Summary
في هذا البروتوكول ، تمكن النقاط الكمومية المترافقة مع ارتفاع SARS-CoV-2 المؤتلف من الفحوصات القائمة على الخلايا من مراقبة ارتباط السنبلة إلى hACE2 في غشاء البلازما وكثرة الخلايا الداخلية اللاحقة للبروتينات المرتبطة في السيتوبلازم.
Abstract
وقد سهل تطوير تكنولوجيات جديدة للفحص المجهري الفلوري الخلوي طرق الفحص عالية الإنتاجية لاكتشاف الأدوية. النقاط الكمومية هي جسيمات نانوية فلورية ذات خصائص فيزيائية ضوئية ممتازة مشبعة بالتلألؤ الضوئي الساطع والمستقر بالإضافة إلى نطاقات الانبعاثات الضيقة. النقاط الكمومية كروية الشكل ، ومع التعديل المناسب لكيمياء السطح ، يمكن استخدامها لاقتران الجزيئات الحيوية للتطبيقات الخلوية. هذه الخصائص البصرية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على تشغيلها مع الجزيئات الحيوية ، تجعلها أداة ممتازة للتحقيق في التفاعلات بين المستقبلات والروابط والاتجار الخلوي. هنا ، نقدم طريقة تستخدم النقاط الكمومية لتتبع الارتباط و endocytosis من بروتين سبايك SARS-CoV-2. يمكن استخدام هذا البروتوكول كدليل للتجريبيين الذين يتطلعون إلى استخدام النقاط الكمومية لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين والاتجار في سياق علم وظائف الأعضاء الخلوية.
Introduction
يمكن الفحص المجهري الفلوري الباحثين من النظر في الأعمال الداخلية للخلية باستخدام أصباغ متخصصة1 وبروتينات فلورسنت مشفرة وراثيا2 وجسيمات نانوية فلورية في شكل نقاط كمومية (QDs)3. بالنسبة للوباء العالمي لفيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة لعام 2019 (SARS-CoV-2) ، استخدم الباحثون المجهر الفلوري لفهم كيفية تفاعل الفيروس مع الخلية في كل من غشاء البلازما والسيتوبلازم. على سبيل المثال ، تمكن الباحثون من اكتساب رؤى ثاقبة حول ارتباط بروتين SARS-CoV-2 Spike على سطح الفيريون بالإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين 2 (hACE2) على سطح الخلايا البشرية ، والاستيعاب اللاحق عن طريق الاندماج في غشاء البلازما ، وكثرة الخلايا الداخلية لمركب بروتين Spike:hACE24,5. كما تم اكتساب رؤى كبيرة حول خروج SARS-CoV-2 من الخلايا عبر الليزوسوم باستخدام التصوير الفلوري الخلوي، وهي ميزة فريدة من الفيروسات التاجية التي كان يعتقد سابقا أنها تحدث عبر الحويصلة التقليدية الناشئة من غولجي، كما هو الحال مع العديد من الفيروسات الأخرى6. تعد تقنية الفحص المجهري الفلوري الخلوي الدعامة الأساسية لجميع جوانب البحوث البيولوجية تقريبا ، وقد تقدمت بالضرورة في اتساعها ونطاق تطبيقاتها من التصوير فائق الدقة للحيوانات الكاملة إلى التصوير الآلي متعدد المعلمات عالي المحتوى لفحص الأدوية. هنا ، يتم تطبيق المجهر البؤري الآلي عالي المحتوى على دراسة دخول خلايا SARS-CoV-2 باستخدام QDs الفلورية المترافقة مع بروتين سبايك الفيروسي.
يسمح التحليل عالي المحتوى للصور التي تم إنشاؤها بواسطة منصات التصوير البيولوجي باستخراج أكبر للرؤى البيولوجية القيمة من المعلمات الفردية مثل كثافة البئر الكاملة ، والتي يمكن للمرء الحصول عليها باستخدام قارئ لوحة متعدد الوسائط 7. من خلال فصل الكائنات في مجال رؤية باستخدام خوارزميات التجزئة الآلية، يمكن تحليل كل كائن أو مجموعة من الكائنات بحثا عن معلمات مثل الكثافة والمساحة والملمس في كل قناة فلورية متاحة8. يعد الجمع بين العديد من القياسات في مجموعات بيانات متعددة المتغيرات نهجا مفيدا للتنميط المظهري. عندما يكون النمط الظاهري المطلوب معروفا ، مثل استيعاب QD في شكل puncta ، يمكن للمرء استخدام القياسات المتعلقة بالثقب مثل الحجم والعدد والشدة لتقييم فعالية العلاج.
يمكن لبرنامج تحليل التصوير عالي المحتوى المستند إلى السحابة استيعاب مجموعة كبيرة ومتنوعة من مخرجات بيانات الأجهزة ، بما في ذلك منصة التصوير عالية المحتوى. باستخدام خادم قائم على السحابة لتخزين الصور والتحليل عبر الإنترنت ، يمكن للمستخدم تحميل بياناته إما من أداة التصوير أو من محرك أقراص الشبكة حيث يتم تخزين البيانات. يتم إجراء جزء التحليل من البروتوكول داخل بيئة البرامج السحابية ، ويمكن تصدير البيانات في مجموعة متنوعة من تنسيقات الملفات لتصور البيانات النهائية.
يتكون فيروس SARS-CoV-2 من بروتينات غير هيكلية وهيكلية تساعد في تجميعه وتكراره. يحتوي ارتفاع SARS-CoV-2 على مجالين يطلق عليهما S1 و S2 ، حيث يحتوي S1 على مجال ربط المستقبلات المسؤول عن تفاعلات hACE2 في غشاء البلازما 9. كما وجد أن سبايك يتفاعل مع جزيئات أخرى في غشاء البلازما التي قد تعمل كمستقبلات مشتركة بالإضافة إلى hACE210,11. في جميع أنحاء تسلسل بروتين سبايك وخاصة في واجهة S1 / S2 ، هناك مواقع انقسام البروتياز التي تمكن من الاندماج في الغشاء بعد بروتياز سيرين عبر الغشاء 2 (TMPRSS2)12. تم إنتاج العديد من بروتينات SARS-CoV-2 Spike المؤتلفة من مجالات ربط المستقبلات الفردية ، إلى S1 و S2 و S1 مع S2 ، وآلات تشذيب السنبلة الكاملة من بائعين تجاريين متعددين لاستخدامها في الأنشطة البحثية13.
في هذا العمل ، تم تشغيل سطح QDs باستخدام أدوات تشذيب السنبلة المؤتلفة التي تحتوي على علامة الهيستيدين (QD-Spike). تحتوي QDs التي ينتجها قسم المواد النانوية البصرية في مختبر البحوث البحرية على نواة سيلينيد الكادميوم وقذيفة كبريتيد الزنك 14,15. يقوم الزنك الموجود على سطح QD بتنسيق بقايا الهيستيدين داخل البروتين المؤتلف لتشكيل QD وظيفي يشبه جسيم فيروس SARS-CoV-2 في الشكل والوظيفة. وقد سبق وصف توليد الجسيمات النانوية واقتران البروتين باستخدام مجال ربط المستقبلات المترافقة مع QD15. تصف هذه الطريقة مستحضرات زراعة الخلايا ، وعلاج QD ، والحصول على الصور ، وبروتوكول تحليل البيانات الذي يمكن أن يوجه الباحث في دراسة نشاط SARS-CoV-2 Spike في السياق الفسيولوجي للخلية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
خط الخلية HEK293T المستخدم في هذه الدراسة هو خط خلية خالد. لم يتم استخدام أي أشخاص بشريين أو حيوانيين في هذه الدراسة.
1. زراعة الخلايا والبذر
- داخل خزانة السلامة البيولوجية المعقمة ، وارتداء معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك قفازات المختبر ، ومعطف المختبر ، ونظارات السلامة) ، قم بإعداد وسط زراعة الخلايا عن طريق استكمال Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، و 250 ميكروغرام / مل G418.
- بالنسبة إلى 500 مل من الوسائط، أضف 443.75 مل من DMEM، و50 مل من FBS، و5 مل من P/S، و1.25 مل من G418.
- قم بالتصفية من خلال قارورة فلتر 0.2 ميكرومتر وحافظ على العقم لتجنب التلوث البكتيري.
- داخل خزانة السلامة البيولوجية المعقمة ، قم بزرع 60 بئرا داخلية من صفيحة سوداء ، واضحة القاع ، مغلفة ب 96 بئرا مع 20000 خلية في 100 ميكرولتر لكل بئر من وسط زراعة الخلايا. املأ البئر الخارجية ال 36 ب 100 ميكرولتر لكل بئر من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
- لحساب الخلايا ، أضف 2 ميكرولتر من برتقال الأكريدين وبقعة يوديد البروبيديوم إلى 18 ميكرولتر من تعليق الخلايا.
