Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63195
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

Abstract

מעיים של חרקים מיושבים על ידי חיידקים מגוונים שיכולים להשפיע באופן עמוק על התכונות הפיזיולוגיות של הפונדקאי. החדרת זן חיידקי מסוים לחרק אקסני היא שיטה רבת עוצמה לאימות תפקוד המיקרוביאלי של המעיים ולהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין חיידקי המעיים לפונדקאי. מתן אנטיביוטיקה או עיקור משטחי ביצים הן שתי שיטות נפוצות להסרת חיידקי מעיים מחרקים. עם זאת, בנוסף להשפעות השליליות הפוטנציאליות של אנטיביוטיקה על חרקים, מחקרים קודמים הצביעו על כך שהאכלת אנטיביוטיקה לא יכולה לחסל את חיידקי המעיים. לפיכך, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות בדרך כלל לשמירה על חרקים אקסניים, שהוא תהליך מייגע ועתיר עבודה שאינו יכול להידמות באופן מלא למרכיבים תזונתיים במזון טבעי. מתואר כאן פרוטוקול יעיל ופשוט להכנה ותחזוקה של זחלים אקסניים של חיפושית עלים (Plagiodera versicolora). באופן ספציפי, משטחים של ביצי החיפושית עוקרו, ולאחר מכן עלי צפצפה נטולי חיידקים שימשו לגידול זחלים אקסניים. מעמדם האקסני של החרקים אושש עוד יותר באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. באופן קולקטיבי, על ידי שילוב של חיטוי ביצים וטיפוח ללא חיידקים, פותחה שיטה יעילה ונוחה להשגת P. versicolora אקסני, המספקת כלי הניתן להעברה בקלות לחרקים אוכלי עלים אחרים.

Introduction

בדומה ליונקים, מערכת העיכול של החרקים היא חלל לעיכול המזון ולספיגתו. רוב החרקים מכילים חיידקים קומנסליים מגוונים שמשגשגים במעיים שלהם וחיים על תזונה המסופקת על ידי פונדקאים1. לקהילת המעיים יש השפעה עמוקה על תהליכים פיזיולוגיים מרובים בחרקים, כולל עיכול מזון וניקוי רעלים 2,3,4, תזונה והתפתחות 5,6,7, הגנה מפני פתוגנים וטפילים 8,9,10,11, תקשורת כימית 12,13 והתנהגויות14 ,15. באופן מסקרן, מיקרוביוטה מסוימת של המעיים יכולה להיות פתוגנית מבחינה פקולטטיבית או להיות מתומרנת על ידי פלישה לפתוגנים כדי להחמיר את הזיהום, מה שמצביע על כך שחיידקי המעיים עלולים להזיק במקרים מסוימיםל-16,17,18. חיידקי המעיים יכולים גם לשמש משאב מיקרוביאלי ליישומים ביוטכניים ולהדברת מזיקים. לדוגמה, חיידקים מעכלי ליגנוצלולוז מחרקים פיטופגוסים וקסילופגוסים שימשו לעיכול תאים צמחיים לפיתוח דלקים ביולוגיים19. פיזורם של סימביונטים מהונדסים במעיים המבטאים מולקולות ביו-אקטיביות הוא טקטיקה חדשנית ומבטיחה לניהול מזיקים חקלאיים וייעוריים ויתושים המשדרים מחלות זיהומיות 19,20,21, שניתן להשתמש בהן גם כדי לשפר את כושרם של חרקים מועילים 22. המחשת האופן שבו חיידק מעיים מתנהג ב-in vivo נחשבת אפוא לעדיפות למנף את תפקודו באופן מלא ולנצל אותו עוד יותר ליישומים שונים.

בעלי חיים יכולים להכיל 1 עד >1000 מינים מיקרוביאליים סימביוטיים במעיים1. כתוצאה מכך, קשה לאמת במדויק כיצד טקסונים חיידקיים בודדים או הרכבתם מתפקדים בתוך בעל חיים, והאם הפונדקאי או שותפיו המיקרוביאליים מניעים פונקציה מסוימת. לכן, הכנת זחלים אקסניים להשגת חרקים גנוטוביוטים על ידי התיישבות חד-מינית או מרובת מינים נחוצה כדי לחקור את תפקוד החיידקים ואת האינטראקציה עם חרקים23. כיום, מתן קוקטיילים אנטיביוטיים ועיקור פני השטח של ביצי חרקים הן שיטות נפוצות להסרת חיידקי המעיים 14,24,25,26. עם זאת, דיאטות אנטיביוטיות אינן יכולות לחסל לחלוטין את חיידקי המעיים ולהשפיע לרעה על הפיזיולוגיה של החרקים המארחים27,28. כתוצאה מכך, השימוש בחרקים שטופלו באנטיביוטיקה עלול לטשטש את היכולות האמיתיות של חלק מחיידקי המעיים. למרבה המזל, עיקור פני השטח של ביצים יכול לשלול את הבעיה הזו23,29, שאין לה השפעות או זניחות על חרקים ניסיוניים. יתר על כן, תזונה מלאכותית אינה יכולה להידמות באופן מלא למזון חרקים טבעי, ופיתוח תזונה מלאכותית הוא תהליך יקר וצורך עבודה30,31.

