Summary
도끼 곤충을 얻기 위해 달걀 표면을 살균하고 부화 한 유충은 도끼 잎을 사용하여 사육됩니다. 이 방법은 항생제를 투여하거나 다른 잎을 먹는 곤충에도 적용 할 수있는 인공 식단을 개발하지 않고도 축산 곤충 준비를위한 효율적인 방법을 제공합니다.
Abstract
곤충 내장은 숙주의 생리적 특성에 심각한 영향을 줄 수있는 다양한 박테리아에 의해 식민지화됩니다. 특정 박테리아 균주를 축삭 곤충에 도입하는 것은 장내 미생물 기능을 검증하고 장내 미생물 - 숙주 상호 작용의 기초가되는 메커니즘을 밝히는 강력한 방법입니다. 항생제를 투여하거나 달걀 표면을 살균하는 것은 곤충에서 장내 박테리아를 제거하는 데 일반적으로 사용되는 두 가지 방법입니다. 그러나 곤충에 대한 항생제의 잠재적 인 부작용 외에도 이전 연구에 따르면 항생제를 먹이면 장내 박테리아를 제거 할 수 없다는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 세균이없는 인공 식단은 일반적으로 도끼 곤충을 유지하기 위해 사용되며, 이는 자연 식품의 영양 성분과 완전히 닮을 수없는 지루하고 노동 집약적 인 과정입니다. 여기에 설명 된 것은 잎 딱정벌레 (Plagiodera versicolora)의 축삭 유충을 준비하고 유지하기위한 효율적이고 간단한 프로토콜입니다. 특히, 딱정벌레 알의 표면은 멸균되었고, 그 다음에 세균이없는 포플러 잎이 도끼 유충을 후방하는 데 사용되었습니다. 곤충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 추가로 확인되었다. 종합적으로, 계란 소독과 무균 재배를 결합함으로써, 축삭 P. versicolora를 얻기 위해 효율적이고 편리한 방법이 개발되어 다른 잎을 먹는 곤충에게 쉽게 옮길 수있는 도구를 제공했습니다.
Introduction
포유류와 마찬가지로, 곤충 소화관은 음식 소화 및 흡수를위한 공동입니다. 대부분의 곤충은 내장에서 번성하고 숙주1이 제공하는 영양에 따라 사는 다양한 공생 박테리아를 가지고 있습니다. 장내 공생 공동체는 음식 소화 및 해독 2,3,4, 영양 및 개발 5,6,7, 병원균 및 기생충에 대한 방어 8,9,10,11, 화학 통신 12,13 및 행동 14를 포함하여 곤충의 여러 생리 과정에 중대한 영향을 미칩니다. ,15. 흥미롭게도, 일부 장내 미생물은 병원성이거나 병원균을 침범하여 감염을 악화시킴으로써 조작 될 수 있으며, 이는 장내 박테리아가 어떤 경우에는 해로울 수 있음을 나타냅니다16,17,18. 장내 박테리아는 또한 생명 공학 응용 및 해충 관리를위한 미생물 자원 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식물과 자일로파고우스 곤충으로부터의 리그노셀룰로오스-소화 박테리아는 바이오 연료(19)를 개발하기 위해 식물 세포를 소화하는데 사용되었다. 생리 활성 분자를 발현하는 조작 된 장 공생 물질의 분산은 유익한 곤충22의 적합성을 향상시키는 데 사용될 수있는 전염병 19,20,21을 전염시키는 농업 및 임업 해충 및 모기를 관리하기위한 새롭고 유망한 전술입니다. 따라서 장내 박테리아가 생체 내에서 어떻게 행동하는지 보여주는 것은 그 기능을 완전히 활용하고 다양한 응용 분야에 더 많이 활용하는 우선 순위로 간주됩니다.
동물은 장 1에 1 ~ >1000 종의 공생 미생물 종을 보유 할 수있습니다. 결과적으로, 개별 박테리아 탁사 또는 그들의 조립이 동물 내부에서 어떻게 수행되는지, 그리고 숙주 또는 그 미생물 파트너가 특정 기능을 구동하는지 여부를 정확하게 검증하는 것은 어렵다. 따라서 박테리아 기능과 곤충23과의 상호 작용을 조사하기 위해서는 모노 - 또는 다종 식민지화에 의해 gnotobiotic 곤충을 얻기 위해 축산 유충을 준비하는 것이 필요합니다. 현재 항생제 칵테일을 투여하고 곤충 알의 표면을 살균하는 것은 장내 박테리아14,24,25,26을 제거하는 일반적인 방법입니다. 그러나 항생제 식단은 장내 박테리아를 완전히 제거 할 수 없으며 숙주 곤충 생리학27,28에 부정적인 영향을 미칩니다. 결과적으로, 항생제 처리 곤충의 사용은 일부 장내 박테리아의 진정한 능력을 흐릴 수 있습니다. 다행히도 계란의 표면 살균은이 문제23,29를 무효화 할 수 있으며, 실험 곤충에는 아무런 영향을 미치지 않거나 무시할 수 있습니다. 또한, 인공 식단은 천연 곤충 식품과 완전히 유사 할 수 없으며, 인공 식단을 개발하는 것은 비용이 많이 들고 노동 소모적 인 과정30,31입니다.
버드 나무 잎 딱정벌레 인 Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera : Chrysomelidae)는 버드 나무 (Salix)와 포플러 (Populus L.)와 같은 소금기가있는 나무를 주로 먹는 광범위한 잎 먹는 해충입니다. 32,33. 여기서, 버드나무 잎 딱정벌레는 세균이 없는 곤충을 제조하고 후방하기 위한 프로토콜을 개발하기 위해 대표적인 잎을 먹는 곤충으로 사용되었다. 우리는 식물 조직 배양을 활용하여 멸균 된 알에서 P. versicolora axenic 유충을 후방으로 옮기기 위해 세균이없는 포플러 잎을 얻었습니다. P. versicolora 유충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 검증되었다. 이 프로토콜은 인공 식단으로 곤충을 기르는 것보다 야생 상태를 더 잘 모방 한 도끼 곤충을 유지할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 방법은 매우 저렴한 비용으로 편리하며, 이는 미래의 곤충 - 장내 미생물 상호 작용 연구, 특히 잘 발달 된 인공 식단이없는 비 모델 곤충의 경우 축삭 곤충을 얻을 수있는 가능성을 높입니다.
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Protocol
1. 곤충 사육
- P. versicolora 개체군을 27 °C 및 70 ± 5 % 상대 습도의 조건에서 성장 챔버에 유지하고 16 h 빛 / 8 시간 어둠의 광주기로 유지하십시오. 타일 젖은 흡수 종이가있는 구멍이 뚫린 플라스틱 상자에 넣고 신선한 포플러 가지를 먹이십시오. 흡수 용지에 깨끗한 물을 뿌려 수분을 유지하고 이틀마다 가지를 바꿉니다.
- 번식 후 산란을 위해 성인을 격리하십시오. 더 많은 알을 얻기 위해 부드러운 잎을 먹이십시오.
- 새로 낳은 알을 모으십시오 (24 시간 이내). 축 유충을 준비하기 위해 60 시간 동안 촉촉한 흡수 종이에 알을 놓습니다.
참고 : 새로 낳은 알은 ~ 72 시간 후에 부화 할 것입니다. 계란 표면을 살균하는 가장 좋은시기는 부화 전날입니다. 그렇지 않으면 성공적으로 부화 한 알의 수가 줄어 듭니다.
2. 세균 없는 포플러 배양
- Murashige and Skoog (MS) 배지와 1 mg/mL α-나프탈렌 아세트산(NAA) 원액을 준비 하십시오(물자 표 참조).
- 생물 안전 후드에서 1 mg / mL NAA 원액 50 μL를 MS 배지 500 mL에 넣고 잘 섞어서 흔들어 조직 배양 용기 당 ~ 50 mL를 부어 응고를 기다립니다.
- 메스, 알코올 램프 및 포셉을 준비하십시오. 생물 안전 후드의 알코올 램프 불꽃에서 메스와 포셉을 살균하십시오.
- ~ 1 개월의 성장 (세균이없는 조직 배양 묘목)에서 포플러 묘목에서 정점 새싹 또는 측면 새싹이있는 3-4cm 줄기 세그먼트를 자르고 용기 당 하나 또는 두 개의 줄기 세그먼트 인 배양 배지에 삽입하십시오.
- 이들 줄기 세그먼트를 25°C의 성장 챔버 및 50 ± 10 cd 광의 세기로 약 30일 동안 16 h 광/8 h 어둠의 광주기로 인큐베이션한다. 세균이없는 잎을 사용하여 도끼 애벌레에게 먹이를줍니다.
3. 계란 표면 살균 및 도끼 유충 사육
- 오토클레이브 페트리 요리, 페인트 브러시, 여과지, 증류수 및 LB (Luria-Bertani) 한천 배지가 들어있는 페트리 접시.
- 부착성 계란이있는 잎을 페트리 접시에 넣고 포셉을 사용하여 잎에서 계란을 조심스럽게 제거한 다음 다른 페트리 접시로 옮깁니다.
참고 :이 단계는 계란이 잎에 부착되어 있기 때문에 매우 조심스럽게 수행해야합니다. - 이 달걀을 75 % 에탄올로 8 분 동안 씻고 멸균수로 네 번 씻기를 반복하십시오.
- 부화를 위해 수분을 보존하기 위해 알을 LB 한천 배지로 옮깁니다.
참고 : LB 한천 배지를 사용하면 소독 된 난자가 세균이 없는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. - Petri 접시를 성장 챔버에 놓고 계란이 24 시간 이내에 부화 할 때까지 기다리십시오.
- 생물 안전 후드에서 페트리 접시에 젖은 여과지 세 조각을 타일링하고 종이에 세균이없는 포플러 잎을 놓고 유충을 모아서 나뭇잎에 놓고 파라 필름으로 페트리 접시를 밀봉 한 다음 27 ° C 및 70 ± 5 % 상대 습도의 성장 챔버에서 16 시간 빛 / 8 시간 어둠의 광주기로 배양하십시오.
참고 : 조직 배양 잎은 섬세하며 물을 빨리 잃을 수 있습니다. 따라서 잎을 페트리 접시로 옮길 때 촉촉한 여과지를 사용해야합니다. - 이틀마다 잎을 바꿉니다.
- 전통적으로 사육 된 그룹의 경우, 잎에서 젖은 여과지가 들어있는 페트리 접시로 알을 옮기고이 애벌레에게 세균이없는 포플러 잎을 먹이십시오.
4. 배양 의존성 분석을 통한 축산 유충의 검증
- 무작위로 3 개의 1st, 2nd 및 3번째 instar 유충을 세균이없고 전통적으로 사육 된 그룹에서 선택하십시오.
- 입체 현미경으로 멸균 된 가위와 포셉으로 3번째 인스타 유충을 해부하고 마이크로 원심 분리기 튜브에 내장을 수집하십시오. 튜브에 손상되지 않은 1번째와 2번째 인스타 유충을 수집하십시오.
참고 : 해부하기에는 너무 작기 때문에 1번째와 2번째 인스타 유충 전체를 수집하고 내장을 그대로 유지하십시오. - 100 μL의 인산염 완충 식염수와 세 개의 스틸 볼을 1.5 mL 튜브에 첨가하고, 비드 비트 호모게나이저를 사용하여 조직을 균질액으로 분쇄한다.
- 100 μL의 균질액을 LB 한천 배지 및 플레이트에 멸균 유리 확산 막대를 사용하여 첨가한다.
- 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 놓고 박테리아 콜로니를 관찰하였다.
5. 문화 독립적 인 분석을 통한 도끼 개인의 검증
- DNA 추출 키트를 사용하여 조직(섹션 4에서 수득됨)의 총 DNA를 추출한다.
