Summary
In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.
Abstract
Die Entwicklung neuer Technologien für die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie hat Hochdurchsatz-Screening-Methoden für die Wirkstoffforschung ermöglicht. Quantenpunkte sind fluoreszierende Nanopartikel mit hervorragenden photophysikalischen Eigenschaften, die von heller und stabiler Photolumineszenz sowie schmalen Emissionsbändern durchdrungen sind. Quantenpunkte haben eine kugelförmige Form und können mit der richtigen Modifikation der Oberflächenchemie verwendet werden, um Biomoleküle für zelluläre Anwendungen zu konjugieren. Diese optischen Eigenschaften, kombiniert mit der Fähigkeit, sie mit Biomolekülen zu funktionalisieren, machen sie zu einem ausgezeichneten Werkzeug für die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen und zellulärem Transport. Hier stellen wir eine Methode vor, die Quantenpunkte verwendet, um die Bindung und Endozytose des SARS-CoV-2-Spike-Proteins zu verfolgen. Dieses Protokoll kann als Leitfaden für Experimentatoren verwendet werden, die Quantenpunkte verwenden möchten, um Protein-Protein-Interaktionen und -Handel im Kontext der zellulären Physiologie zu untersuchen.
Introduction
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es Forschern, mit speziellen Farbstoffen1, genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen2 und fluoreszierenden Nanopartikeln in Form von Quantenpunkten (QDs)3 in das Innenleben der Zelle zu blicken. Für das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus von 2019 (SARS-CoV-2) globale Pandemie haben Forscher Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um zu verstehen, wie das Virus mit der Zelle sowohl an der Plasmamembran als auch im Zytoplasma interagiert. So konnten Forscher Einblicke in die Bindung des SARS-CoV-2-Spike-Proteins auf der Oberfläche des Virions an das menschliche Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) auf der Oberfläche menschlicher Zellen, die anschließende Internalisierung durch Fusion an der Plasmamembran und die Endozytose des Spike:hACE2-Proteinkomplexes4,5 gewinnen. Große Einblicke wurden auch in das SARS-CoV-2-Austritt aus Zellen über das Lysosom unter Verwendung der zellulären Fluoreszenzbildgebung gewonnen, ein einzigartiges Merkmal von Coronaviren, von denen bisher angenommen wurde, dass sie über traditionelle Vesikelknospen aus dem Golgi auftreten, wie es bei vielen anderen Viren der Fall ist6. Die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie-Technik, eine tragende Säule fast aller Aspekte der biologischen Forschung, hat sich in ihrer Breite und ihrem Anwendungsbereich notwendigerweise weiterentwickelt, von der hochauflösenden Bildgebung ganzer Tiere bis hin zur automatisierten multiparametrischen High-Content-Bildgebung für das Arzneimittelscreening. Hier wird eine automatisierte konfokale High-Content-Mikroskopie zur Untersuchung des SARS-CoV-2-Zelleintritts unter Verwendung fluoreszierender QDs angewendet, die mit dem viralen Spike-Protein konjugiert sind.
Die High-Content-Analyse von Bildern, die von biologischen Bildgebungsplattformen erzeugt werden, ermöglicht eine bessere Extraktion wertvoller biologischer Erkenntnisse als einzelne Parameter wie die Intensität des gesamten Bohrlochs, die man mit einem multimodalen Plattenleser erhalten würde7. Durch die Trennung der Objekte in einem Sichtfeld mithilfe automatisierter Segmentierungsalgorithmen kann jedes Objekt oder eine Population von Objekten auf Parameter wie Intensität, Fläche und Textur in jedem verfügbaren Fluoreszenzkanal analysiert werden8. Die Kombination vieler Messungen in multivariaten Datensätzen ist ein nützlicher Ansatz für die phänotypische Profilerstellung. Wenn der gewünschte Phänotyp bekannt ist, wie z.B. die QD-Internalisierung in Form von Puncta, kann man die mit Puncta verbundenen Messungen wie Größe, Anzahl und Intensität verwenden, um die Wirksamkeit einer Behandlung zu beurteilen.