- قم بتحميل 10 ميكرولتر من هذا المحلول في جانب واحد من شريحة عد الخلايا.
- كرر الخطوات 1.2.1. و 1.2.2. لتحميل جانبي الشريحة.
- ضع الشريحة في عداد خلية تلقائي.
- حدد بروتوكول العد الفلوري واضغط على Count. عد جانبي الشريحة واحسب متوسط كثافتي الخلية الحية.
- لحساب حجم تعليق الخلايا المطلوب، قسم إجمالي عدد الخلايا المطلوبة على متوسط كثافة الخلايا.
- فحص الآبار بعد البذر تحت المجهر الضوئي للتأكد من تحقيق الكثافة والتوزيع المناسبين.
- احتضن اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
2. علاج الخلايا مع QD-سبايك
- تحضير 0.1٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) عن طريق التخفيف في وسائط التصوير.
- للحصول على 10 مل من وسائط التصوير ، أضف 130 ميكرولتر من 7.5٪ BSA واخلط.
- في خزان أو لوحة فحص مكونة من 12 بئرا ، قم بتخفيف مخزون QD-Spike (SARS-CoV-2 ، Isolate USA-WA1 / 2020) 440 نانومتر باستخدام 0.1٪ BSA في وسائط التصوير.
- بالنسبة لبئر واحد من QD-Spike ، أضف 2.27 ميكرولتر من 440 نانومتر QD-Spike إلى 47.73 ميكرولتر من وسائط تصوير BSA بنسبة 0.1٪ للحصول على تركيز نهائي يبلغ 20 نانومتر.
- لتوليد تخفيف تسلسلي من ست نقاط بنسبة 1:3 (في ثلاثة أضعاف) ، أضف 14.26 ميكرولتر من QD-Spike إلى 285.74 ميكرولتر من وسائط تصوير BSA بنسبة 0.1٪ لجعل أعلى تركيز 20 نانومتر. أضف 100 ميكرولتر من 20 نانومتر QD-Spike إلى 200 ميكرولتر من وسائط BSA بنسبة 0.1٪ لإجراء التخفيف الثاني من 6.67 نانومتر QD-Spike. كرر أربع مرات لتوليد نقاط التركيز الست.
- باستخدام شفاط متعدد القنوات ، قم بإزالة جميع الوسائط المستهلكة من كل بئر. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، اغسل مرة واحدة باستخدام وسائط التصوير (100 ميكرولتر / بئر).
- استنشاق 100 ميكرولتر من وسائط التصوير وإضافة 50 ميكرولتر / بئر من محلول QD-Spike مرة أخرى.
- احتضن اللوحة لمدة 3 ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تابع إلى الخطوة 4.
3. التثبيت وتلطيخ النوى
- داخل خزانة السلامة البيولوجية المعقمة ، وارتداء معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك قفازات المختبر ، ومعطف المختبر ، ونظارات السلامة) ، قم بإعداد 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1٪ من وسائط التصوير BSA.
- استنشاق 50 ميكرولتر من QD-Spike من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر / بئر من 4٪ PFA.
- لا تدع الآبار تجف. استخدم ماصة آلية متعددة القنوات لتجنب تجفيف الآبار (مستحسن).
- احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل ثلاث مرات باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- قم بإعداد الصبغة النووية الحمراء العميقة عن طريق تخفيف محلول مخزون 5 mM إلى تخفيف 1: 1000 في PBS.
- استنشاق PBS وإضافة 50 ميكرولتر / بئر من الصبغة النووية المخففة.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل ثلاث مرات مع PBS.
- قم بتصوير اللوحة أو الختم باستخدام مانع تسرب لوحة للتصوير في وقت لاحق. تخزين اللوحة في 4 درجة مئوية. يجب أن يكون التألق مستقرا لعدة أسابيع أو أكثر.
4. إعداد الاستحواذ والتصوير
- بدء تشغيل البرنامج الخاص بمنصة التصوير. قم بتشغيل النظام الأساسي للتصوير عالي المحتوى ، ويجب أن يكون الضوء الموجود على شريط الحالة مضاءا. إذا لم يكن الجهاز متصلا ، فسينتقل البرنامج إلى وضع التحليل في وضع عدم الاتصال.
- تسجيل الدخول إلى منصة التصوير.
- إنشاء بروتوكول اكتساب جديد.
- حدد نوع اللوحة كلوحة تصوير سفلية واضحة 96 بئرا.
