Summary
Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.
Abstract
Insektendärme werden von verschiedenen Bakterien besiedelt, die die physiologischen Merkmale des Wirts tiefgreifend beeinflussen können. Die Einführung eines bestimmten Bakterienstamms in ein axenisches Insekt ist eine leistungsstarke Methode, um die mikrobielle Funktion des Darms zu überprüfen und die Mechanismen aufzuklären, die den Interaktionen zwischen Darmmikrobe und Wirt zugrunde liegen. Die Verabreichung von Antibiotika oder die Sterilisation von Eioberflächen sind zwei häufig verwendete Methoden, um Darmbakterien von Insekten zu entfernen. Zusätzlich zu den möglichen nachteiligen Auswirkungen von Antibiotika auf Insekten zeigten frühere Studien, dass die Fütterung von Antibiotika Darmbakterien nicht eliminieren konnte. Daher werden keimfreie künstliche Diäten im Allgemeinen verwendet, um axenische Insekten zu erhalten, was ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess ist, der den Nährstoffkomponenten in natürlichen Lebensmitteln nicht vollständig ähneln kann. Beschrieben wird hier ein effizientes und einfaches Protokoll zur Vorbereitung und Pflege axenischer Larven eines Blattkäfers (Plagiodera versicolora). Insbesondere wurden Oberflächen der Käfereier sterilisiert, woraufhin keimfreie Pappelblätter zur Aufzucht axenischer Larven verwendet wurden. Der axenische Status der Insekten wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays weiter bestätigt. Durch die Kombination von Eierdesinfektion und keimfreier Kultivierung wurde gemeinsam eine effiziente und bequeme Methode entwickelt, um axenische P. versicolora zu erhalten, die ein leicht übertragbares Werkzeug für andere blattfressende Insekten darstellt.
Introduction
Ähnlich wie bei Säugetieren ist der Verdauungstrakt von Insekten eine Höhle für die Nahrungsverdauung und -absorption. Die meisten Insekten beherbergen verschiedene kommensale Bakterien, die in ihren Eingeweiden gedeihen und von der Ernährung leben, die von Wirten1 geliefert wird. Die kommensale Darmgemeinschaft hat einen tiefgreifenden Einfluss auf mehrere physiologische Prozesse bei Insekten, einschließlich Nahrungsverdauung und Entgiftung 2,3,4, Ernährung und Entwicklung 5,6,7, Abwehr von Krankheitserregern und Parasiten 8,9,10,11, chemische Kommunikation 12,13 und Verhalten 14 ,15. Interessanterweise können einige Darmmikrobiota fakultativ pathogen sein oder durch eindringende Krankheitserreger manipuliert werden, um die Infektion zu verschlimmern, was darauf hindeutet, dass Darmbakterien in einigen Fällen schädlich sein können16,17,18. Darmbakterien können auch als mikrobielle Ressource für biotechnische Anwendungen und die Schädlingsbekämpfung dienen. Zum Beispiel wurden lignocelluloseverdauende Bakterien aus phytophagen und xylophagen Insekten verwendet, um Pflanzenzellen für die Entwicklung von Biokraftstoffen zu verdauen19. Die Ausbreitung von technisch hergestellten Darmsymbionten, die bioaktive Moleküle exprimieren, ist eine neuartige und vielversprechende Taktik zur Bekämpfung von land- und forstwirtschaftlichen Schädlingen und Moskitos, die Infektionskrankheiten übertragen 19,20,21, die auch zur Verbesserung der Fitness von Nützlingen eingesetzt werden können 22. Die Veranschaulichung, wie sich ein Darmbakterium in vivo verhält, wird daher als Priorität angesehen, um seine Funktion voll auszuschöpfen und für verschiedene Anwendungen weiter zu nutzen.