חיפושית עלי הערבה, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), היא מזיקה אוכלת עלים נפוצה הניזונה בעיקר מעצים סלעיים, כגון ערבות (Salix) וצפצפה (Populus L.) 32,33. כאן, חיפושית עלי הערבה שימשה כחרק אוכל עלים מייצג כדי לפתח פרוטוקול להכנה וגידול של חרק ללא חיידקים. ניצלנו את תרבית הרקמה הצמחית כדי להשיג עלי צפצפה נטולי חיידקים כדי לגדל זחלים אקסניים מסוג P. versicolora מביצים מעוקרות. הסטטוס האקסני של זחלי P. versicolora אומת באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. פרוטוקול זה יכול לשמור על חרקים אקסניים המחקים טוב יותר את המצב הפראי מאשר גידול חרקים עם תזונה מלאכותית. חשוב מכך, שיטה זו נוחה בעלות נמוכה מאוד, מה שמגדיל את ההיתכנות של השגת חרקים אקסניים למחקרי אינטראקציה עתידיים בין חרקים למעי מיקרוביוטה, במיוחד עבור חרקים שאינם מודלים ללא תזונה מלאכותית מפותחת היטב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גידול חרקים

  1. שמור על אוכלוסיית P. versicolora בתא גידול במצב של 27 ° C ו 70 ± 5% לחות יחסית עם photoperiod של 16 שעות בהיר / 8 שעות כהה. מניחים אותם בקופסאות פלסטיק מחוררות עם נייר סופג רטוב מרוצף אריחים ומזינים אותם בענפי צפצפה טריים. מרססים מים נקיים על נייר סופג כדי לשמור על הלחות ולהחליף את הענפים כל יומיים.
  2. לבודד מבוגרים עבור oviposition לאחר הגור. האכילו אותם בעלים רכים כדי להשיג יותר ביצים.
  3. אספו ביצים שהוטלו לאחרונה (תוך 24 שעות). מניחים את הביצים על נייר סופג לח במשך 60 שעות כדי להכין זחלים אקסניים.
    הערה: ביצים שהוטלו לאחרונה יבקעו לאחר ~ 72 שעות. הזמן הטוב ביותר לעקר משטחי ביצים הוא יום לפני הבקיעה; אחרת, מספר הביצים שבקעו בהצלחה יקטן.

2. תרבות צפצפה ללא חיידקים

  1. הכן תמיסות מלאי בינוניות של Murashige ו-Skoog (MS) ו-1 מ"ג/מ"ל α-נפטלין חומצה אצטית (NAA) (ראו טבלת החומרים).
  2. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, מוסיפים 50 μL של תמיסת NAA של 1 מ"ג/מ"ל ל-500 מ"ל ל-500 מ"ל של מדיום טרשת נפוצה, מנערים כדי לערבב היטב, ויוצקים כ-50 מ"ל לכל מיכל תרבית רקמה ומחכים להתמצקות.
  3. להכין אזמלים, מנורת אלכוהול ומלקחיים; לעקר את האזמלים והמלקחיים בלהבת מנורת האלכוהול במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
  4. חותכים מקטעי גזע בקוטר 3-4 ס"מ עם ניצני אפיקל או ניצנים לרוחב משתילי צפצפה בצמיחה של כחודש אחד (שתילים בתרבית רקמה ללא נבט), ומכניסים אותם למדיום התרבית, מקטע גזע אחד או שניים לכל מיכל.
  5. דגירה של מקטעי גזע אלה בתא צמיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-50 ± 10 cd עוצמת אור עם פוטופריוד של 16 שעות אור/8 שעות חושך למשך כ-30 יום. השתמשו בעלים נטולי הנבטים כדי להזין את הזחלים האקסניים.