ملاحظة: قد يختلف اختيار اللوحة في الأداة ويمكن تخصيصه عن طريق تحميل تعريفات اللوحة الصحيحة التي تتضمن أبعاد اللوحة مثل الارتفاع والعرض والمسافات الأخرى لتحديد التباعد الجيد والنقاط البؤرية. - حدد الوضع البصري كمتحد البؤرة والتكبير مثل الغمر بالماء بمعدل 40 ضعفا.
- حدد الربط ك 1.
- اختر القنوات والأطوال الموجية للإثارة/الانبعاث الفلوري كما هو موضح في الخطوات 4-3-5-4-3-8. التقط لقطة عند تحديد الإعدادات لعرض الصورة والتأكد من أن الإعدادات مناسبة.
ملاحظة: سيسمح تباين الطور الرقمي (DPC) بتصور الخلايا الحية بدون بقعة خلية أو صبغة فلورسنت. لا ينصح به للخلايا الثابتة. - حدد وضع DPC مثل التباين العالي لإنتاج أجسام خلايا محددة جيدا. التقط لقطة للتأكد من أن هذا الإعداد مناسب، كما هو موضح في نافذة الصورة.
- حدد قناة FITC للاستخدام مع خط خلية ACE2-GFP الذي يسمح بتصور تهريب ACE2 داخل الخلية.
- لإنشاء قناة مخصصة لقناة QD، حدد القائمة المنسدلة المثلث للقناة واختر الإثارة في نطاق 405 نانومتر والانبعاثات في نطاق 608 نانومتر.
- إذا تم إصلاح الخلايا وتم استخدام صبغة نووية حمراء عميقة ، فحدد القناة الحمراء البعيدة التي يزيد انبعاثها عن 630 نانومتر لزيادة تحديد جسم الخلية والعمل كقناع خلوي.
- اختر بئرا مزودا بإشارة QD سيتوبلازمية قوية لضبط وقت التعرض وطاقة الليزر وموضع الارتفاع Z. اتبع الخطوات من 4.3.10-4.3.13.
- تحقق مما إذا كان الارتفاع الافتراضي ينتج صورة حيث تكون الخلايا في المستوى البؤري المطلوب. إذا كانت الثقب الداخلي هي العضية المستهدفة ، فسيكون موضع Z أقل مما لو كان الغشاء البلازمي هو العضية المستهدفة.
- اختر وقت التعرض الذي ينتج صورة ساطعة بمستويات رمادية أكبر بثلاثة أضعاف على الأقل من إشارة الخلفية. هذا عادة ما يكون بين 100 و 300 مللي ثانية. عند 20 نانومتر ، يجب أن تكون المستويات الرمادية حوالي 6000 وحدة اصطناعية باستخدام وقت تعرض يبلغ 200 مللي ثانية وقوة ليزر تبلغ 80٪.
- تحقق من المستويات الرمادية من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة التي تم إنتاجها باستخدام ميزة اللقطة في كل قناة وتحديد إظهار الكثافة. ثم انقر بزر الماوس الأيسر على الكائن محل الاهتمام أو الخلفية لعرض المستوى الرمادي لهذا البكسل.
- اضبط طاقة الليزر لضبط شدة الأشياء ذات الاهتمام.
- حدد نوع اللوحة كلوحة تصوير سفلية واضحة 96 بئرا.
- احفظ بروتوكول الاستحواذ.
- قم بالتبديل إلى تشغيل التجربة وأدخل اسم اللوحة.
- قم بتشغيل التجربة.
5. تحليل البيانات
- استيراد البيانات إلى برنامج التصوير.
- بعد الحصول على جميع الصور ، قم بتصدير القياسات إلى برنامج التصوير. وهذا يتطلب إنشاء خادم وإنشاء حساب. قم بإنشاء شاشة للبيانات المراد تصديرها إلى برنامج التصوير.
- في برنامج التصوير، حدد تحليل الصور لبدء إنشاء بروتوكول التحليل.
- قم بتحميل القياسات من تجربة التصوير بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الملف في قائمة الشاشات والنقر فوق تحديد. يجب أن تكون خريطة لوحة الآبار المصورة والحقول المرتبطة بها مرئية في الزاوية السفلية اليسرى من النافذة.
- اختر بئرا به بقع QD سيتوبلازمية ساطعة لبدء تجزئة الصورة.
- في كتلة إنشاء صورة الإدخال، حدد تصحيح الحقل المسطح.
- أضف الكتلة البرمجية الإنشائية التالية إلى البروتوكول عن طريق تحديد البحث عن النوى.