Cloud-basierte High-Content-Imaging-Analysesoftware kann eine Vielzahl von Instrumentendatenausgaben aufnehmen, einschließlich der High-Content-Imaging-Plattform. Durch die Verwendung eines Cloud-basierten Servers für die Bildspeicherung und Online-Analyse kann der Benutzer seine Daten entweder vom Bildgebungsgerät oder vom Netzlaufwerk, auf dem die Daten gespeichert sind, hochladen. Der Analyseteil des Protokolls wird innerhalb der Cloud-Softwareumgebung durchgeführt, und die Daten können in einer Vielzahl von Dateiformaten für die nachgelagerte Datenvisualisierung exportiert werden.
Das SARS-CoV-2-Virus besteht aus Nichtstruktur- und Strukturproteinen, die bei seiner Montage und Replikation helfen. SARS-CoV-2-Spike hat zwei Domänen namens S1 und S2, wobei S1 die Rezeptorbindungsdomäne enthält, die für hACE2-Wechselwirkungen an der Plasmamembran verantwortlich ist9. Es wurde auch festgestellt, dass Spike mit anderen Molekülen an der Plasmamembran interagiert, die zusätzlich zu hACE210,11 als Co-Rezeptoren fungieren können. Während der gesamten Spike-Proteinsequenz und insbesondere an der S1/S2-Grenzfläche gibt es Protease-Spaltungsstellen, die eine Fusion an der Membran nach der Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2)12 ermöglichen. Verschiedene rekombinante SARS-CoV-2-Spike-Proteine wurden aus einzelnen Rezeptorbindungsdomänen hergestellt, zu S1, S2, S1 mit S2 und ganzen Spike-Trimern von mehreren kommerziellen Anbietern für den Einsatz in Forschungsaktivitäten13.
In dieser Arbeit wurde die Oberfläche von QDs mit rekombinanten Spike-Trimern funktionalisiert, die ein Histidin-Tag (QD-Spike) enthalten. Die von der Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section hergestellten QDs enthalten einen Cadmiumselenidkern und eine Zinksulfidschale14,15. Das Zink auf der QD-Oberfläche koordiniert die Histidinreste innerhalb des rekombinanten Proteins, um eine funktionalisierte QD zu bilden, die in Form und Funktion einem SARS-CoV-2-Viruspartikel ähnelt. Die Erzeugung der Nanopartikel und der Proteinkonjugation wurde zuvor unter Verwendung der QD-konjugierten Rezeptorbindungsdomäne beschrieben15. Diese Methode beschreibt die Zellkulturpräparate, die QD-Behandlung, die Bilderfassung und das Datenanalyseprotokoll, das einen Forscher bei der Untersuchung der SARS-CoV-2-Spike-Aktivität im physiologischen Kontext einer menschlichen Zelle leiten kann.
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Protocol
Die in dieser Studie verwendete HEK293T-Zelllinie ist eine immortalisierte Zelllinie. In dieser Studie wurden keine menschlichen oder tierischen Probanden verwendet.
1. Zellkultivierung und Aussaat
- Bereiten Sie in einer sterilen Biosicherheitskabine mit persönlicher Schutzausrüstung (einschließlich Laborhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille) Zellkulturmedium vor, indem Sie das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) und 250 μg / ml G418 ergänzen.
- Für 500 ml Medien fügen Sie 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S und 1,25 ml G418 hinzu.
- Filtern Sie durch einen 0,2-μm-Filterkolben und bewahren Sie die Sterilität, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.
- In einer sterilen Biosicherheitskabine säen Sie die inneren 60 Vertiefungen einer schwarzen, durchsichtigen, mit Poly-D-Lysin beschichteten 96-Well-Platte mit 20.000 Zellen in 100 μL Zellkulturmedium pro Welle. Füllen Sie die äußeren 36 Vertiefungen mit 100 μL pro Vertiefung phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 2 μL Acridinorange und Propidiumiodid-Färbung zu 18 μL Zellsuspension hinzu.
- Laden Sie 10 μL dieser Lösung in eine Seite eines Zellzählobjektträgers.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1. und 1.2.2. , um beide Seiten der Folie zu laden.
- Platzieren Sie den Objektträger in einem automatisierten Zellzähler.
- Wählen Sie das Fluoreszenzzählprotokoll aus und drücken Sie Zählen. Zählen Sie beide Seiten des Objektträgers und berechnen Sie den Durchschnitt der beiden Lebendzelldichten.
- Um das erforderliche Zellsuspensionsvolumen zu berechnen, dividieren Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen durch die durchschnittliche Zelldichte.