3. עיקור פני הביצה וגידול זחלים אקסניים

  1. כלי פטרי אוטוקלאב, מכחולים, נייר פילטר, מים מזוקקים וצלחת פטרי המכילה מדיום אגר LB (לוריא-ברטאני).
  2. מניחים עלים עם ביצים דביקות בצלחת פטרי, מסירים בזהירות את הביצים מהעלים באמצעות מלקחיים, ומעבירים אותם לצלחת פטרי אחרת.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות רבה מכיוון שהביצים דבקות בעלים.
  3. לשטוף את הביצים האלה עם 75% אתנול במשך 8 דקות, ולחזור על לשטוף ארבע פעמים עם מים סטריליים.
  4. מעבירים את הביצים למדיום אגר LB כדי לשמר את הלחות לבקיעה.
    הערה: שימוש במדיום אגר LB יכול לעזור לוודא אם הביצה המחויטת נקייה מחיידקים.
  5. מניחים את צלחת הפטרי בתא גידול ומחכים שהביצים יבקעו תוך 24 שעות.
  6. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, מרצפים שלוש פיסות נייר מסנן רטוב בצלחת פטרי, מניחים עלי צפצפה נטולי חיידקים על הנייר, אוספים את הזחלים ומניחים אותם על העלים, אוטמים את צלחת הפטרי בפרפילם, ודוגרים אותם בתא צמיחה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו-70 ± 5% לחות יחסית עם פוטופריוד של 16 שעות אור/8 שעות כהה.
    הערה: העלים מתרבית הרקמה עדינים ועלולים לאבד מים במהירות. לכן, שימוש בנייר מסנן לח הוא הכרחי בעת העברת העלים לצלחת פטרי.
  7. החליפו את העלים כל יומיים.
  8. עבור הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי, מעבירים את הביצים מהעלים לצלחת פטרי המכילה נייר סינון לח ומאכילים את הזחלים האלה בעלי צפצפה נטולי חיידקים.

4. אימות של זחלים אקסניים באמצעות מבחנים תלויי תרבות

  1. בחרו באופן אקראי שלושה זחלי 1st, 2nd ו-3rd instar מתוך הקבוצות נטולות הנבטים והמגודלות באופן קונבנציונלי.
  2. נתחו את הזחליםה-3 עם מספריים ומלקחיים סטריליים מתחת לסטריאומיקרוסקופ ואספו את המעיים שלהם בצינורות מיקרו-סנטריפוג'. לאסוף שלם 1st ו 2nd instar זחלים בצינורות.
    הערה: אסוף זחלים שלמים של 1st ו-2 nd nd instar מכיוון שהם קטנים מכדי לנתח אותם, ולשמור על המעיים שלהם שלמים.
  3. הוסיפו 100 μL של מי מלח עם מאגר פוספט ושלושה כדורי פלדה לצינורות של 1.5 מ"ל וטוחנים את הרקמות להומוגנטים באמצעות הומוגנייזר מכה חרוזים.
  4. הוסיפו 100 μL של הומוגנט למדיום אגר LB וצלחת באמצעות מוט התפשטות זכוכית סטרילי.
  5. הניחו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות והתבוננו במושבות החיידקים.

5. אימות של אנשים אקסניים עם מבחנים שאינם תלויים בתרבות

  1. מחלצים את סך הדנ"א של הרקמות (המתקבל בסעיף 4) באמצעות ערכת מיצוי DNA.
  2. מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר.
  3. הגבר את הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות פריימרים אוניברסליים של 16S rRNA עם PCR. הגדר את מערכת התגובה עם 18 μL של תערובת מאסטר PCR של 1.1x (ראה טבלת החומרים), 0.5 μL של פריימר 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0.5 μL של פריימר 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') ודנ"א של תבנית 100 ng. הגדר את תנאי ה- PCR ב- 95 ° C למשך 3 דקות; 28 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס לדקה אחת, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אחסן את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
  4. מערבבים את מוצרי ה-PCR עם צבע חומצת גרעין ומנתחים אותם באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% ב-1x TAE buffer. השתמש ב- 10 μL של סמן DNA כאסמכתא.
  5. שימו לב לג'ל עם טרנסילומינטור UV וחפשו את שבר המטרה בסביבות 1,500 bp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלבי החיים של P. versicolora מוצגים באיור 1. הזכר הבוגר קטן יותר מהנקבה הבוגרת (איור 1A). בשדה, החיפושית מקבצת את ביציה על עלה; כאן, ארבע ביצים נותקו מעלה (איור 1B). מקטעי גזע הצפצפה והשתילים המשמשים לגידול חרקים אקסניים מוצגים באיור 2. המעיים של זחל כוכבשלישי מוצגים באיור 3, ומקטעי המעיים מסומנים בסוגריים לבנים.