- هنا ، استخدم DPC أو القناة الحمراء البعيدة كعلامة Nuclei.
- حدد الطريقة التي تقسم الكائنات بدقة أولا، ثم قم بضبط التقسيم باستخدام القائمة المنسدلة وضبط أشرطة التمرير.
ملاحظة: يحدد التقسيم الجيد بدقة منطقة الاهتمام (ROI) للنواة والخلية والبقع. يجب فقط التقاط وحدات البكسل الإيجابية للعلامة ضمن عائد استثمار فردي. يجب استبعاد إشارة الخلفية. إذا تم التقاط الخلفية في عائد الاستثمار ، يمكن تقليل حساسية الطريقة ، أو يمكن زيادة عتبة الكثافة لزيادة صرامة خوارزمية التجزئة. ينطبق هذا على جميع كتل إنشاء البحث.
- بعد ذلك ، أضف كتلة بناء البحث عن السيتوبلازم لتحديد السيتوبلازم.
- في هذه الحالة ، استخدم قناة ACE2-GFP للتجزئة السيتوبلازمية.
- حدد الطريقة التي تحدد السيتوبلازم لكل خلية على أفضل وجه.
- بعد ذلك، أضف كتلة إنشاء البحث عن البقع لتحديد نقطة QD-Spike .
- حدد النوى كمجموعة عائد الاستثمار.
- حدد الخلية كمنطقة عائد الاستثمار. هذا يلتقط الثقب داخل الخلية بأكملها.
- حدد الطريقة التي تحدد بدقة QD بشكل أفضل في كل خلية.
- بمجرد تقسيم جميع الكائنات الموجودة في الصورة وتحديدها بدقة في هذا البئر ، اختر آبارا أخرى لضمان إمكانية تطبيق كتل البناء والإعدادات بشكل عام على الآبار الأخرى والظروف الأخرى.
- أضف خصائص حساب الشدة لجميع الأجسام المجزأة (النوى، والسيتوبلازم/الخلايا، والبقع).
- أضف حساب خصائص التشكل لجميع الكائنات المجزأة (النوى، السيتوبلازم/الخلايا، والبقع).
- أضف حساب خصائص النسيج لجميع الكائنات المجزأة (النوى، السيتوبلازم/الخلايا، والبقع).
- حدد النتائج عن طريق تحديد المعلمات لكل مجموعة سكانية ، بما في ذلك النوى والبقع. يمكن استخدام عدد الكائنات كمقياس غير مباشر لصلاحية الخلية.
6. تصدير البيانات
- انقر على تحليل الدفعة. انتظر حتى ينتهي التحليل قبل المتابعة إلى الخطوة التالية (الخطوة 6.2).
ملاحظة: يسمح تحليل الدفعات لخادم برنامج تحليل الصور بتحميل بروتوكول التحليل باستخدام القياسات المحددة لتحليل البيانات عن بعد. - تصدير مجموعة البيانات إلى كمبيوتر محلي أو محرك أقراص شبكة.
- قم بتوصيل برنامج تحليل الصور بتطبيق مساعد على الكمبيوتر عن طريق تنزيل ملف اتصال وفتحه.
- حدد نوع ملف النتائج (.txt أو .csv أو .html أو XML أصلي).
- اختر إعدادات مجلد الملفات باستخدام القائمة المنسدلة.
7. تحليل البيانات في جدول بيانات
- افتح الملف المصدر. إذا كان ملفا .csv، فاحفظه كتنسيق ملف .xls لتمكين استخدام الجداول المحورية. إذا كان مسار الملف طويلا جدا، فاحفظ ملف .xls أعلى في التسلسل الهرمي للمجلدات لتجنب الأخطاء في الحفظ.
- أضف أعمدة إلى جدول البيانات تحدد شروط كل بئر. على سبيل المثال ، نوع الخلية ، متغيرات QD-Spike ، تركيزات QD-Spike ، وقت الحضانة ، إلخ.
- اختر وظيفة الجدول المحوري وقم بإنشاء الجدول باستخدام الشروط المضافة كصفوف، والمعلمات المقاسة كأعمدة. حدد الحساب لكل معلمة ، أي المتوسط أو الانحراف المعياري أو الوسيط أو الحد الأدنى أو الحد الأقصى أو العد.
- تطبيع البيانات للتحكم في العينات، بما في ذلك QDs غير المقترنة بنسبة 0٪ وأعلى تركيز ل QD-Spike بنسبة 100٪.