- 260nm에서 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
- 박테리아 16S rRNA 유전자를 PCR과 함께 유니버셜 16S rRNA 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 반응 시스템을 18 μL의 1.1x PCR 마스터 믹스 ( 물질의 표 참조), 0.5 μL의 27F 프라이머 (5'-ACGGATACCTTTTTTTACGAC-3'), 0.5 μL의 1495R 프라이머 (5'-ACGGATACCTTTTTTTACGAC-3') 및 100 ng 주형 DNA로 설정한다. PCR 조건을 95°C에서 3분 동안 설정하고; 30초 동안 95°C, 1분 동안 55°C, 및 1분 동안 72°C의 28 사이클; 이어서 72°C에서 10분 동안 반응시켰다. PCR 산물을 추가 분석될 때까지 4°C에서 보관한다.
- PCR 산물을 핵산 염료와 혼합하고, 1x TAE 완충액의 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 사용하여 분석한다. 10 μL의 DNA 마커를 참조로 사용한다.
- UV 트랜스 조명기로 젤을 관찰하고 약 1,500 bp의 표적 단편을 찾으십시오.
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Representative Results
P. versicolora의 수명 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 성인 남성은 성인 여성보다 작습니다(그림 1A). 들판에서, 딱정벌레는 잎에 알을 모은다. 여기에서는 잎에서 네 개의 알을 떼어냈다(그림 1B). 도끼 곤충 사육에 사용되는 포플러 줄기 세그먼트와 묘목은 그림 2에 나와 있습니다. 3번째 인스타 유충의 내장은 그림 3에 나와 있으며 장 세그먼트는 흰색 브래킷으로 표시되어 있습니다.
어떠한 세균 군에서도 박테리아 콜로니가 관찰되지 않았지만, 이들은 통상적으로 사육된 모든 그룹에서 관찰되었으며(그림 4), 이는 조직 배양된 포플러 잎을 먹인 멸균된 알의 유충에 박테리아가 포함되어 있지 않음을 나타낸다. ~1,500 bp PCR 밴드가 모든 통상적으로 사육된 그룹에서 나타났다. 대조적으로, 무세균 그룹 또는 음성 대조군에서는 밴드가 관찰되지 않았으며(그림 5), 이는 도끼 유충에 장내 박테리아가 존재하지 않음을 암시한다. 유충 발달 시간, 생존율 또는 세균이없는 유충과 전통적으로 사육 된 P. versicolora 유충 사이의 출현에는 차이가 없었습니다. 그러나 세균이없는 유충의 체질량은 5일째 에 전통적으로 사육 된 유충의 체질량보다 약간 높았지만 번식16 전과 비슷해질 것입니다. 이러한 결과는 축삭 유충을 준비하고 후방하기 위해이 프로토콜의 타당성을 확인했습니다.