- Untersuchen Sie die Vertiefungen nach der Aussaat unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die richtige Dichte und Verteilung erreicht wurde.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
2. Behandlung von Zellen mit QD-Spike
- Bereiten Sie 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) durch Verdünnung in bildgebenden Medien vor.
- Für 10 ml Bildgebungsmedien fügen Sie 130 μL 7,5% BSA hinzu und mischen Sie.
- Verdünnen Sie in einem 12-Well-Reservoir oder einer Assay-Platte den 440 nM QD-Spike-Bestand (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) auf 20 nM unter Verwendung von 0,1% BSA in bildgebenden Medien.
- Für 1 Vertiefungspunkt QD-Spike sind 2,27 μL 440 nM QD-Spike zu 47,73 μL 0,1% BSA-Bildgebungsmedien für eine Endkonzentration von 20 nM hinzuzufügen.
- Um eine serielle Sechs-Punkte-1:3-Verdünnung (dreifach) zu erzeugen, fügen Sie 14,26 μL QD-Spike zu 285,74 μL 0,1% BSA-Bildgebungsmedien hinzu, um die höchste Konzentration von 20 nM zu erhalten. Fügen Sie 100 μL 20 nM QD-Spike zu 200 μL 0,1% BSA-Medien hinzu, um die zweite Verdünnung von 6,67 nM QD-Spike zu erhalten. Wiederholen Sie dies viermal, um die sechs Konzentrationspunkte zu generieren.
- Entfernen Sie mit einem Mehrkanal-Absauger alle verbrauchten Medien aus jedem Well. Mit einer Mehrkanalpipette einmal mit bildgebenden Medien (100 μL/Well) waschen.
- Aspirieren Sie 100 μL Bildgebungsmedien und fügen Sie 50 μL/Well QD-Spike-Lösung wieder hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte für 3 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
3. Fixierung und Kernfärbung
- In einer sterilen Biosicherheitskabine werden in persönlicher Schutzausrüstung (einschließlich Laborhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille) 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1% BSA-Bildgebungsmedien hergestellt.
- Aspirieren Sie 50 μL QD-Spike aus jeder Vertiefung und fügen Sie 100 μL / Vertiefung von 4% PFA hinzu.
- Lassen Sie die Brunnen nicht austrocknen. Verwenden Sie eine automatisierte Mehrkanalpipette, um eine Trocknung der Bohrlöcher zu vermeiden (empfohlen).
- 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
- Bereiten Sie den tiefroten Kernfarbstoff vor, indem Sie die 5 mM Stammlösung auf 1:1000 Verdünnung in PBS verdünnen.
- Saugen Sie das PBS aus und fügen Sie 50 μL / Well des verdünnten Kernfarbstoffs wieder hinzu.
- 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Dreimal mit PBS waschen.
- Stellen Sie die Platte oder das Siegel mit einem Plattenversiegeler für die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt ab. Lagern Sie den Teller bei 4 °C. Die Fluoreszenz sollte mehrere Wochen oder länger stabil sein.
4. Erfassungseinrichtung und Bildgebung
- Starten Sie die Software für die Imaging-Plattform. Schalten Sie die High-Content-Imaging-Plattform ein, und die Anzeige in der Statusleiste sollte leuchten. Wenn das Gerät nicht angeschlossen ist, wechselt die Software in den Offline-Analysemodus.
- Melden Sie sich bei der Imaging-Plattform an.
- Erstellen Sie ein neues Erfassungsprotokoll.
- Wählen Sie Plattentyp als 96-fach klare Bodenbildplatte.
HINWEIS: Die Plattenauswahl im Gerät kann variieren und kann angepasst werden, indem die richtigen Plattendefinitionen geladen werden, die Plattenabmessungen wie Höhe, Breite und andere Abstände enthalten, um Bohrlochabstände und Brennpunkte zu definieren. - Wählen Sie den optischen Modus als konfokal und die Vergrößerung als 40-faches Eintauchen in das Wasser.
- Wählen Sie Binning als 1 aus.
- Wählen Sie die Kanäle und Fluoreszenz-Anregungs-/Emissionswellenlängen wie in den Schritten 4.3.5-4.3.8 beschrieben aus. Machen Sie einen Schnappschuss, wenn die Einstellungen ausgewählt sind, um das Bild anzuzeigen und sicherzustellen, dass die Einstellungen angemessen sind.