ملاحظة: عند تقييم فعالية المثبطات مثل تحييد الأجسام المضادة، قم بتطبيع البيانات إلى الخلايا المعالجة بالوسائط فقط (فعالية 100٪) و QD-Spike بدون مثبط (فعالية 0٪). - ارسم البيانات في برنامج الرسوم البيانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند العلاج ، سيتم استيعاب QDs لأن الجسيمات النانوية سترتبط ب ACE2 على غشاء البلازما وتحفز endocytosis. باستخدام خط خلية ACE2-GFP يعبر عن خط الخلية ، يمكن تصور نقل كل من QDs و ACE2 باستخدام المجهر الفلوري. بمجرد استيعابها ، تظهر إشارتا QD و ACE2 توطينا مشتركا قويا. من هذه الصور ، يمكن إجراء تجزئة الصور والتحليل اللاحق لاستخراج المعلمات ذات الصلة مثل عدد النقاط (الشكل 1 ، الشكل 2B). الشكل 1A هو مونتاج للخلايا المعالجة بتركيزات مختلفة من QD-Spike أو الوسائط فقط كعنصر تحكم. تم استخدام ثلاث قنوات ، بما في ذلك تباين الطور الرقمي ، FITC ، وقناة QD المخصصة مع الإثارة عند 405 نانومتر والانبعاثات عند 608 نانومتر. يوفر DPC صورة لشكل الخلية العام. توفر صورة DPC مؤشرا تقريبيا لمورفولوجيا الخلية بأكملها. تتداخل منطقة الاهتمام مع إشارة DPC وهي كافية للكشف عن QDs الداخلية. تعرض قناة FITC ACE2-GFP تغيير التوطين والتراكم في المناطق التي تتزامن مع QD-Spike. مع انخفاض تركيز QD-Spike ، لم تعد QDs مرئية وإشارة ACE2-GFP تشبه التحكم. توضح قناة الدمج التوطين المشترك ل ACE2-GFP مع QD-Spike. هذه الكائنات هي مزيج من البقع والتراكمات الأكبر التي يمكن تقسيمها باستخدام برنامج التحليل. يمكن استخدام الضبط الدقيق لطريقة تحليل البرامج المستخدمة لتجزئة الصور لتقسيم الكائنات ذات الاهتمام.
هنا تم إجراء تجربة استجابة التركيز مع ستة تركيزات مختلفة من QD-Spike ، بدءا من 20 نانومتر ، لتحديد التركيزات المثلى ل QD (الشكل 2A). يمكن استخدام QDs منخفضة تصل إلى 2.22 نانومتر ولا تزال تظهر الربط والاستيعاب. ومع ذلك ، يوصى باستخدام تركيزات 20 نانومتر أو أعلى لضمان استجابة قوية.
أثناء الاقتران ب QD ، قد يحدث تراكم البروتين. المشكلة الرئيسية في المجاميع هي أنها ستتراكم فوق الخلايا وتسبب القطع الأثرية في خطوة تجزئة الصورة. لن تتمكن المجاميع من دخول الخلايا ، ولن تشبه الجسيمات النانوية ككل جسيما فيروسيا (الشكل 3). يمكن رصد الركام في محلول QD كرواسب مشرقة ومتجمعة.
يمكن أيضا استخدام هذا الفحص لتقييم البيولوجيا ، مثل تحييد الأجسام المضادة التي تمنع دخول الفيروس. تم احتضان QDs بأجسام مضادة محايدة (الشكل 4A) ، بدءا من 30 ميكروغرام / مل ، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافتها إلى الخلايا. تم استخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد سلالة واشنطن المرجعية ، SARS-CoV-2 RBD. لقد منعت الربط والاستيعاب وتسببت في انخفاض في عدد البقع المقاسة مقارنة بالخلايا المعالجة ب QD فقط (الشكل 4B).
الشكل 1: تحليل الصور عالية المحتوى وتجزئة خلايا ACE2-GFP المعالجة ب QD608-Spike. صور تمثيلية للتجزئة الدقيقة. أولا ، يتم تقسيم النوى من القناة التي تحتوي على العلامة النووية لإنشاء مجموعة عائد على الاستثمار. من مجموعة عائد الاستثمار، يتم تقسيم منطقة عائد الاستثمار التي تحدد الخلية باستخدام قناة ACE2-GFP. وأخيرا، يتم تقسيم بقع QD608-Spike من منطقة عائد الاستثمار الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يربط QD608-Spike hACE2 ويتم إدخاله في خلايا hACE2-GFP HEK293T. (A) مونتاج الصور لخلايا hACE2-GFP (الأصفر) HEK293T المعالجة بتركيزات متعددة من QD608-Spike (أرجواني) أو الوسائط فقط. تم استخدام تباين الطور الرقمي (سماوي) لتصور جسم الخلية. شريط المقياس: 20 ميكرومتر (ب) تحليل المحتوى العالي لتعداد النقاط QD608-Spike تم تطبيعه إلى 20 نانومتر QD608-Spike (100٪) والتحكم (0٪). N = الآبار الثلاثية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (S.D.). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لا يتم استيعاب QD608-Spike المجمعة في خلايا hACE2-GFP HEK293T. مونتاج الصور لخلايا hACE2-GFP HEK293T المعالجة ب 10 نانومتر QD608-Spike أو الوسائط فقط. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحييد كتل الأجسام المضادة من كثرة الخلايا الداخلية ل QD608-Spike في خلايا hACE2-GFP HEK293T. (A) مونتاج الصور لخلايا hACE2-GFP (الأصفر) HEK293T المعالجة ب QD608-Spike (أرجواني) المحتضنة مسبقا بتركيزات متناقصة من الأجسام المضادة المحايدة ، باستخدام تباين الطور الرقمي (سماوي) لتحديد أجسام الخلايا. شريط المقياس: 20 ميكرومتر (B) تحليل المحتوى العالي لأعداد نقاط QD608-Spike التي تمت تسويتها إلى التحكم في الوسائط فقط (100٪) و 10 نانومتر QD608-Spike فقط (0٪). N = الآبار الثلاثية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر الطريقة الموضحة في هذه المقالة الخطوات اللازمة لتصوير QDs الوظيفية في الخلايا البشرية باستخدام المجهر البؤري عالي الإنتاجية. هذه الطريقة هي الأنسب للخلايا حيث يكون كثرة الخلايا الداخلية هو الطريق الرئيسي للدخول الفيروسي بدلا من نشاط TMPRSS2 والانصهار الغشائي ، لأنها تمكن من دراسة SARS-CoV-2 Spike و hACE2 endocytosis. نظرا لطبيعة نموذج QD وعلامة C-terminal His-tag على أداة تشذيب Spike المتاحة تجاريا ، فإن أي انقسام TMPRSS2 لنطاقات Spike S1 و S2 سيترك QD متصلا بنطاق S2 فقط12. هذا قد يمنع الاستيعاب ، بالنظر إلى أن RBD موجود في S1. لذلك ، إذا كان تسلسل الأحداث على سطح الخلية دقيقا ، حيث يرتبط hACE2 ثم يشق TMPRSS2 سبايك ، فمن المتوقع حدوث إشارة سلبية بدون استيعاب.
نظرا لأن هذا البروتوكول يتعامل مع عمليات التصوير الخلوي ، يجب أن تكون الخلايا المستزرعة متساهلة مع العدوى الفيروسية مع التعبير عن hACE2. قد يتم نقل hACE2 بشكل عابر إلى الخلايا ، أو قد يتم إنشاء خط خلية مستقر يعبر عن hACE2 17. يوصى بالتحقق من تعبير hACE2 وتوطينه باستخدام التألق المناعي مع الأجسام المضادة ضد hACE2 ما لم يكن لدى hACE2 علامة بروتين فلورسنت مثل GFP يمكن ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري. يمنح hACE2 الموسومة ب GFP فائدة إضافية تتمثل في تصور الاتجار ب hACE2 بعد داء الخلايا الداخلية QD-Spike . يمكن استخدام بعض خطوط الخلايا ذات التعبير الداخلي hACE2 ، ولكن يجب تأكيد ذلك باستخدام الكيمياء المناعية. في بعض الحالات ، لا يوفر التعبير الداخلي ما يكفي من شركاء ربط hACE2 ل QD-Spike وقد يؤدي إلى إشارة يتم اكتشافها بشكل سيئ بواسطة المجهر البؤري عالي الإنتاجية.