Tiere können 1 bis >1000 symbiotische mikrobielle Arten im Darm1 beherbergen. Infolgedessen ist es schwierig, genau zu überprüfen, wie sich einzelne bakterielle Taxa oder ihre Ansammlung in einem Tier verhalten und ob der Wirt oder seine mikrobiellen Partner eine bestimmte Funktion ausüben. Daher ist die Vorbereitung axenischer Larven zur Gewinnung von gnotobiotischen Insekten durch Mono- oder Multispezies-Kolonisation notwendig, um die bakterielle Funktion und Interaktion mit Insektenzu untersuchen 23. Gegenwärtig sind die Verabreichung von Antibiotika-Cocktails und die Sterilisation der Oberfläche von Insekteneiern gängige Methoden, um Darmbakterien zu entfernen 14,24,25,26. Antibiotika-Diäten können Darmbakterien jedoch nicht vollständig eliminieren und wirken sich negativ auf die Insektenphysiologie des Wirtsaus 27,28. Folglich kann die Verwendung von mit Antibiotika behandelten Insekten die wahren Fähigkeiten einiger Darmbakterien verschleiern. Glücklicherweise kann die Oberflächensterilisation von Eiern dieses Problemaufheben 23,29, das keine oder nur zu vernachlässigende Auswirkungen auf experimentelle Insekten hat. Darüber hinaus können künstliche Diäten der natürlichen Insektennahrung nicht vollständig ähneln, und die Entwicklung einer künstlichen Ernährung ist ein kostspieliger und arbeitsintensiver Prozess30,31.
Der Weidenblattkäfer, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), ist ein weit verbreiteter blattfressender Schädling, der sich hauptsächlich von salicaceous Bäumen wie Weiden (Salix) und Pappeln (Populus L.) ernährt. 32,33 Hier wurde der Weidenblattkäfer als repräsentatives blattfressendes Insekt verwendet, um ein Protokoll zur Vorbereitung und Aufzucht eines keimfreien Insekts zu entwickeln. Wir nutzten die pflanzliche Gewebekultur, um keimfreie Pappelblätter zu erhalten, um P. versicolora axenische Larven aus sterilisierten Eiern zu züchten. Der axenische Status von P. versicolora-Larven wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Dieses Protokoll kann axenische Insekten aufrechterhalten, die den Wildzustand besser nachahmen als Insektenaufzucht mit einer künstlichen Diät. Noch wichtiger ist, dass diese Methode zu sehr niedrigen Kosten geeignet ist, was die Machbarkeit der Gewinnung axenischer Insekten für zukünftige Insekten-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien erhöht, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.
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Protocol
1. Insektenaufzucht
- Halten Sie die P. versicolora-Population in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel. Legen Sie sie in perforierte Kunststoffboxen mit gefliestem, nass absorbierendem Papier und füttern Sie sie mit frischen Pappelzweigen. Sprühen Sie sauberes Wasser auf das absorbierende Papier, um die Feuchtigkeit zu erhalten und die Zweige alle zwei Tage zu wechseln.
- Isolieren Sie Erwachsene für die Eiablage nach der Verpuppung. Füttere sie mit zarten Blättern, um mehr Eier zu erhalten.
- Sammeln Sie neu gelegte Eier (innerhalb von 24 Stunden). Legen Sie die Eier 60 h lang auf feuchtes, absorbierendes Papier, um axenische Larven vorzubereiten.
HINWEIS: Neu gelegte Eier schlüpfen nach ~72 h. Die beste Zeit, um Eioberflächen zu sterilisieren, ist der Tag vor dem Schlüpfen; Andernfalls nimmt die Anzahl der erfolgreich geschlüpften Eier ab.
2. Keimfreier Pappelanbau
- Bereiten Sie Murashige und Skoog (MS) -Medium und 1 mg/ml α-Naphthalin-Essigsäure (NAA) Stammlösungen vor (siehe Materialtabelle).
- In einer Biosicherheitshaube 50 μL 1 mg/ml NAA-Stammlösung zu 500 ml MS-Medium hinzufügen, gut schütteln, gut mischen, ~ 50 ml pro Gewebekulturbehälter gießen und auf die Erstarrung warten.
- Bereiten Sie Skalpelle, Alkohollampe und Pinzette vor; Sterilisieren Sie die Skalpelle und Pinzetten in der Alkohollampenflamme in der Biosicherheitshaube.
- Schneiden Sie 3-4 cm Stielsegmente mit apikalen Knospen oder lateralen Knospen aus Pappelsämlingen bei ~ 1 Wachstumsmonat (keimfreie, gewebekultivierte Sämlinge) und legen Sie sie in das Kulturmedium, ein oder zwei Stängelsegmente pro Behälter.
- Inkubieren Sie diese Stammsegmente in einer Wachstumskammer bei 25 °C und 50 ± 10 cd Lichtintensität mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel für ca. 30 Tage. Verwenden Sie die keimfreien Blätter, um die axenischen Larven zu füttern.
3. Sterilisation der Eioberfläche und Aufzucht axenischer Larven
- Autoklav Petrischale, Pinsel, Filterpapier, destilliertes Wasser und eine Petrischale mit LB (Luria-Bertani) Agarmedium.
- Blätter mit anhaftenden Eiern in eine Petrischale legen, die Eier vorsichtig mit einer Pinzette von den Blättern entfernen und in eine andere Petrischale geben.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, da die Eier an den Blättern haften. - Waschen Sie diese Eier mit 75% Ethanol für 8 min und wiederholen Sie die Wäsche viermal mit sterilem Wasser.
- Übertragen Sie die Eier auf LB-Agarmedium, um Feuchtigkeit für das Schlüpfen zu erhalten.
HINWEIS: Die Verwendung von LB-Agar-Medium kann helfen, zu überprüfen, ob das desinfizierte Ei keimfrei ist. - Legen Sie die Petrischale in eine Wachstumskammer und warten Sie, bis die Eier innerhalb von 24 Stunden geschlüpft sind.
- In einer Biosicherheitshaube drei Stücke Nassfilterpapier in einer Petrischale kacheln, keimfreie Pappelblätter auf das Papier legen, die Larven sammeln und auf die Blätter legen, die Petrischale mit Parafilm verschließen und in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel inkubieren.
HINWEIS: Die gewebekultivierten Blätter sind empfindlich und können schnell Wasser verlieren. Daher ist die Verwendung von feuchtem Filterpapier notwendig, wenn die Blätter in die Petrischale überführt werden. - Wechseln Sie die Blätter alle zwei Tage.
- Für die konventionell aufgezogenen Gruppen die Eier von den Blättern in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier geben und diese Larven mit keimfreien Pappelblättern füttern.
4. Nachweis axenischer Larven mit kulturabhängigen Assays
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Larven des 1., 2. und3. Stadiums aus den keimfreien und konventionell aufgezogenen Gruppenaus.
- Sezieren Sie die Larven des 3. Stadium mit steriler Schere und Pinzette unter einem Stereomikroskop und sammeln Sie ihre Eingeweide in Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie intakte 1. und 2. Instarlarven in Röhren.
HINWEIS: Sammeln Sie ganze Larven des 1. und 2. Stadiums, da sie zu klein sind, um sie zu sezieren, und halten Sie ihre Eingeweide intakt. - Fügen Sie 100 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung und drei Stahlkugeln zu 1,5 ml-Rohren hinzu und mahlen Sie die Gewebe mit einem Perlen-schlagenden Homogenisator zu Homogenaten.
- 100 μL des Homogenats mit einem sterilen Glasstreustab in LB-Agarmedium und -platte geben.
- Platzieren Sie die Platten 24 h lang bei 37 °C und beobachten Sie die Bakterienkolonien.
5. Verifizierung axenischer Individuen mit kulturunabhängigen Assays
- Extrahieren Sie die gesamte DNA des Gewebes (erhalten in Abschnitt 4) mit einem DNA-Extraktionskit.
- Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 nm.
- Amplifizieren Sie das bakterielle 16S rRNA-Gen mit universellen 16S rRNA-Primern mit PCR. Richten Sie das Reaktionssystem mit 18 μL 1,1-facher PCR-Mastermischung (siehe Materialtabelle), 0,5 μL 27F-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') und 100 ng-Template-DNA ein. Stellen Sie die PCR-Bedingungen für 3 min auf 95 °C ein; 28 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 1 min und 72 °C für 1 min; gefolgt von 72 °C für 10 min. Lagern Sie die PCR-Produkte bis zur weiteren Analyse bei 4 °C.
- Mischen Sie die PCR-Produkte mit Nukleinsäurefarbstoff und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer. Verwenden Sie 10 μL eines DNA-Markers als Referenz.
- Beobachten Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator und suchen Sie nach dem Zielfragment um 1.500 bp.
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Representative Results
Die Lebensstadien von P. versicolora sind in Abbildung 1 dargestellt. Das erwachsene Männchen ist kleiner als das erwachsene Weibchen (Abbildung 1A). Auf dem Feld gruppiert der Käfer seine Eier auf einem Blatt; Hier wurden vier Eier von einem Blatt gelöst (Abbildung 1B). Die Pappelstängelsegmente und Sämlinge, die für die axenische Insektenzucht verwendet werden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Der Darm einer Larve im 3. Stadium ist in Abbildung 3 dargestellt, und Darmsegmente sind mit weißen Klammern markiert.
Obwohl in keiner keimfreien Gruppe Bakterienkolonien beobachtet wurden, wurden sie in allen konventionell aufgezogenen Gruppen beobachtet (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass Larven aus sterilisierten Eiern, die mit gewebekultivierten Pappelblättern gefüttert wurden, keine Bakterien enthalten. Die ~1.500 bp PCR-Bänder erschienen in allen konventionell aufgezogenen Gruppen. Im Gegensatz dazu wurde in den keimfreien Gruppen oder der Negativkontrolle keine Bande beobachtet (Abbildung 5), was darauf hindeutet, dass keine Darmbakterien in axenischen Larven existierten. Es gab keine Unterschiede in der Larvenentwicklungszeit, Überlebensrate oder Aussehen zwischen keimfreien und konventionell aufgezogenen P. versicolora-Larven . Allerdings war die Körpermasse keimfreier Larven am 5. Tag etwas höher als die von konventionell aufgezogenen Larven, obwohl die Massen vor der Verpuppung16 ähnlich werden. Diese Ergebnisse bestätigten die Machbarkeit dieses Protokolls zur Vorbereitung und Hinterlegung axenischer Larven.
Abbildung 1: Lebensstadien des Weidenblattkäfers Plagiodera versicolora. (A) Weibliche und männliche Erwachsene; B) Eier; (C) Larvedes 1. Stadiums; (D) Larve im 2. Stadium; (E) Larve im 3. Stadium; und (F) pupa. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Pappelstängelsegmente und Sämlinge. (A) Stängelsegmente mit apikalen Knospen; (B) Stammsegmente wuchsen nach 10 Tagen Wurzeln; (C) einen einen Monat alten Sämling. Maßstabsstäbe = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Der Darm einer Larve im dritten Stadium. Vordarm, Mitteldarm und Hinterdarm sind mit Klammern gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Bestätigung der Wirksamkeit der Darmbakterienbeseitigung durch Kultivierung von Darm- oder ganzen Insektenhomogenaten auf LB-Agarplatten. In Larven, die mit keimfreien Pappelblättern gefüttert wurden, wurden keine Bakterien beobachtet, während Bakterien in konventionell aufgezogenen Gruppen beobachtet wurden. 1st, 2nd und 3rd Instar Larven wurden für den Assay verwendet. Drei Larven wurden in jeder Gruppe zufällig ausgewählt. Abkürzungen: GF = keimfreie Larven; CR = konventionell gezüchtete Larven. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bestätigung der Wirksamkeit der Darmbakterienelimination durch PCR-Assay unter Verwendung universeller 16S rRNA-Genprimer. Das Zielband des 16S rRNA-Gens beträgt ~ 1.500 bp. Für den Assay wurden Larven im St-, 2. und3. Stadium verwendet. In den GF-Gruppen wurde kein Zielband beobachtet. Abkürzungen: NC = Negativkontrolle; GF = keimfrei; CR = konventionell aufgezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Herstellung keimfreier Larven und die Gewinnung von gnotobiotischen Larven durch Wiedereinführung spezifischer Bakterienstämme sind leistungsfähige Methoden, um die Mechanismen aufzuklären, die den Wirt-Mikroben-Interaktionen zugrunde liegen. Neu geschlüpfte Larven erhalten Darmmikrobiota auf zwei Arten: vertikale Übertragung von der Mutter auf die Nachkommen oder horizontale Akquisition von Geschwistern und der Umwelt34. Ersteres kann durch elterliche Übertragung auf den Nachwuchs durch Kontamination der Eioberflächeerfüllt werden 35. Daher ist es sehr gut möglich, axenische Larven durch Sterilisieren von Insekteneioberflächen zu erhalten27,28,29. Die Verabreichung eines Cocktails aus mehreren Antibiotika ist eine weitere Möglichkeit, axenische Insekten zu entwickeln, hat jedoch mehrere Nachteile28. Im Gegensatz dazu ist die Sterilisation der Eioberfläche mit anschließender axenischer Diät besser für die Entwicklung axenischer Insekten23,28,29.
Die Eier der meisten blattfressenden Käfer sind sichtbar, leicht zu erwerben und einfach zu desinfizieren. Dies ist der Hauptgrund, warum ein einfaches Reagenz (75% Ethanol) und eine kürzere Zeit (8 min) für die Desinfektion im Vergleich zu ähnlichen Studien verwendet wurden (z. B. 40 min Eierdesinfektion für Stinkwanze Plautia stali mit 75% Ethanol und Formaldehyd zur Gewinnung axenischer Insekten; 6 min Eioberflächensterilisation von Drosophila mit 1% aktivem Chlor und 75% Ethanol; und 10 min Eieroberflächensterilisation von Rotpalmenrüsselkäfer Rhynchophorus ferrugineus mit 10% Natriumhypochlorit Lösung)23,29,36. Bei Insektenarten mit winzigen Eiern müssen der Einsatz von Desinfektionsmitteln und die Sterilisationsdauer optimiert werden, da die Behandlung die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann.
In einigen Fällen werden keimfreie künstliche Diäten für die axenische Insektenaufzucht nach der Sterilisation der Eioberflächeeingesetzt 29,37. Die Entwicklung einer geeigneten künstlichen Ernährung für Insekten ist jedoch ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess. Nährstoffe in der Nahrung beeinflussen stark die Insektenphysiologie (z. B. Entwicklungszeit, Immunität) und die Darmmikrobiota 6,35. Daher sollte eine qualifizierte künstliche Diät für ein Insekt eine ähnliche Nährstoffzusammensetzung wie die natürliche Nahrung enthalten, was insbesondere für phytophage Insekten schwer zu erreichen ist. In diesem Protokoll haben wir Insekten mit axenischen Wirtspflanzen gefüttert, was die Mängel einer künstlichen Ernährung überwindet. Wichtig ist, dass es wie bei der hier verwendeten Pappelpflanze auch nicht schwierig ist, gewebekultivierte Sämlinge aus vielen wirtschaftlich wichtigen Kulturen wie Tabak, Kartoffeln, Tomaten, Weizen und Reis durch Samenoberflächensterilisation oder Stängelabschnittsdesinfektionzu erhalten 38. Bemerkenswert ist, dass Endophyten in Pflanzen in gewebekultivierten Sämlingen39 vorhanden sein können und durch Triebspitzen-Meristem-Kulturtechnologie40 eliminiert werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine neue Methode zur Erhaltung keimfreier Insekten bietet, die ein praktisches Werkzeug zur Erleichterung der Interaktionsstudien zwischen Insekten und Darmbakterien ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31971663) und dem Young Elite Scientists Sponsorship Program von CAST (2020QNRC001) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
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