그림 1 : 버드 나무 잎 딱정벌레, Plagiodera versicolora의 생활 단계. (A) 여성 및 남성 성인; (b) 계란; (c)1st 인스타 유충; (D) 제 2인스타 유충; (e) 제 3인스타 유충; 및 (F) 번데기. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 포플러 줄기 세그먼트와 묘목. (A) 정점 새싹이있는 줄기 세그먼트; (b) 줄기 분절은 10일 후에 뿌리를 성장시키고; (C) 한 달 된 묘목. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세 번째 인스타 유충의 내장. Foregut, midgut 및 hindgut는 괄호로 표시되어 있습니다. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LB 한천 플레이트에서 장내 또는 전체 곤충 균질물을 배양하여 장내 박테리아 제거 효능 확인. 세균이없는 포플러 잎을 먹인 유충에서는 박테리아가 관찰되지 않았지만 박테리아는 전통적으로 사육 된 그룹에서 관찰되었습니다. 1번째, 2 번째 및 3번째 인스타 유충을 분석에 사용하였다. 각 그룹에서 세 마리의 유충을 무작위로 선택하였다. 약어: GF = 무균 유충; CR = 전통적으로 사육 된 애벌레. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 유니버셜 16S rRNA 유전자 프라이머를 이용한 PCR 분석법에 의한 장내 세균 제거 효능의 확인. 16S rRNA 유전자의 표적 밴드는 ∼1,500 bp. 1st, 2nd, 및 3rd instar 유충을 분석에 사용하였다. GF 그룹에서는 표적 밴드가 관찰되지 않았다. 약어: NC = 음성 대조군; GF = 세균 무함유; CR = 통상적으로 양육됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세균이 없는 유충을 제조하고 특정 박테리아 균주를 재도입하여 gnotobiotic 유충을 얻는 것은 숙주-미생물 상호작용의 기초가 되는 기전을 밝히는 강력한 방법이다. 새로 부화 한 유충은 두 가지 주요 방법으로 장내 미생물을 얻습니다 : 어머니로부터 자손으로의 수직 전달 또는 형제 자매와 환경으로부터의 수평 획득34. 전자는 난자 표면(35)의 오염을 통해 자손에게 부모를 옮기는 것에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 곤충 달걀 표면27,28,29를 살균하여 축 유충을 얻는 것은 매우 실현 가능하다. 여러 항생제의 칵테일을 투여하는 것은 도끼 곤충을 개발하는 또 다른 방법이지만 몇 가지 단점이 있습니다28. 대조적으로, 도끼 식단에 이어 계란 표면 살균은 축 곤충23,28,29을 개발하는 데 더 좋습니다.
대부분의 잎을 소비하는 딱정벌레의 알은 눈에 띄고 쉽게 획득되며 소독이 간단합니다. 이것이 유사한 연구에 비해 소독에 간단한 시약 (75 % 에탄올)과 더 짧은 시간 (8 분)이 사용 된 주된 이유입니다 (예 : 악취 벌레 Plautia stali에 대한 계란 소독 75 % 에탄올과 포름 알데히드를 사용하여 도끼 곤충을 얻는 것; 1 % 활성 염소와 75 % 에탄올로 초파리의 계란 표면 살균 6 분; 10 % 차아 염소산 나트륨으로 붉은 야자 바구미 Rhynchophorus ferrugineus의 계란 표면 살균 10 분; 해결책)23,29,36. 작은 알을 가진 곤충 종의 경우, 치료가 결과에 큰 영향을 줄 수 있으므로 소독기 사용 및 살균 기간을 최적화해야합니다.
어떤 경우에는 무균 인공 식단이 계란 표면 살균 후 도끼 곤충 사육에 사용됩니다29,37. 그러나 곤충에 적합한 인공 식단을 개발하는 것은 지루하고 노동 소비가 많은 과정입니다. 식이 요법의 영양소는 곤충 생리학 (예 : 개발 시간, 면역)과 장내 미생물 6,35에 광범위하게 영향을 미칩니다. 따라서, 곤충에 대한 자격을 갖춘 인공 식단은 천연 식품과 유사한 영양 성분을 함유해야하며, 이는 특히 phytophagous 곤충의 경우 달성하기 어렵습니다. 이 프로토콜에서 우리는 곤충에게 인공 식단의 단점을 극복하는 축산 숙주 식물을 먹였습니다. 중요하게는, 여기에 사용된 포플러 식물과 마찬가지로, 종자 표면 살균 또는 줄기 부분 소독(38)에 의해 담배, 감자, 토마토, 밀 및 쌀과 같은 많은 경제적으로 중요한 작물로부터 조직 배양된 묘목을 얻는 것도 어렵지 않다. 참고로, 식물의 내피는 조직 배양 묘목(39)에 존재할 수 있고, 싹팁(meristem) 배양 기술(40)을 통해 제거될 수 있다. 결론적으로,이 프로토콜은 곤충 - 장내 박테리아 상호 작용 연구를 용이하게하는 편리한 도구 인 세균이없는 곤충을 유지하는 새로운 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31971663)과 CAST (2020QNRC001)의 젊은 엘리트 과학자 후원 프로그램이 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
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