وتشمل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول شراء QDs عالية الجودة مقترنة ب SARS-CoV-2 Spike المؤتلف الذي يحمل علامة His. الشرط الأساسي لذلك هو بروتين منقى بشكل صحيح يمكن اقترانه ب QDs دون التسبب في تجميع. ستواجه QDs المجمعة العديد من المشكلات التي تمنع نجاح التجربة. لذلك، يوصى بشدة باختبار QD-Spike باستخدام أدوات التحليل (مثل التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية، أو المجهر الإلكتروني الناقل، أو تشتت الضوء الديناميكي) قبل التجريب الكامل للحفاظ على الموارد القيمة في حالة اختبار الكواشف الثمينة16. أثناء وضع العلامات على QDs مع spike ، يتم خلط تركيزات محددة من QD و Spike لتحقيق نسبة محددة من الجزيئات. يتم خلط QD و Spike فقط ، ويتم تنقية كلا الحلين بدرجة عالية. لتقييم وضع العلامات على QDs ، يمكن صب هلام الأكريلاميد وتحميله ب QD وحده بالإضافة إلى QD مقترنا ب Spike ، مما يؤدي إلى نطاقات وزن جزيئي أثقل.
تحتوي QDs المستخدمة في هذا البروتوكول على طيف إثارة / انبعاث فلوري مضبوط إلى 608 نانومتر من الانبعاثات بعد إثارة الأشعة فوق البنفسجية (≤405 نانومتر) لأن معظم QDs لديها امتصاص عال بالقرب من نطاق الأشعة فوق البنفسجية مما ينتج عنه تلألؤ ضوئي عال18. هذا هو مزيج غير تقليدي من الإثارة / الانبعاثات التي تتطلب المجهر أن يكون لها قنوات قابلة للتخصيص. يمكن إعداد العديد من المجاهر البؤرية التقليدية باستخدام المرشحات المناسبة وخطوط الليزر لتحقيق هذا الإثارة / الانبعاثات. بدلا من ذلك ، فإن إثارة QD عند الحد الأقصى للامتصاص الأول ، على بعد حوالي 10 إلى 20 نانومتر من ذروة الانبعاثات (على سبيل المثال ، 592 نانومتر ل QD608 المستخدمة هنا) ، ستكون قادرة أيضا على إنتاج تلألؤ ضوئي كاف.
يستخدم البرنامج المستند إلى السحابة المستخدم في بروتوكول التحليل عالي المحتوى هذا نظام تسمية يعتمد على الخطوات السابقة. على سبيل المثال ، الكائنات الأولى المجزأة هي النوى ، والتي تخلق مجموعة تسمى النوى. بعد ذلك ، يمكن تحديد الخلية أو السيتوبلازم كمنطقة عائد استثمار داخل نوى السكان. تحدد المصطلحات المستخدمة في برنامج تحليل الصور اسم مجموعة الكائنات المجزأة باستخدام كتلة بناء النواة على أنها نواة. ومع ذلك ، ليس بالضرورة أن تكون نواة ويمكن أن تكون أجساما خلوية إذا لم تكن هناك صبغة نووية متاحة. يمكن أيضا تغيير نظام التسمية هذا وتخصيصه داخل كل اسم إخراج كتلة بناء.
لم يأخذ بروتوكولنا في الاعتبار تفاعلات الغشاء ، ولكن يمكن القيام بذلك عن طريق إضافة بقعة غشاء إضافية مستقلة عن الاتجار ب ACE2-GFP. لمنع الربط غير المحدد ، يتم تضمين 0.1٪ BSA في وسائط الفحص (DMEM + 0.1٪ BSA) ، ويتم زراعة الخلايا في 10٪ FBS أيضا. يمكن استخدام بروتينات سبايك الطافرة ، لكننا اقتصرنا على بروتينات سبايك المتاحة تجاريا. في هذه الحالة ، لم يكن بروتين سبايك المتحور SARS-CoV-2 غير المرتبط ب ACE2 متاحا.
تقدم طريقة الجسيمات النانوية QD تقنية قوية لدراسة ربط واستيعاب الفيروسات التي تعتمد على الدخول بوساطة سبايك. يمكن استخدام هذا الفحص للفحص عالي الإنتاجية بطريقة مماثلة ، كما هو موضح في الشكل 4 ، لإعادة توظيف وتحديد مضادات الفيروسات القوية التي تمنع الدخول الخلوي. في حين أن هذا البروتوكول أظهر فقط استخدام QDs المقترنة بسلالة واشنطن WA-1 المرجعية من SARS-CoV-2 ، يمكن تكييف هذا الفحص بسهولة لدراسة الخصائص الملزمة للمتغيرات الناشئة حديثا مثل ألفا وبيتا وجاما ودلتا من خلال استخدام بروتينات سبايك الخاصة بها المترافقة مع QDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، المعاهد الوطنية للصحة. قدم مختبر البحوث البحرية التمويل من خلال معهد علوم النانو الداخلي التابع له. تم دعم إعداد الكاشف من خلال الصندوق الأساسي NRL COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