HINWEIS: Der digitale Phasenkontrast (DPC) ermöglicht die Visualisierung lebender Zellen ohne Zellfärbung oder Fluoreszenzfarbstoff. Es wird nicht für feste Zellen empfohlen. - Wählen Sie den Modus für DPC, z. B. Hoher Kontrast, um genau definierte Zellkörper zu erzeugen. Machen Sie einen Schnappschuss, um zu bestätigen, dass diese Einstellung angemessen ist, wie im Bildfenster zu sehen.
- Wählen Sie den FITC-Kanal für die Verwendung mit der ACE2-GFP-Zelllinie aus, die die Visualisierung des ACE2-Handels innerhalb der Zelle ermöglicht.
- Um einen benutzerdefinierten Kanal für den QD-Kanal zu erstellen, wählen Sie das Dreiecks-Dropdown-Menü für den Kanal und wählen Sie die Anregung im 405-nm-Bereich und die Emission im 608-nm-Bereich.
- Wenn Zellen fixiert wurden und ein tiefroter Kernfarbstoff verwendet wurde, wählen Sie den fernroten Kanal mit einer Emission von mehr als 630 nm, um den Zellkörper weiter abzugrenzen und als Zellmaske zu fungieren.
- Wählen Sie ein Bohrloch mit einem starken zytoplasmatischen QD-Signal, um die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Z-Höhenposition einzustellen. Befolgen Sie die Schritte von 4.3.10 bis 4.3.13.
- Überprüfen Sie, ob die Standardhöhe ein Bild erzeugt, bei dem sich die Zellen in der gewünschten Fokusebene befinden. Wenn die endozytosierten Puncta die Zielorganelle sind, ist die Z-Position niedriger, als wenn die Plasmamembran die Zielorganelle ist.
- Wählen Sie eine Belichtungszeit, die ein helles Bild mit Graustufen erzeugt, die mindestens dreimal größer sind als das Hintergrundsignal. Dies liegt typischerweise zwischen 100 und 300 ms. Bei 20 nM sollten die Graustufen bei einer Belichtungszeit von 200 ms und einer Laserleistung von 80% etwa 6000 AE betragen.
- Überprüfen Sie die Graustufen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken, das mit der Schnappschussfunktion in jedem Kanal erzeugt wurde, und die Option Intensität anzeigen auswählen. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf das Objekt von Interesse oder den Hintergrund, um die Graustufe für dieses Pixel anzuzeigen.
- Stellen Sie die Laserleistung ein, um die Intensität der Objekte von Interesse zu optimieren.
- Wählen Sie Plattentyp als 96-fach klare Bodenbildplatte.
- Speichern Sie das Erfassungsprotokoll.
- Wechseln Sie zu Experiment ausführen , und geben Sie den Plattennamen ein.
- Führen Sie das Experiment aus.
5. Datenanalyse
- Importieren Sie Daten in die Imaging-Software.
- Nachdem Sie alle Bilder erfasst haben, exportieren Sie die Messungen in die Bildgebungssoftware. Dazu muss ein Server eingerichtet und ein Konto erstellt werden. Erstellen Sie einen Bildschirm für die Daten, die in die Imaging-Software exportiert werden sollen.
- Wählen Sie in der Bildgebungssoftware Bildanalyse aus, um mit der Erstellung des Analyseprotokolls zu beginnen.
- Laden Sie die Messungen aus dem bildgebenden Experiment, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei in der Bildschirmliste klicken und auf Auswählen klicken. Die Plattenkarte der abgebildeten Brunnen und die zugehörigen Felder sollten in der unteren linken Ecke des Fensters sichtbar sein.
- Wählen Sie eine Vertiefung mit hellen zytoplasmatischen QD-Punkten, um mit der Bildsegmentierung zu beginnen.
- Wählen Sie im Eingabebild-Baustein die Option Flachfeldkorrektur aus.
- Fügen Sie dem Protokoll den nächsten Baustein hinzu, indem Sie Nuceli suchen auswählen.
- Verwenden Sie hier den DPC- oder fernroten Kanal als Nuclei-Marker.
- Wählen Sie zuerst die Methode aus, die die Objekte genau segmentiert, und passen Sie dann die Segmentierung über das Dropdown-Menü an und passen Sie die Schieberegler an.
HINWEIS: Eine gute Segmentierung definiert genau die Region of Interest (ROI) für den Kern, die Zelle und die Spots. Nur die Pixel, die für den Marker positiv sind, sollten innerhalb eines individuellen ROI erfasst werden. Hintergrundsignal sollte ausgeschlossen werden. Wenn der Hintergrund im ROI erfasst wird, kann die Empfindlichkeit der Methode verringert oder der Intensitätsschwellenwert erhöht werden, um die Stringenz des Segmentierungsalgorithmus zu erhöhen. Dies gilt für alle Find-Bausteine.
- Fügen Sie als Nächstes den Baustein "Zytoplasma suchen" hinzu, um das Zytoplasma zu identifizieren.
- Verwenden Sie in diesem Fall den ACE2-GFP-Kanal für die zytoplasmatische Segmentierung.
- Wählen Sie die Methode, die das Zytoplasma jeder Zelle am besten identifiziert.
- Fügen Sie als Nächstes den Baustein Find Spots hinzu, um die QD-Spike-Puncta zu identifizieren.
- Wählen Sie die Kerne als ROI-Population aus.
- Wählen Sie die Zelle als ROI-Region aus. Dadurch wird die Puncta innerhalb der gesamten Zelle erfasst.
- Wählen Sie die Methode aus, die die QD-Puncta in jeder Zelle am besten identifiziert.
- Sobald alle Objekte im Bild segmentiert und in diesem Brunnen genau identifiziert wurden, wählen Sie andere Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Bausteine und Einstellungen im Allgemeinen auf die anderen Bohrlöcher und andere Bedingungen angewendet werden können.
- Fügen Sie die Intensitätseigenschaften berechnen für alle segmentierten Objekte (Kerne, Zytoplasma/Zellen und Flecken) hinzu.
- Fügen Sie die Morphologieeigenschaften berechnen für alle segmentierten Objekte (Kerne, Zytoplasmen/Zellen und Flecken) hinzu.
- Fügen Sie die Textureigenschaften berechnen für alle segmentierten Objekte (Kerne, Zytoplasma/Zellen und Flecken) hinzu.
- Definieren Sie Ergebnisse, indem Sie die Parameter für jede Population auswählen, einschließlich Kerne und Spots. Die Anzahl der Objekte kann als indirektes Maß für die Zelllebensfähigkeit verwendet werden.
6. Daten exportieren
- Klicken Sie auf Chargenanalyse. Warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt (Schritt 6.2) fortfahren.
HINWEIS: Die Batch-Analyse ermöglicht es dem Bildanalyse-Softwareserver, das Analyseprotokoll mit den ausgewählten Messungen zu laden, um die Daten aus der Ferne zu analysieren. - Exportieren Sie das Dataset auf einen lokalen Computer oder ein lokales Netzlaufwerk.
- Verbinden Sie die Bildanalysesoftware mit einer Hilfsanwendung auf dem Computer, indem Sie eine Verbindungsdatei herunterladen und öffnen.
- Wählen Sie den Ergebnisdateityp aus (.txt, .csv, .html oder Native XML).
- Wählen Sie im Dropdown-Menü die Dateiordnereinstellungen aus.
7. Analysieren Sie die Daten in einer Tabelle
- Öffnen Sie die exportierte Datei. Wenn es sich um eine .csv Datei handelt, speichern Sie sie in einem .xls Dateiformat, um die Verwendung von Pivot-Tabellen zu ermöglichen. Wenn der Dateipfad zu lang ist, speichern Sie die .xls Datei weiter oben in der Ordnerhierarchie, um Fehler beim Speichern zu vermeiden.
- Fügen Sie der Tabelle Spalten hinzu, die die Bedingungen für jedes Bohrloch festlegen. Zum Beispiel der Zelltyp, QD-Spike-Varianten, QD-Spike-Konzentrationen, Inkubationszeit usw.
- Wählen Sie die Pivot-Tabellenfunktion aus, und erstellen Sie die Tabelle mit den hinzugefügten Bedingungen als Zeilen und den gemessenen Parametern als Spalten. Wählen Sie die Berechnung für jeden Parameter aus, d. h. Durchschnitt, Standardabweichung, Median, Min, Max oder Anzahl.
- Normalisieren Sie die Daten, um Proben zu kontrollieren, einschließlich unkonjugierter QDs als 0% und der höchsten Konzentration von QD-Spike als 100%.
HINWEIS: Wenn Sie die Wirksamkeit von Inhibitoren wie neutralisierenden Antikörpern beurteilen, normalisieren Sie die Daten auf nur medial behandelte Zellen (100% Wirksamkeit) und QD-Spike ohne Inhibitor (0% Wirksamkeit). - Zeichnen Sie die Daten in Grafiksoftware auf.
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Representative Results
Nach der Behandlung werden die QDs internalisiert, da das Nanopartikel an ACE2 auf der Plasmamembran bindet und eine Endozytose induziert. Mit einer ACE2-GFP-exprimierenden Zelllinie kann die Translokation von QDs und ACE2 mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Nach der Internalisierung zeigen die beiden QD- und ACE2-Signale eine starke Kolokalisation. Aus diesen Bildern kann eine Bildsegmentierung und anschließende Analyse durchgeführt werden, um relevante Parameter wie die Spotanzahl zu extrahieren (Abbildung 1, Abbildung 2B). Abbildung 1A ist eine Montage von Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von QD-Spike oder Medien nur als Kontrolle behandelt wurden. Es wurden drei Kanäle verwendet, darunter digitaler Phasenkontrast, FITC und der benutzerdefinierte QD-Kanal mit Anregung bei 405 nm und Emission bei 608 nm. DPC stellt ein Bild der allgemeinen Zellform bereit. Das DPC-Bild liefert einen ungefähren Hinweis auf die gesamte Zellmorphologie. Der Interessenbereich überschneidet sich mit dem DPC-Signal und reicht aus, um internalisierte QDs zu erkennen. Der FITC-Kanal zeigt, wie der ACE2-GFP die Lokalisierung ändert und sich in Regionen ansammelt, die mit QD-Spike kolokalisieren. Wenn die Konzentration von QD-Spike abnimmt, sind die QDs nicht mehr sichtbar und das ACE2-GFP-Signal ähnelt der Steuerung. Der Merge-Kanal demonstriert die Kolokalisierung von ACE2-GFP mit QD-Spike. Diese Objekte sind eine Mischung aus Flecken und größeren Ansammlungen, die mit der Analysesoftware segmentiert werden können. Die Feinabstimmung der Software-Analysemethode, die für die Bildsegmentierung verwendet wird, kann verwendet werden, um die Objekte von Interesse zu segmentieren.
Hier wurde ein Konzentrations-Wirkungs-Experiment mit sechs verschiedenen Konzentrationen von QD-Spike ab 20 nM durchgeführt, um optimale Konzentrationen von QD zu bestimmen (Abbildung 2A). QDs können so niedrig wie 2,22 nM verwendet werden und zeigen immer noch Bindung und Internalisierung. Es wird jedoch empfohlen, Konzentrationen von 20 nM oder höher zu verwenden, um eine robuste Reaktion zu gewährleisten.
Während der Konjugation mit der QD kann es zu einer Proteinaggregation kommen. Das Hauptproblem bei Aggregaten besteht darin, dass sie sich auf Zellen ansammeln und Artefakte im Bildsegmentierungsschritt verursachen. Aggregate können nicht in Zellen eindringen, und die Nanopartikel als Ganzes ähneln nicht mehr einem viralen Partikel (Abbildung 3). Aggregate können in der QD-Lösung als helle, verklumpte Niederschläge erkannt werden.
Dieser Assay kann auch zur Beurteilung von Biologika verwendet werden, z. B. zur Neutralisierung von Antikörpern, die den viralen Eintritt blockieren. QDs wurden mit neutralisierenden Antikörpern (Abbildung 4A), beginnend bei 30 μg/ml, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie zu den Zellen hinzugefügt wurden. Antikörper, die gegen den Referenzstamm Washington, SARS-CoV-2 RBD, erhoben wurden, wurden verwendet. Sie blockierten die Bindung, Internalisierung und verursachten eine Verringerung der gemessenen Punktzahl im Vergleich zu Zellen, die nur mit QD behandelt wurden (Abbildung 4B).
Abbildung 1: High-Content-Bildanalyse und Segmentierung von ACE2-GFP-Zellen, die mit QD608-Spike behandelt wurden. Repräsentative Bilder der genauen Segmentierung. Zuerst werden Kerne aus dem Kanal segmentiert, der den Kernmarker enthält, um eine ROI-Population zu erstellen. Aus der ROI-Population wird eine ROI-Region, die die Zelle umreißt, mithilfe des ACE2-GFP-Kanals segmentiert. Schließlich werden QD608-Spike-Spots aus der Cell ROI-Region segmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: QD608-Spike bindet hACE2 und wird in hACE2-GFP HEK293T-Zellen endozytosiert. (A) Bildmontage von hACE2-GFP (gelb) HEK293T-Zellen, die mit mehreren Konzentrationen von QD608-Spike (Magenta) oder nur Medien behandelt wurden. Der digitale Phasenkontrast (Cyan) wurde verwendet, um den Zellkörper zu visualisieren. Skalierungsbalken: 20 μm. (B) High-Content-Analyse von QD608-Spike-Spot-Zählungen normalisiert auf 20 nM QD608-Spike (100%) und die Kontrolle (0%). N = dreifache Vertiefungen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (S.D.) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aggregierter QD608-Spike wird nicht in hACE2-GFP HEK293T-Zellen internalisiert. Bildmontage von hACE2-GFP HEK293T-Zellen, die mit 10 nM QD608-Spike oder nur Medien behandelt wurden. Maßstabsbalken: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Neutralisierender Antikörper blockiert die Endozytose von QD608-Spike in hACE2-GFP HEK293T-Zellen. (A) Bildmontage von hACE2-GFP (gelb) HEK293T-Zellen, die mit QD608-Spike (Magenta) behandelt wurden, die mit abnehmenden Konzentrationen neutralisierender Antikörper vorinkubiert wurden, wobei der digitale Phasenkontrast (Cyan) zur Identifizierung von Zellkörpern verwendet wurde. Skalierungsbalken: 20 μm. (B) High-Content-Analyse von QD608-Spike-Spot-Zählungen, normalisiert auf reine Medienkontrolle (100%) und 10 nM QD608-Spike nur (0%). N = dreifache Vertiefungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die in diesem Artikel beschriebene Methode bietet die notwendigen Schritte für die Bildgebung funktionalisierter QDs in menschlichen Zellen mittels konfokaler Hochdurchsatzmikroskopie. Diese Methode eignet sich am besten für Zellen, bei denen Endozytose der Hauptweg des viralen Eintritts und nicht die Aktivität von TMPRSS2 und Membranfusion ist, da sie die Untersuchung von SARS-CoV-2 Spike und hACE2 Endozytose ermöglicht. Aufgrund der Art des QD-Modells und des C-terminalen His-Tags auf dem kommerziell erhältlichen Spike-Trimer würde jede TMPRSS2-Spaltung von Spike S1- und S2-Domänen die QD nur an die S2-Domäne anhängen12. Dies kann eine Internalisierung verhindern, da die RBD in S1 gefunden wird. Wenn also die Abfolge der Ereignisse an der Zelloberfläche genau wäre, wo hACE2 gebunden ist und dann TMPRSS2 Spike spaltet, wird ein negatives Signal ohne Internalisierung erwartet.
Da sich dieses Protokoll mit der Abbildung zellulärer Prozesse befasst, müssen die kultivierten Zellen einer Virusinfektion mit der Expression von hACE2 gegenüber freizügig sein. hACE2 kann vorübergehend in Zellen transfiziert werden, oder es kann eine stabile Zelllinie, die hACE2 exprimiert, erzeugt werden17. Es wird empfohlen, die hACE2-Expression und -Lokalisation mittels Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen hACE2 zu überprüfen, es sei denn, das hACE2 hat ein fluoreszierendes Protein-Tag wie GFP, das mikroskopisch beobachtet werden kann. GFP-getaggtes hACE2 bietet den zusätzlichen Vorteil, hACE2-Trafficking nach QD-Spike-Endozytose zu visualisieren. Einige Zelllinien mit endogener hACE2-Expression können verwendet werden, dies sollte jedoch durch Immunzytochemie bestätigt werden. In einigen Fällen liefert die endogene Expression nicht genügend hACE2-Bindungspartner für QD-Spike und kann zu einem Signal führen, das durch konfokale Hochdurchsatzmikroskopie schlecht detektiert wird.
Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Beschaffung hochwertiger QDs, die mit dem rekombinanten His-getaggten SARS-CoV-2 Spike konjugiert sind. Voraussetzung dafür ist ein richtig gereinigtes Protein, das ohne Aggregation an die QDs konjugiert werden kann. Aggregierte QDs haben mehrere Probleme, die ein erfolgreiches Experiment verhindern. Daher wird dringend empfohlen, QD-Spike mit Analysewerkzeugen (z. B. UV-sichtbare Spektroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie oder dynamische Lichtstreuung) vor dem vollständigen Experimentieren zu testen, um wertvolle Ressourcen zu schonen, wenn wertvolle Reagenzien getestet werden16. Während der Markierung von QDs mit Spike werden spezifische Konzentrationen von QD und Spike gemischt, um ein bestimmtes Verhältnis von Molekülen zu erreichen. Nur QD und Spike werden gemischt, und beide Lösungen sind hochgereinigt. Um die Markierung von QDs zu beurteilen, kann ein Acrylamidgel gegossen und mit QD allein sowie QD-konjugiert an Spike geladen werden, was zu schwereren Molekulargewichtsbändern führt.
Die in diesem Protokoll verwendeten QDs haben ein Fluoreszenz-Anregungs-/Emissionsspektrum, das auf 608 nm Emission nach UV-Anregung (≤405 nm) abgestimmt ist, da die meisten QDs eine hohe Absorption in der Nähe des UV-Bereichs aufweisen, was zu einer hohen Photolumineszenz führt18. Dies ist eine unkonventionelle Anregungs- / Emissionskombination, bei der ein Mikroskop über anpassbare Kanäle verfügen muss. Viele traditionelle konfokale Mikroskope können mit den richtigen Filtern und Laserlinien eingerichtet werden, um diese Anregung / Emission zu erreichen. Alternativ kann auch die Anregung der QD am ersten Absorptionsmaximum, etwa 10 bis 20 nm vom Emissionspeak entfernt (z. B. 592 nm für QD608, die hier verwendet wird), eine ausreichende Photolumineszenz erzeugen.
Die cloudbasierte Software, die in diesem High-Content-Analyseprotokoll verwendet wird, verwendet ein Benennungsschema, das auf vorherigen Schritten aufbaut. Beispielsweise sind die ersten Objekte, die segmentiert werden, Kerne, die eine Grundgesamtheit namens Nuceli erstellen. Anschließend kann die Zelle oder das Zytoplasma als ROI-Region innerhalb der Population Nuclei identifiziert werden. Die in der Bildanalysesoftware verwendete Terminologie legt den Namen der Grundgesamtheit von Objekten fest, die mit dem Kernbaustein als Nuklei segmentiert sind. Sie müssen jedoch nicht unbedingt Kerne sein und können Zellkörper sein, wenn kein Kernfarbstoff verfügbar ist. Dieses Benennungsschema kann auch innerhalb jedes Bausteinausgabenamens geändert und angepasst werden.
Unser Protokoll berücksichtigte keine Membranwechselwirkungen, aber dies konnte durch Hinzufügen eines zusätzlichen Membranflecks erreicht werden, der unabhängig vom ACE2-GFP-Verkehr ist. Um die unspezifische Bindung zu blockieren, sind 0,1% BSA in den Assay-Medien enthalten (DMEM + 0,1% BSA), und die Zellen werden ebenfalls in 10% FBS gezüchtet. Mutierte Spike-Proteine konnten verwendet werden, aber wir waren auf kommerziell erhältliche Spike-Proteine beschränkt. In diesem Fall war ein SARS-CoV-2-mutiertes nicht-ACE2-bindendes Spike-Protein nicht verfügbar.
Die QD-Nanopartikelmethode stellt eine leistungsstarke Technologie dar, um die Bindung und Internalisierung von Viren zu untersuchen, die auf Spike-vermitteltem Eintritt beruhen. Dieser Assay kann analog für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, wie in Abbildung 4 gezeigt, um potente antivirale Medikamente, die den Zelleintritt blockieren, wiederzuverwenden und zu identifizieren. Während dieses Protokoll nur die Verwendung von QDs demonstrierte, die an den Washington WA-1-Referenzstamm von SARS-CoV-2 konjugiert waren, kann dieser Assay leicht angepasst werden, um die Bindungseigenschaften neu auftretender Varianten wie Alpha, Beta, Gamma und Delta durch die Verwendung ihrer jeweiligen Spike-Proteine, die an QDs konjugiert sind, zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des National Center for Advancing Translational Sciences, NIH, unterstützt. Das Naval Research Laboratory stellte die Finanzierung über sein internes Nanoscience Institute zur Verfügung. Die Reagenzienvorbereitung wurde über den NRL COVID-19 Basisfonds unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
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