אף על פי שלא נצפו מושבות חיידקים בשום קבוצה נטולת חיידקים, הן נצפו בכל הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי (איור 4), מה שמצביע על כך שזחלים מביצים מעוקרות שניזונו מעלי צפצפה בתרבית רקמה אינם מכילים חיידקים. רצועות ה-PCR של כ-1,500 bp הופיעו בכל הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי. לעומת זאת, לא נצפתה רצועה בקבוצות נטולות הנבטים או בשליטה השלילית (איור 5), מה שמרמז על כך שלא היו חיידקי מעיים בזחלים אקסניים. לא היו הבדלים בזמן התפתחות הזחל, בקצב ההישרדות או במראה בין זחלי P. versicolora נטולי חיידקים לבין זחלי P. versicolora שגודלו באופן קונבנציונלי. עם זאת, מסת הגוף של זחלים נטולי חיידקים הייתה מעט גבוהה יותר מזו של זחלים שגודלו באופן קונבנציונלי ביוםהחמישי , אם כי המסות יהפכו דומות לפני הגור16. תוצאות אלה אישרו את ההיתכנות של פרוטוקול זה להכין ולעורר זחלים אקסניים.

Figure 1
איור 1: שלבי החיים של חיפושית עלי הערבה, Plagiodera versicolora. (A) בוגרים נקביים וזכריים; (ב) ביצים; (ג) זחל כוכברחוב 1; (ד) זחל הכוכבהשני ; (E) זחל כוכבשלישי ; ו-(ו) גולם. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מקטעי גזע צפצפה ושתילים. (B) מקטעי גזע הצמיחו שורשים לאחר 10 ימים; (ג) שתיל בן חודש. סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: המעיים של זחל כוכב שלישי. Foregut, midgut ו- hindgut מסומנים בסוגריים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אישור היעילות של חיסול חיידקי המעיים על ידי גידול המעיים או הומוגנטים של חרקים שלמים על צלחות אגר LB. לא נצפו חיידקים בעלי צפצפה נטולי חיידקים שניזונו מזחלים, בעוד שחיידקים נצפו בקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי. זחלי 1 st, 2nd ו-3rd instar שימשו לבדיקה. שלושה זחלים נבחרו באקראי בכל קבוצה. קיצורים: GF = זחלים נטולי חיידקים; CR = זחלים מגודלים באופן קונבנציונלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: אישור ליעילות של חיסול חיידקי המעיים על ידי בדיקת PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של גנים 16S rRNA. רצועת המטרה של הגן 16S rRNA היא כ-1,500 bp. זחלי 1st, 2nd ו-3 rd instar שימשו לבדיקה. לא נצפתה להקת מטרה בקבוצות ה-GF. קיצורים: NC = שליטה שלילית; GF = ללא חיידקים; CR = מגודל באופן קונבנציונלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת זחלים נטולי חיידקים והשגת זחלים גנוטוביוטים על ידי הכנסה מחדש של זני חיידקים ספציפיים הן שיטות רבות עוצמה להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין פונדקאי למיקרובים. זחלים שזה עתה בקעו משיגים מיקרוביוטה של המעיים בשתי דרכים עיקריות: העברה אנכית מהאם לצאצאים או רכישה אופקית מאחיהם ומסביב34. הראשון יכול להתממש על ידי העברה הורית לצאצאים באמצעות זיהום של פני הביצה35. לפיכך, ניתן מאוד להשיג זחלים אקסניים על ידי עיקור משטחי ביצי חרקים 27,28,29. מתן קוקטייל של כמה אנטיביוטיקות הוא דרך נוספת לפתח חרקים אקסניים אבל יש לו כמה חסרונות28. לעומת זאת, עיקור פני השטח של הביציות ואחריו תזונה אקסנית עדיף על פיתוח חרקים אקסניים 23,28,29.

הביציות של רוב החיפושיות הצורכות עלים נראות לעין, נרכשות בקלות ופשוטות לחיטוי. זו הסיבה העיקרית לכך שריאגנט פשוט (75% אתנול) וזמן קצר יותר (8 דקות) שימשו לחיטוי בהשוואה למחקרים דומים (למשל, 40 דקות של חיטוי ביצים עבור stinkbug Plautia stali עם 75% אתנול ופורמלדהיד כדי להשיג חרקים אקסניים; 6 דקות של עיקור פני השטח של הביצה של דרוזופילה עם 1% כלור פעיל ו-75% אתנול; ו-10 דקות של עיקור פני השטח של הביצה של דקל אדום Rhynchophorus ferrugineus עם 10% נתרן היפוכלוריט פתרון)23,29,36. עבור מיני חרקים עם ביצים זעירות, השימוש בחומרי חיטוי ומשך העיקור צריכים להיות מותאמים מכיוון שהטיפול יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות.

