,15,16. När näringsämnen i kosten dras tillbaka eller när nivåerna av PI3-kinas reduceras, misslyckas NBs med att återaktivera och tillväxten av glia och luftstrupen minskar också 10,11,15,16. Den nuvarande modellen hävdar att NB-reaktivering är kopplad till larvtillväxt av fettkroppen, vilket frigör en systemisk signal som svar på djurfoder 12,17,18. Denna signal, som förblir svårfångad, främjar sannolikt uttrycket och frisättningen av Drosophila insulinliknande peptid (Dilps) i hjärnan, vilket leder till nedströms aktivering av PI3-kinas i NBs och deras glial och trakeal nisch. För att bättre förstå arten av de systemiska signalerna utvecklade vi en metod för att återaktivera vilande NA i odlade hjärnutplantningar. Med denna metod kan reaktivering av NBs analyseras i frånvaro av systemiska signaler för hela djur. Exogena faktorer kan återföras till odlingsmediet och NB-reaktivering analyseras baserat på införlivandet av tymidinanalogen, EdU. Med hjälp av denna metod bestämde vi att exogent insulin är tillräckligt för att återaktivera vilande NK i hjärnutplanteringar. Framtida arbete kommer att syfta till att identifiera ytterligare faktorer som, när de läggs tillbaka, antingen positivt eller negativt reglerar NB-lugn i hjärnutplantningar.
Metoden som beskrivs här för att odla hjärnplanter kan utföras i de flesta laboratoriemiljöer. De verktyg som krävs, liksom förfarandet och datainsamlingen, är enkla och okomplicerade. Med denna metod kan man testa en mängd olika hypoteser, inklusive de som är relaterade till cellsignalkaskaderna och yttre faktorer som reglerar NB-reaktivering och proliferation. Här, med hjälp av oregonrdjur av vild typ, fann vi att exogent insulin var tillräckligt för att återaktivera NBs från lugn oberoende av andra dju…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner LSAMP Bridges to Doctorate-programmet för finansiering (CNK) samt NIH / NIGMS (R01-GM120421 och R35-GM141886). Vi är tacksamma för Dr. Conor Sipe för figur 1. Vi tackar också alla Siegrist lab-medlemmar för deras fortsatta stöd och mentorskap. Vi tackar särskilt Chhavi Sood och Gary Teeters för deras noggranna läsning av manuskriptet och för att ha gett kommentarer.
10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
63x Objective | Lecia | ||
Active dry yeast | Most supermarkets | ||
Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Superglue | Most supermarkets | ||
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |