Summary
בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.
Abstract
פיתוח טכנולוגיות חדשות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תאית הקל על שיטות סינון בתפוקה גבוהה לגילוי תרופות. נקודות קוונטיות הן חלקיקים פלואורסצנטיים עם תכונות פוטופיזיות מעולות חדורות פוטולומינציה בהירה ויציבה, כמו גם רצועות פליטה צרות. נקודות קוונטיות הן כדוריות בצורתן, ועם השינוי הנכון של כימיית פני השטח, ניתן להשתמש בהן כדי להטות ביומולקולות עבור יישומים תאיים. מאפיינים אופטיים אלה, בשילוב עם היכולת לתפקד אותם עם ביומולקולות, הופכים אותם לכלי מצוין לחקירת אינטראקציות קולטן-ליגנד וסחר תאי. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בנקודות קוונטיות כדי לעקוב אחר הכריכה והאנדוציטוזיס של חלבון ספייק SARS-CoV-2. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך לניסויים המעוניינים לנצל נקודות קוונטיות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר בהקשר של פיזיולוגיה תאית.
Introduction
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לחוקרים להציץ לתוך הפעולות הפנימיות של התא באמצעות צבעים מיוחדים1, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית2, וננו-חלקיקים פלואורסצנטיים בצורה של נקודות קוונטיות (QDs)3. לתסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה של 2019 (SARS-CoV-2) המגפה העולמית, חוקרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד הנגיף אינטראקציה עם התא הן בקרום הפלזמה והן בציטופלסמה. לדוגמה, חוקרים הצליחו לקבל תובנות על הכריכה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 על פני השטח של הנגיף לאנזים אנושיים המרת אנגיוטנסין 2 (hACE2) על פני השטח של תאים אנושיים, הפנמה לאחר מכן באמצעות היתוך בקרום הפלזמה, אנדוציטוזיס של קומפלקס חלבון Spike:hACE2 4,5. תובנות נהדרות הושגו גם ליציאה SARS-CoV-2 מהתאים דרך הליזוזום באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות תאית, תכונה ייחודית של נגיפי קורונה שנחשבו בעבר להתרחש באמצעות ניצני שלפוחית מסורתיים מהגולגי, כפי שהוא עם וירוסים רבים אחרים6. טכניקת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית התאית, המהווה עמוד התווך של כמעט כל ההיבטים של המחקר הביולוגי, התקדמה בהכרח ברוחב ובהיקף היישומים שלה, החל מהדמיית סופר-רזולוציה של בעלי חיים שלמים וכלה בהדמיה רב-פרמטרית אוטומטית בעלת תוכן גבוה להקרנת סמים. כאן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית בעלת תוכן גבוה מוחלת על המחקר של הזנת תאים SARS-CoV-2 באמצעות QDs פלורסנט מצומדים לחלבון ספייק הנגיפי.
ניתוח תוכן גבוה של תמונות שנוצרו על ידי פלטפורמות הדמיה ביולוגית מאפשר מיצוי גדול יותר של תובנות ביולוגיות יקרות ערך מאשר פרמטרים בודדים כגון עוצמה מלאה, כי ניתן להשיג באמצעות קורא לוחות רב מודאלי7. על-ידי הפרדת האובייקטים בשדה ראייה באמצעות אלגוריתמי פילוח אוטומטיים, ניתן לנתח כל אובייקט או אוכלוסייה של אובייקטים לקבלת פרמטרים כגון עוצמה, שטח ומרקם בכל ערוץ פלואורסצנטי זמין8. שילוב מדידות רבות לתוך ערכות נתונים מרובות משתנים היא גישה שימושית עבור פרופיל פנוטיפי. כאשר הפנוטיפ הרצוי ידוע, כגון הפנמת QD בצורה של puncta, ניתן להשתמש במדידות הקשורות puncta כגון גודל, מספר, ועוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול.
תוכנה לניתוח הדמיית תוכן גבוהה מבוססת ענן יכולה להכיל מגוון גדול של יציאות נתונים של מכשירים, כולל פלטפורמת הדמיית התוכן הגבוהה. באמצעות שרת מבוסס ענן לאחסון תמונות וניתוח מקוון, המשתמש יכול להעלות את הנתונים שלו ממכשיר ההדמיה או מכונן הרשת שבו הנתונים מאוחסנים. חלק הניתוח של הפרוטוקול מתבצע בתוך סביבת תוכנת הענן, וניתן לייצא נתונים במגוון תבניות קובץ להדמיית נתונים במורד הזרם.
נגיף SARS-CoV-2 מורכב מחלבונים לא מבניים ומבניים המסייעים בהרכבו ובשכפולו. לספייק SARS-CoV-2 יש שני תחומים הנקראים S1 ו- S2, כאשר S1 מכיל את תחום איגוד הקולטן האחראי לאינטראקציות hACE2 בקרום הפלזמה9. ספייק נמצא גם לקיים אינטראקציה עם מולקולות אחרות בקרום הפלזמה שעשויות לשמש כקולטנים משותפים בנוסף hACE210,11. לאורך רצף חלבון ספייק ובמיוחד בממשק S1/S2, ישנם אתרי מחשוף פרוטאז המאפשרים היתוך בממברנה לאחר פרוטאז סרין transmembrane 2 (TMPRSS2)12. חלבונים שונים של ספייק SARS-CoV-2 רקומביננטיים הופקו מתחומים מחייבים קולטנים בודדים, ל- S1, S2, S1 עם S2, וגוזמי ספייק שלמים מספקים מסחריים מרובים לשימוש בפעילויות מחקר13.
בעבודה זו, פני השטח של QDs היה פונקציונלי עם גוזמי ספייק רקומביננטי המכילים תג היסטידין (QD-Spike). ה-QDs המיוצרים על ידי המעבדה הימית לחקר ננו-חומרים אופטיים מכילים ליבת קדמיום סלניד ומעטפת אבץ גופרתית14,15. האבץ על פני השטח של QD מתאם את שאריות ההיסטידין בתוך החלבון הרומביננטי כדי ליצור QD פונקציונלי הדומה לחלקיק נגיפי SARS-CoV-2 בצורה ובתפקוד. הדור של חלקיקים והטיית חלבון תואר בעבר באמצעות QD-מצומד קולטן מחייב domain15. שיטה זו מתארת את ההכנות לתרבות התאים, טיפול QD, רכישת תמונה ופרוטוקול ניתוח נתונים שיכול להנחות חוקר בחקר פעילות ספייק SARS-CoV-2 בהקשר הפיזיולוגי של תא אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
קו התא HEK293T המשמש במחקר זה הוא קו תאים מונצח. במחקר זה לא נעשה שימוש בנבדקים אנושיים או בעלי חיים.
1. פולחן תאים וזריעה
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, לבוש בציוד מגן אישי (כולל כפפות מעבדה, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות), הכן מדיום תרבית תאים על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), ו 250 מיקרוגרם / מ"ל G418.
- עבור 500 מ"ל של מדיה, הוסף 443.75 מ"ל של DMEM, 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של P/S ו- 1.25 מ"ל של G418.
- לסנן דרך בקבוק מסנן 0.2 מיקרומטר ולשמור על סטריליות כדי למנוע זיהום חיידקי.
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, זרעו את 60 הבארות הפנימיות של צלחת שחורה, שקופה תחתית, פולי-D-ליזין מצופה 96 בארות עם 20,000 תאים ב 100 μL לכל באר של מדיום תרבית התא. מלאו את 36 הבארות החיצוניות ב-100 μL לבאר של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
- כדי לספור את התאים, להוסיף 2 μL של כתם אקרידין וכתם יודיד פרופיד ל 18 μL של השעיית התא.
- טען 10 μL של פתרון זה לצד אחד של שקופית ספירת תאים.
- חזור על שלבים 1.2.1. ו-1.2.2. כדי לטעון את שני צידי השקופית.
- מקם את השקופית במונה תאים אוטומטי.
- בחר את פרוטוקול ספירת הפלואורסצנטיות ולחץ על ספירה. ספור את שני צידי השקופית וחשב את הממוצע של שתי צפיפות התאים החיים.
- כדי לחשב את נפח ההשעיה התאית הנדרשת, חלק את המספר הכולל של התאים הדרושים לצפיפות התא הממוצעת.
- בדוק את הבארות לאחר זריעה תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח כי צפיפות נכונה והפצה הושגו.
- לדגור על הצלחת לילה באינקובטור לח ב 37 °C (5° פרנהייט) עם 5% CO2.
2. טיפול בתאים עם QD-ספייק
- הכן 0.1% אלבומין סרום בקר (BSA) על ידי דילול במדיית הדמיה.
- עבור 10 מ"ל של מדיית הדמיה, להוסיף 130 μL של 7.5% BSA ומערבבים.
- בצלחת מאגר או בדיקה של 12 בארות, מדללים את מלאי ה-QD-Spike של 440 ננומטר (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) ל-20 ננומטר באמצעות 0.1% BSA במדיית הדמיה.
- עבור 1 באר של QD-ספייק, להוסיף 2.27 μL של 440 nM QD-ספייק ל 47.73 μL של 0.1% BSA הדמיה מדיה לריכוז סופי של 20 ננומטר.
- כדי ליצור דילול סדרתי של שש נקודות 1:3 (בשלושה עותקים), הוסף 14.26 μL של QD-Spike ל-285.74 μL של 0.1% מדיית הדמיה BSA כדי להפוך את הריכוז הגבוה ביותר של 20 ננומטר. הוסף 100 μL של 20 nM QD-ספייק ל 200 μL של 0.1% BSA מדיה כדי להפוך את הדילול השני של 6.67 nM QD-ספייק. חזור על הפעולה ארבע פעמים כדי ליצור את שש נקודות הריכוז.
- באמצעות שאיפה רב-ערוצית, הסר את כל המדיה שהוצאה מכל באר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לשטוף פעם אחת עם מדיה הדמיה (100 μL / טוב).
- שאפו 100 μL של מדיית הדמיה והוסיפו בחזרה 50 μL / באר של פתרון QD-Spike.
- לדגור על הצלחת במשך 3 שעות בחממה לחה ב 37 °C (5° C) עם 5% CO2. המשך לשלב 4.
3. קיבעון וכתמי גרעינים
- בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי, לבוש בציוד מגן אישי (כולל כפפות מעבדה, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות), הכינו 4% paraformaldehyde (PFA) ב-0.1% מדיית הדמיה BSA.
- לשאוף 50 μL של QD-ספייק מכל באר ולהוסיף 100 μL / היטב של 4% PFA.
- אל תתנו לבארות להתייבש. השתמש פיפטה רב ערוצית אוטומטית כדי למנוע ייבוש של הבארות (מומלץ).
- דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שלוש פעמים עם 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הכן את הצבע הגרעיני האדום העמוק על ידי דילול פתרון מלאי 5 mM לדילול 1:1000 ב- PBS.
- לשאוף את PBS ולהוסיף בחזרה 50 μL / היטב של צבע גרעיני מדולל.
- דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
- דמיינו את הלוח או האטם באמצעות אטם לוח להדמיה במועד מאוחר יותר. לאחסן את הצלחת ב 4 °C (5 °F). פלואורסצנטיות צריכה להיות יציבה במשך מספר שבועות או יותר.
4. הגדרת רכישה והדמיה
- הפעל את התוכנה עבור פלטפורמת ההדמיה. הפעל את פלטפורמת הדמיית התוכן הגבוהה והאור המופיע בשורת המצב אמור להיות דולק. אם המחשב אינו מחובר, התוכנה תעבור למצב ניתוח לא מקוון.
- היכנס לפלטפורמת ההדמיה.
- צור פרוטוקול רכישה חדש.
- בחר סוג צלחת כלוחית הדמיה תחתונה שקופה 96 היטב.
הערה: בחירת הלוחות בכלי עשויה להשתנות וניתן להתאים אותה אישית על-ידי טעינת הגדרות הלוחות הנכונות הכוללות מידות לוח כגון גובה, רוחב ומרחקים אחרים להגדרת מרווח טוב ונקודות מוקד. - בחרו 'מצב אופטי' כקונפוקלי והגדלה כטבילה במים פי 40.
- בחר Binning כ- 1.
- בחר את הערוצים ואת אורכי גל עירור פלואורסצנטי / פליטה כמתואר בשלבים 4.3.5-4.3.8. צלם תמונה כאשר ההגדרות נבחרות כדי להציג את התמונה ולוודא שההגדרות מתאימות.
הערה: ניגודיות פאזה דיגיטלית (DPC) תאפשר הדמיה של תאים חיים ללא כתם תא או צבע פלואורסצנטי. זה לא מומלץ עבור תאים קבועים. - בחר את המצב עבור DPC כגון חדות גבוהה כדי ליצור גופי תאים מוגדרים היטב. צלם תמונה כדי לוודא שהגדרה זו מתאימה, כפי שניתן לראות בחלון התמונה.
- בחר את ערוץ FITC לשימוש עם קו התא ACE2-GFP המאפשר תצוגה חזותית של סחר ב- ACE2 בתוך התא.
- ליצירת ערוץ מותאם אישית לערוץ QD, בחרו בתפריט הנפתח של המשולש עבור הערוץ ובחרו את עירור בטווח של 405 ננומטר ופליטה בטווח של 608 ננומטר.
- אם התאים תוקנו ונעשה שימוש בצבע גרעיני אדום עמוק, בחר את הערוץ האדום-רחוק עם פליטה גדולה מ-630 ננומטר כדי לסמן עוד יותר את גוף התא ולשמש כמסכת תאים.
- בחר באר עם אות QD ציטופלסמי חזק כדי להגדיר את זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום גובה Z. בצע את השלבים 4.3.10-4.3.13.
- בדוק אם גובה ברירת המחדל יוצר תמונה שבה התאים נמצאים במישור המוקד הרצוי. אם הפונקטה האנדוציטוזית היא אברון המטרה, מיקום ה-Z יהיה נמוך יותר מאשר אם קרום הפלזמה הוא אברון המטרה.
- בחרו זמן חשיפה שמפיק תמונה בהירה עם רמות אפור גבוהות פי שלושה לפחות מאות הרקע. זה בדרך כלל בין 100 ל 300 ms. ב 20 ננומטר, רמות האפור צריך להיות כ 6000 a.u. באמצעות זמן חשיפה של 200 מילישניות וכוח לייזר של 80%.
- בדוק את רמות האפור על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה שהופקה באמצעות התכונה 'תמונה' בכל ערוץ ובחירה באפשרות 'הצג עוצמה'. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אובייקט העניין או הרקע כדי להציג את רמת האפור עבור פיקסל זה.
- התאם את עוצמת הלייזר כדי לכוונן את עוצמת האובייקטים המעניינים.
- בחר סוג צלחת כלוחית הדמיה תחתונה שקופה 96 היטב.
- שמור את פרוטוקול הרכישה.
- עבור אל הפעל ניסוי והזן את שם הלוח.
- תריץ את הניסוי.
5. ניתוח נתונים
- יבא נתונים לתוכנת ההדמיה.
- לאחר רכישת כל התמונות, יצא מדידות לתוכנת ההדמיה. פעולה זו מחייבת יצירת שרת ויצירת חשבון. צור מסך לייצוא הנתונים לתוכנת ההדמיה.
- בתוכנת ההדמיה, בחר ניתוח תמונה כדי להתחיל בבניית פרוטוקול הניתוח.
- טען את המדידות מניסוי ההדמיה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ברשימת המסכים ולחיצה על בחר. מפת הלוחות של הבארות שצולמו והשדות המשויכים להן צריכה להיות גלויה בפינה השמאלית התחתונה של החלון.
- בחרו באר עם כתמי QD ציטופלסמיים בהירים כדי להתחיל בפילוח תמונות.
- באבן הבניין של תמונת קלט, בחר תיקון שדה שטוח.
- הוסף את אבן הבניין הבאה לפרוטוקול על-ידי בחירה באפשרות חפש גרעינים.
- כאן, השתמש ב- DPC או בערוץ האדום הרחוק כסמן גרעינים.
- בחר את השיטה שמפלחת תחילה במדויק את האובייקטים ולאחר מכן כוונן את הפילוח באמצעות התפריט הנפתח והתאמת המחוונים.
הערה: פילוח טוב מגדיר במדויק את אזור העניין (ROI) עבור הגרעין, התא והכתמים. יש ללכוד רק את הפיקסלים החיוביים עבור הסמן בתוך החזר השקעה בודד. יש לא לכלול אות רקע. אם הרקע נלכד בהחזר ההשקעה, ניתן להקטין את הרגישות של השיטה, או להגדיל את סף העוצמה כדי להגדיל את ההחמרה של אלגוריתם הפילוח. הדבר חל על כל אבני הבניין של חיפוש.
- לאחר מכן, הוסף את אבן הבניין מצא Cytoplasm כדי לזהות את הציטופלסמה.
- במקרה זה, השתמש בערוץ ACE2-GFP עבור פילוח ציטופלסמי.
- בחר את השיטה המזהה בצורה הטובה ביותר את הציטופלסמה של כל תא.
- לאחר מכן, הוסף את אבן הבניין של Find Spots כדי לזהות את הפונקטה QD-Spike.
- בחר את הגרעינים כאוכלוסיית ההחזר על ההשקעה.
- בחר את התא כאזור החזר ההשקעה. פעולה זו לוכדת את הפונקטה בתוך התא כולו.
- בחר את השיטה המזהה בצורה הטובה ביותר את פונקטת QD בכל תא.
- לאחר שכל האובייקטים בתמונה כבר מקוטעים וזוהו במדויק בבאר זו, לבחור בארות אחרות כדי להבטיח את אבני הבניין ואת ההגדרות ניתן להחיל בדרך כלל על הבארות האחרות ותנאים אחרים.
- הוסף את מאפייני העוצמה של חשב עבור כל האובייקטים המפולחים (גרעינים, ציטופלסמה/תאים וכתמים).
- הוסף את מאפייני חשב מורפולוגיה עבור כל האובייקטים המפולחים (גרעינים, ציטופלסמה/תאים וכתמים).
- הוסף את מאפייני חישוב המרקם עבור כל האובייקטים המפולחים (גרעינים, ציטופלסמה/תאים וכתמים).
- הגדר תוצאות על-ידי בחירת הפרמטרים עבור כל אוכלוסיה, כולל גרעינים וכתמים. מספר האובייקטים יכול לשמש כמדד עקיף של הכדאיות התא.
6. ייצוא נתונים
- לחץ על ניתוח אצווה. המתן לסיום הניתוח לפני שתמשיך לשלב הבא (שלב 6.2).
הערה: ניתוח האצווה מאפשר לשרת התוכנה לניתוח תמונה לטעון את פרוטוקול הניתוח באמצעות המדידות שנבחרו כדי לנתח את הנתונים מרחוק. - יצא את ערכת הנתונים למחשב מקומי או לכונן רשת.
- חבר את תוכנת ניתוח התמונה ליישום מסייע במחשב על-ידי הורדה ופתיחה של קובץ חיבור.
- בחר את סוג קובץ התוצאות (.txt, .csv, .html או XML מקורי).
- בחר את הגדרות תיקיית הקבצים עם התפריט הנפתח.
7. לנתח את הנתונים בגיליון אלקטרוני
- פתח את הקובץ המיוצא. אם זהו קובץ .csv, שמור אותו כתבנית קובץ .xls כדי לאפשר את השימוש בטבלאות ציר. אם נתיב הקובץ ארוך מדי, שמור את הקובץ .xls גבוה יותר בהירארכיית התיקיות כדי למנוע שגיאות בשמירה.
- הוסף עמודות לגיליון האלקטרוני המציינות את התנאים עבור כל באר. לדוגמה, סוג התא, וריאנטים QD-Spike, ריכוזי QD-Spike, זמן דגירה וכו '.
- בחר את הפונקציה Pivot Table ובנה את הטבלה באמצעות התנאים שנוספו כשורות, והפרמטרים הנמדדים כעמודות. בחר את החישוב עבור כל פרמטר כלומר, ממוצע, סטיית תקן, חציון, מינימום, מקסימום או ספירה.
- לנרמל את הנתונים כדי לשלוט בדגימות, כולל QDs unconjugateed כמו 0% ואת הריכוז הגבוה ביותר של QD-Spike כמו 100%.
הערה: אם מעריכים את היעילות של מעכבים כגון נטרול נוגדנים, לנרמל את הנתונים לתאים שטופלו במדיה בלבד (100% יעילות) ו QD-ספייק ללא מעכב (0% יעילות). - התווה את הנתונים בתוכנת גרפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הטיפול, QDs יופנמו כמו חלקיקים ייקשרו ACE2 על קרום הפלזמה ולגרום אנדוציטוזיס. באמצעות קו תא מבטא ACE2-GFP, טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ההפנמה, שני אותות QD ו- ACE2 מראים colocalization חזק. מתמונות אלה ניתן לבצע פילוח תמונות וניתוחים הבאים כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים כגון ספירת ספוטים (איור 1, איור 2B). איור 1A הוא מונטאז' של תאים המטופלים בריכוזים שונים של QD-Spike או מדיה רק כפקד. נעשה שימוש בשלושה ערוצים, כולל ניגודיות פאזה דיגיטלית, FITC וערוץ QD מותאם אישית עם עירור ב 405 ננומטר ופליטה ב 608 ננומטר. DPC מספק תמונה של צורת התא הכללית. תמונת DPC מספקת אינדיקציה משוערת למורפולוגיה של התא כולו. אזור העניין חופף לאות DPC ומספיק לזיהוי QDs מופנם. ערוץ FITC מציג את הלוקליזציה המשתנה של ACE2-GFP ומצטבר באזורים התואמים את QD-Spike. ככל שהריכוז של QD-Spike פוחת, QDs אינם גלויים עוד ואות ACE2-GFP דומה לשליטה. ערוץ המיזוג מדגים את colocalization של ACE2-GFP עם QD-Spike. אובייקטים אלה הם תערובת של כתמים והצטברויות גדולות יותר שניתן לפלח עם תוכנת הניתוח. כוונון עדין של שיטת ניתוח התוכנה המשמשת לפילוח תמונות יכול לשמש לפלח את האובייקטים המעניינים.
כאן בוצע ניסוי בתגובת ריכוז עם שישה ריכוזים שונים של QD-Spike, החל מ-20 ננומטר, כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים של QD (איור 2A). ניתן להשתמש ב- QDs עד 2.22 ננומטר ועדיין להציג איגוד והפנמה. עם זאת, מומלץ להשתמש בריכוזים של 20 ננומטר ומעלה כדי להבטיח תגובה חזקה.
במהלך ההטיה ל-QD, תיתכן הצטברות חלבונים. הבעיה העיקרית עם אגרגטים היא שהם יצטברו על גבי תאים ולגרום חפצים בשלב פילוח התמונה. אגרגטים לא יוכלו להיכנס לתאים, והננו-חלקיקים בכללותם כבר לא יהיו דומים לחלקיק ויראלי (איור 3). ניתן להבחין באגרגטים בתמיסת QD כמשקעים בהירים ומגושמים.
בדיקה זו יכולה לשמש גם להערכת תרופות ביולוגיות, כגון נטרול נוגדנים החוסמים כניסה ויראלית. QDs דוגר עם נוגדנים מנטרלים (איור 4A), החל מ 30 מיקרוגרם / מ"ל, במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני תוספת לתאים. נוגדנים שהועלו נגד זן וושינגטון התייחסות, SARS-CoV-2 RBD, שימשו. הם חסמו את האיגוד, ההפנמה וגרמו לירידה בספירת הנקודות הנמדדת בהשוואה לתאים שטופלו ב-QD בלבד (איור 4B).
איור 1: ניתוח וסגמנטציה של תמונות בעלות תוכן גבוה של תאי ACE2-GFP שטופלו ב-QD608-Spike. תמונות מייצגות של פילוח מדויק. ראשית, גרעינים מפולחים מהערוץ המכיל את הסמן הגרעיני כדי ליצור אוכלוסיית החזר השקעה. מאוכלוסיית ההחזר על ההשקעה, אזור החזר השקעה המתאר את התא מחולק באמצעות ערוץ ACE2-GFP. לבסוף, כתמי QD608-Spike מפולחים מאזור החזר על ההשקעה בתא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: QD608-Spike קושר hACE2 והוא אנדוציטוזיס בתאי hACE2-GFP HEK293T. (A) מונטאז' תמונה של תאי hACE2-GFP (צהובים) HEK293T שטופלו במספר ריכוזים של QD608-Spike (מגנטה) או מדיה בלבד. ניגודיות פאזה דיגיטלית (ציאן) שימשה להדמיה של גוף התא. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) ניתוח תוכן גבוה של QD608-ספייק ספוט ספירות מנורמל ל 20 ננומטר QD608-ספייק (100%) ואת השליטה (0%). N = בארות משולשות. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (S.D.). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: QD608-Spike מצטבר אינו מופנם לתאי hACE2-GFP HEK293T. מונטאז' תמונה של תאי hACE2-GFP HEK293T שטופלו ב-10 ננומטר QD608-Spike או במדיה בלבד. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נטרול נוגדנים חוסם אנדוציטוזיס של QD608-ספייק בתאי hACE2-GFP HEK293T. (A) מונטאז' תמונה של תאי hACE2-GFP (צהובים) HEK293T שטופלו ב- QD608-Spike (מגנטה) דגירה מראש עם ריכוזים פוחתים של נוגדנים מנטרלים, תוך שימוש בניגודיות פאזה דיגיטלית (ציאן) לזיהוי גופי תאים. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) ניתוח תוכן גבוה של QD608-ספייק ספוט ספירות מנורמל לבקרה במדיה בלבד (100%) ו 10 nM QD608-ספייק בלבד (0%). N = בארות משולשות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה מספקת את השלבים הדרושים להדמיית QDs פונקציונליים בתאים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה. שיטה זו מתאימה ביותר לתאים שבהם אנדוציטוזיס היא המסלול העיקרי של כניסה ויראלית ולא הפעילות של TMPRSS2 והיתוך ממברנה, כפי שהוא מאפשר את המחקר של SARS-CoV-2 ספייק ו hACE2 אנדוציטוזיס. בגלל אופיו של דגם QD וה- C-terminal His-tag על חותך ספייק הזמין מסחרית, כל מחשוף TMPRSS2 של דומיינים ספייק S1 ו- S2 ישאיר את ה- QD מחובר לתחום S2 רק 12. הדבר עשוי למנוע הפנמה, בהתחשב בכך שה- RBD נמצא ב- S1. לכן, אם רצף האירועים על פני התא היה מדויק, שבו hACE2 מאוגד ולאחר מכן TMPRSS2 בקע ספייק, אות שלילי ללא הפנמה צפוי.
כמו פרוטוקול זה עוסק בתהליכים תאיים הדמיה, התאים בתרבית חייב להיות מתירני לזיהום ויראלי עם הביטוי של hACE2. hACE2 עשוי להיות מועבר באופן חולף לתאים, או קו תא יציב המבטא hACE2 עשוי להיווצר17. מומלץ לאמת ביטוי hACE2 ולוקליזציה באמצעות אימונופלואורסצנטיות עם נוגדנים נגד hACE2, אלא אם כן hACE2 יש תג חלבון פלואורסצנטי כגון GFP שניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה. hACE2 מתויג GFP מעניק את היתרון הנוסף של הדמיית סחר hACE2 בעקבות אנדוציטוזיס QD-Spike. קווי תאים מסוימים עם ביטוי hACE2 אנדוגני עשויים לשמש, אך יש לאשר זאת באמצעות אימונוציטוכימיה. במקרים מסוימים, הביטוי האנדוגני אינו מספק מספיק שותפי איגוד hACE2 עבור QD-Spike ועלול לגרום לאות שזוהה בצורה גרועה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית בעלת תפוקה גבוהה.
צעד קריטי אחד בפרוטוקול כולל רכש של QDs באיכות גבוהה מצטרפים רקומביננטי SARS-CoV-2 ספייק. התנאי המוקדם לכך הוא חלבון מטוהר כראוי שניתן להטיח אותו ל- QDs מבלי לגרום לצבירה. QDs צבור יהיו מספר בעיות המונעות ניסוי מוצלח. לכן, בדיקה של QD-Spike באמצעות כלי ניתוח (למשל, ספקטרוסקופיה גלויה UV, מיקרוסקופיה אלקטרוני שידור, או פיזור אור דינמי) לפני ניסויים מלאים מומלץ מאוד כדי לשמר משאבים יקרים אם בדיקת ריאגנטים יקרים16. במהלך התיוג של QDs עם ספייק, ריכוזים ספציפיים של QD ו Spike מעורבים כדי להשיג יחס מסוים של מולקולות. רק QD וספייק מעורבים, ושני הפתרונות מטוהרים מאוד. כדי להעריך את התיוג של QDs, ג'ל אקרילאמיד יכול להיות יצוק וטעון עם QD לבד, כמו גם QD-מצומד ספייק, אשר גורם רצועות משקל מולקולרי כבד יותר.
QDs המשמשים בפרוטוקול זה יש ספקטרום עירור פלואורסצנטיות / פליטה מכוון פליטה 608 ננומטר בעקבות עירור UV (≤405 ננומטר) מאז רוב QDs יש ספיגה גבוהה ליד טווח UV לייצר פוטולומינscence גבוהה18. זהו שילוב עירור/פליטה לא שגרתי שדורש מיקרוסקופ כדי שיהיו לו ערוצים הניתנים להתאמה אישית. מיקרוסקופים קונפוקליים מסורתיים רבים ניתן להגדיר עם המסננים הנכונים קווי לייזר כדי להשיג עירור זה / פליטה. לחלופין, עירור של QD במקסימום הקליטה הראשונה, כ 10 עד 20 ננומטר מפסגת הפליטה (למשל, 592 ננומטר עבור QD608 בשימוש כאן), יוכל גם לייצר פוטולומינציה מספקת.
התוכנה מבוססת הענן המשמשת בפרוטוקול ניתוח תוכן גבוה זה משתמשת בערכת מתן שמות המתבססת על שלבים קודמים. לדוגמה, האובייקטים הראשונים המפולחים הם גרעינים, היוצרים אוכלוסיה הנקראת גרעינים. בעקבות זאת, התא או הציטופלסמה ניתן לזהות כאזור החזר על ההשקעה בתוך האוכלוסייה גרעינים. המינוח המשמש בתוכנת ניתוח התמונה מגדיר את שם אוכלוסיית האובייקטים המפולחים באמצעות אבן הבניין של הגרעין כגרעין. עם זאת, הם לא בהכרח צריכים להיות גרעינים והוא יכול להיות גופי תאים אם אין צבע גרעיני זמין. ניתן גם לשנות ערך מתן שמות זה ולהתאים אישית אותו בתוך כל שם פלט של אבן בניין.
הפרוטוקול שלנו לא לקח בחשבון אינטראקציות ממברנה, אבל זה יכול להיעשות על ידי הוספת כתם ממברנה נוסף שאינו תלוי סחר ACE2-GFP. כדי לחסום איגוד לא ספציפי, 0.1% BSA נכלל במדיה הבסיסית (DMEM + 0.1% BSA), והתאים גדלים גם ב- 10% FBS. חלבוני ספייק מוטנטיים יכולים לשמש, אבל היינו מוגבלים לחלבוני ספייק זמינים מסחרית. במקרה זה, חלבון ספייק מחייב SARS-CoV-2 שאינו ACE2 לא היה זמין.
שיטת חלקיקי QD מציגה טכנולוגיה רבת עוצמה לחקר האיגוד וההפנמה של וירוסים המסתמכים על כניסה בתיווך ספייק. בדיקה זו יכולה לשמש להקרנה בתפוקה גבוהה באופן אנלוגי, כפי שמוצג באיור 4, כדי לשנות את ייעודם ולזהות תרופות אנטי-ויראליות חזקות שחוסמות את הכניסה לתאים. בעוד פרוטוקול זה רק הדגים את השימוש QDs מצומדים לזן הייחוס WA-1 וושינגטון של SARS-CoV-2, בדיקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי ללמוד את המאפיינים המחייבים של גרסאות חדשות המתעוררות כגון אלפא, בטא, גמא ודלתא באמצעות שימוש בחלבוני ספייק שלהם בהתאמה מצומדים QDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, NIH. מעבדת המחקר הימית סיפקה מימון באמצעות המכון הפנימי שלה למדעי הננו- מדעים. הכנת ריאגנט נתמכה באמצעות קרן הבסיס NRL COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