במקרים מסוימים, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות לגידול חרקים אקסניים לאחר עיקור פני הביצה29,37. עם זאת, פיתוח תזונה מלאכותית מתאימה לחרקים הוא תהליך מייגע וצורך עבודה. חומרים מזינים בתזונה משפיעים באופן נרחב על הפיזיולוגיה של החרקים (למשל, זמן התפתחות, חסינות) ועל המיקרוביוטה שלהמעיים 6,35. לפיכך, תזונה מלאכותית מוסמכת לחרק צריכה להכיל הרכב תזונתי דומה למזון הטבעי, שקשה להשיג, במיוחד עבור חרקים phytophagous. בפרוטוקול זה, האכלנו חרקים בצמחים מארחים אקסניים, המתגברים על החסרונות של תזונה מלאכותית. חשוב לציין שכמו בצמח הצפצפה המשמש כאן, גם לא קשה להשיג שתילים בתרבית רקמה מגידולים רבים בעלי חשיבות כלכלית כגון טבק, תפוח אדמה, עגבנייה, חיטה ואורז על ידי עיקור משטח זרעים או חיטוי חלקי גזע38. יש לציין כי אנדופיטים בצמחים עשויים להתקיים בשתילים בתרביתרקמה 39 וניתן לסלקם באמצעות טכנולוגיית תרבית מריסטם קצה יורה40. לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לשמירה על חרקים נטולי חיידקים, שהיא כלי שימושי להקלה על מחקרי אינטראקציה בין חרקים למעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31971663) ותוכנית החסות למדעני עילית צעירים על ידי CAST (2020QNRC001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filters Millipore SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes Sangon Biotech F600620
10x PBS stock solution Biosharp Life Sciences BL302A
2 M KOH solution Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers Shubo sb16455
50 mL sterile syringes Jinta JT0125789
500 mL measuring cylinder Shubo sb1601
50x TAE stock solution a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA) Solarbio Life Sciences 86-87-3
Absorbing paper 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar Coolaber 9002-18-0
Agarose Biowest 111860
Autoclave Panasonic MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer Jing Xin XM-GTL64
DNA extraction kit MP Biomedicals 116560200
EDTA Saiguo Biotech 1340
Filter paper Jiaojie 70 mm diameter
Gel electrophoresis unit Bio-rad 164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye TsingKe TSJ003
Germ-free poplar seedlings Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) TsingKe TSE101
Growth chamber Ruihua HP400GS-C
LB agar medium a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge DRAGONLAB D1008
MS basic medium Coolaber PM1121-50L M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Paintbrush 1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm Bemis PM-996
PCR Thermal Cyclers Eppendorf 6331000076
Petri dishes Supin 90 mm diameter
pH meter METTLER TOLEDO FE20
Pipettes 0.2-2 µL Gilson ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL Eppendorf 3120000267
Pipettes 20-200 µL Eppendorf 3120000259
Pipettes 2-20 µL Eppendorf 3120000232
Plant tissue culture container Chembase ZP21 240 mL
Plastic box 2.35 L
Potassium hydroxide (KOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene Sangon Biotech 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls 0.25 mm used to grind tissues
Stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker Transgene Biotech BM121-01
Tris base Biosharp Life Sciences 1115
Tryptone Thermo Fisher Scientific  LP0037
UV transilluminator Monad Biotech QuickGel 6100
Vortexer Scilogex MX-S
Willow branches Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract Thermo Fisher Scientific LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
  2. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  3. Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
  4. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  5. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  6. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
  7. Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
  8. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  9. Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
  10. Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
  11. Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
  12. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
  13. Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
  14. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  15. Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
  16. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  17. Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
  18. Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
  19. Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
  20. Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
  21. Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
  22. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  23. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
  24. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  25. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  26. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
  27. Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
  28. Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
  30. Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
  31. Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
  32. Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
  33. Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
  34. Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
  35. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
  36. Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
  37. Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
  38. Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).
  39. Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
  40. Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).

Tags

ביולוגיה גיליון 176
הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R.,… More

Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle. J. Vis. Exp. (176), e63195, doi:10.3791/63195 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter