Summary
In questo protocollo, i punti quantici coniugati al picco RICOMBINANTE SARS-CoV-2 consentono saggi basati su cellule per monitorare il legame dello spike a hACE2 sulla membrana plasmatica e la successiva endocitosi delle proteine legate nel citoplasma.
Abstract
Lo sviluppo di nuove tecnologie per la microscopia a fluorescenza cellulare ha facilitato i metodi di screening ad alto rendimento per la scoperta di farmaci. I punti quantici sono nanoparticelle fluorescenti con eccellenti proprietà fotofisiche intrise di fotoluminescenza luminosa e stabile e bande di emissione strette. I punti quantici sono di forma sferica e, con la corretta modifica della chimica superficiale, possono essere utilizzati per coniugare biomolecole per applicazioni cellulari. Queste proprietà ottiche, unite alla capacità di funzionalizzarle con biomolecole, le rendono un ottimo strumento per studiare le interazioni recettore-ligando e il traffico cellulare. Qui, presentiamo un metodo che utilizza punti quantici per tracciare il legame e l'endocitosi della proteina spike SARS-CoV-2. Questo protocollo può essere utilizzato come guida per gli sperimentatori che cercano di utilizzare i punti quantici per studiare le interazioni proteina-proteina e il traffico nel contesto della fisiologia cellulare.
Introduction
La microscopia a fluorescenza consente ai ricercatori di scrutare il funzionamento interno della cellula utilizzando coloranti specializzati1, proteine fluorescenti geneticamente codificate2 e nanoparticelle fluorescenti sotto forma di punti quantici (QD)3. Per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus della pandemia globale del 2019 (SARS-CoV-2), i ricercatori hanno impiegato la microscopia a fluorescenza per capire come il virus interagisce con la cellula sia sulla membrana plasmatica che nel citoplasma. Ad esempio, i ricercatori sono stati in grado di ottenere informazioni sul legame della proteina Spike SARS-CoV-2 sulla superficie del virione all'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) sulla superficie delle cellule umane, sulla successiva internalizzazione tramite fusione alla membrana plasmatica e sull'endocitosi del complesso proteico Spike:hACE24,5. Sono state acquisite anche grandi intuizioni sull'uscita di SARS-CoV-2 dalle cellule attraverso il lisosoma utilizzando l'imaging a fluorescenza cellulare, una caratteristica unica dei coronavirus precedentemente ritenuta verificarsi tramite vescicole tradizionali in erba dal Golgi, come è con molti altri virus6. Un pilastro di quasi tutti gli aspetti della ricerca biologica, la tecnica di microscopia a fluorescenza cellulare è necessariamente avanzata nella sua ampiezza e portata di applicazioni dall'imaging a super-risoluzione di animali interi all'imaging multiparametrico automatizzato ad alto contenuto per lo screening dei farmaci. Qui, la microscopia confocale automatizzata ad alto contenuto viene applicata allo studio dell'ingresso delle cellule SARS-CoV-2 utilizzando QD fluorescenti coniugati alla proteina spike virale.
L'analisi ad alto contenuto delle immagini generate da piattaforme di imaging biologico consente una maggiore estrazione di preziose informazioni biologiche rispetto a singoli parametri come l'intensità del pozzo intero, che si otterrebbe utilizzando un lettore di lastre multimodale7. Separando gli oggetti in un campo visivo utilizzando algoritmi di segmentazione automatizzati, ogni oggetto o una popolazione di oggetti può essere analizzato per parametri quali intensità, area e trama in ciascun canale di fluorescenza disponibile8. La combinazione di molte misurazioni in set di dati multivariati è un approccio utile per la profilazione fenotipica. Quando il fenotipo desiderato è noto, come l'internalizzazione QD sotto forma di puncta, è possibile utilizzare le misurazioni relative al puncta come dimensioni, numero e intensità per valutare l'efficacia di un trattamento.
Il software di analisi di imaging ad alto contenuto basato su cloud può ospitare un'ampia varietà di output di dati strumentali, inclusa la piattaforma di imaging ad alto contenuto. Utilizzando un server basato su cloud per l'archiviazione delle immagini e l'analisi online, l'utente è in grado di caricare i propri dati dallo strumento di imaging o dall'unità di rete in cui sono archiviati i dati. La parte di analisi del protocollo viene condotta all'interno dell'ambiente software cloud e i dati possono essere esportati in una varietà di formati di file per la visualizzazione dei dati a valle.
Il virus SARS-CoV-2 è composto da proteine non strutturali e strutturali che aiutano nel suo assemblaggio e replicazione. Lo spike SARS-CoV-2 ha due domini chiamati S1 e S2, con S1 contenente il dominio di legame del recettore responsabile delle interazioni hACE2 sulla membrana plasmatica9. Spike è stato anche trovato per interagire con altre molecole sulla membrana plasmatica che possono agire come co-recettori in aggiunta a hACE210,11. In tutta la sequenza della proteina spike e in particolare all'interfaccia S1/S2, ci sono siti di scissione della proteasi che consentono la fusione sulla membrana dopo la serina proteasi 2 transmembrana (TMPRSS2)12. Varie proteine Spike RICOMBINANTI SARS-CoV-2 sono state prodotte da singoli domini di legame del recettore, a S1, S2, S1 con S2 e trimeri spike interi da più fornitori commerciali per l'uso in attività di ricerca13.
In questo lavoro, la superficie dei QD è stata funzionalizzata con trimeri spike ricombinanti che contengono un tag di istidina (QD-Spike). I QD prodotti dalla Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contengono un nucleo di seleniuro di cadmio e un guscio di solfuro di zinco14,15. Lo zinco sulla superficie QD coordina i residui di istidina all'interno della proteina ricombinante per formare un QD funzionalizzato che assomiglia a una particella virale SARS-CoV-2 nella forma e nella funzione. La generazione delle nanoparticelle e della coniugazione proteica è stata precedentemente descritta utilizzando il dominio di legame del recettore coniugato QD15. Questo metodo descrive i preparati di coltura cellulare, il trattamento QD, l'acquisizione di immagini e il protocollo di analisi dei dati che possono guidare un ricercatore nello studio dell'attività di SARS-CoV-2 Spike nel contesto fisiologico di una cellula umana.
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Protocol
La linea cellulare HEK293T utilizzata in questo studio è una linea cellulare immortalata. In questo studio non sono stati utilizzati soggetti umani o animali.
1. Coltivazione e semina cellulare
- All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, indossando dispositivi di protezione individuale (inclusi guanti da laboratorio, cappotto da laboratorio e occhiali di sicurezza), preparare il terreno di coltura cellulare integrando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina / streptomicina (P / S) e 250 μg / mL G418.
- Per 500 mL di supporti, aggiungere 443,75 mL di DMEM, 50 mL di FBS, 5 mL di P/S e 1,25 mL di G418.
- Filtrare attraverso un pallone filtrante da 0,2 μm e mantenere la sterilità per evitare la contaminazione batterica.
- All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, seminare i 60 pozzetti interni di una piastra a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina nera, con fondo chiaro, rivestita in poli-D-lisina con 20.000 cellule in 100 μL per pozzetto di terreno di coltura cellulare. Riempire i 36 pozzetti esterni con 100 μL per pozzetto di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Per contare le cellule, aggiungere 2 μL di acridina arancione e macchia di ioduro di propidio a 18 μL di sospensione cellulare.
- Caricare 10 μL di questa soluzione in un lato di una slitta di conteggio delle celle.
- Ripetere i passaggi 1.2.1. e 1.2.2. per caricare entrambi i lati della diapositiva.
- Posizionare la diapositiva in un contatore di celle automatizzato.
- Selezionare il protocollo di conteggio della fluorescenza e premere Conta. Contare entrambi i lati della diapositiva e calcolare la media delle due densità di cellule vive.
- Per calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto, dividere il numero totale di celle necessarie per la densità media delle celle.
- Ispezionare i pozzetti dopo la semina al microscopio ottico per assicurarsi che siano state raggiunte una densità e una distribuzione adeguate.
- Incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
2. Trattamento delle cellule con QD-Spike
- Preparare l'albumina sierica bovina allo 0,1% (BSA) diluendo in mezzi di imaging.
- Per 10 mL di supporti di imaging, aggiungere 130 μL di BSA al 7,5% e mescolare.
- In un serbatoio o in una piastra di saggio a 12 pozzi, diluire lo stock QD-Spike da 440 nM (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) a 20 nM utilizzando lo 0,1% di BSA nei mezzi di imaging.
- Per 1 pozzetto di QD-Spike, aggiungere 2,27 μL di 440 nM QD-Spike a 47,73 μL di mezzo di imaging BSA allo 0,1% per una concentrazione finale di 20 nM.
- Per generare una diluizione seriale 1:3 a sei punti (in triplice copia), aggiungere 14,26 μL di QD-Spike a 285,74 μL di mezzo di imaging BSA allo 0,1% per ottenere la massima concentrazione di 20 nM. Aggiungere 100 μL di 20 nM QD-Spike a 200 μL di 0,1% di BSA per effettuare la seconda diluizione di 6,67 nM QD-Spike. Ripeti quattro volte per generare i sei punti di concentrazione.
- Utilizzando un aspiratore multicanale, rimuovere tutti i supporti esauriti da ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta multicanale, lavare una volta con un supporto di imaging (100 μL / pozzetto).
- Aspirare 100 μL di supporti di imaging e aggiungere di nuovo 50 μL/pozzetto della soluzione QD-Spike.
- Incubare la piastra per 3 ore in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Continuare con il passaggio 4.
3. Fissazione e colorazione dei nuclei
- All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, indossando dispositivi di protezione individuale (inclusi guanti da laboratorio, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza), preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in uno 0,1% di supporti di imaging BSA.
- Aspirare 50 μL di QD-Spike da ciascun pozzetto e aggiungere 100 μL/pozzetto del 4% di PFA.
- Non lasciare asciugare i pozzetti. Utilizzare una pipetta multicanale automatizzata per evitare l'essiccazione dei pozzetti (consigliato).
- Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Preparare il colorante nucleare rosso intenso diluendo la soluzione madre da 5 mM a 1:1000 diluizione in PBS.
- Aspirare il PBS e aggiungere di nuovo 50 μL/pozzetto di colorante nucleare diluito.
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con PBS.
- Immagine della piastra o del sigillo utilizzando un sigillante per lastre per l'imaging in un secondo momento. Conservare il piatto a 4 °C. La fluorescenza dovrebbe essere stabile per diverse settimane o più.
4. Configurazione dell'acquisizione e imaging
- Avviare il software per la piattaforma di imaging. Accendi la piattaforma di imaging ad alto contenuto e la spia sulla barra di stato dovrebbe essere accesa. Se la macchina non è collegata, il software entrerà in modalità di analisi offline.
- Accedi alla piattaforma di imaging.
- Creare un nuovo protocollo di acquisizione.
- Selezionare Tipo di piastra come piastra di imaging inferiore trasparente a 96 pozzetti.
NOTA: la selezione della piastra nello strumento può variare e può essere personalizzata caricando le definizioni corrette della piastra che includono dimensioni della piastra come altezza, larghezza e altre distanze per definire la spaziatura del pozzo e i punti focali. - Selezionare la modalità ottica come confocale e l'ingrandimento come immersione in acqua 40x.
- Selezionare Binning come 1.
- Scegliere i canali e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione fluorescenti come descritto nei passaggi 4.3.5-4.3.8. Scatta un'istantanea quando le impostazioni sono selezionate per visualizzare l'immagine e assicurarti che le impostazioni siano appropriate.
NOTA: Digital Phase Contrast (DPC) consentirà la visualizzazione di cellule vive senza una macchia cellulare o un colorante fluorescente. Non è raccomandato per le celle fisse. - Selezionare la modalità per DPC, ad esempio Contrasto elevato, per produrre corpi cellulari ben definiti. Scatta un'istantanea per confermare che questa impostazione è appropriata, come mostrato nella finestra dell'immagine.
- Selezionare il canale FITC da utilizzare con la linea cellulare ACE2-GFP che consente la visualizzazione del traffico ACE2 all'interno della cella.
- Per creare un canale personalizzato per il canale QD, selezionare il menu a discesa a triangolo per il canale e scegliere l'eccitazione nell'intervallo 405 nm e l'emissione nell'intervallo 608 nm.
- Se le cellule sono state fissate e si è utilizzato un colorante nucleare rosso intenso, selezionare il canale rosso lontano con emissione superiore a 630 nm per delineare ulteriormente il corpo cellulare e agire come una maschera cellulare.
- Selezionare un pozzo con un forte segnale QD citoplasmatico per impostare il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione dell'altezza Z. Seguire i passaggi da 4.3.10-4.3.13.
- Verificate se l'altezza predefinita produce un'immagine in cui le celle si trovano nel piano focale desiderato. Se i puncta endocitosi sono l'organello bersaglio, la posizione Z sarà inferiore rispetto a se la membrana plasmatica è l'organello bersaglio.
- Scegli un tempo di esposizione che produca un'immagine luminosa con livelli di grigio almeno tre volte superiori al segnale di sfondo. Questo è in genere tra 100 e 300 ms. A 20 nM, i livelli di grigio dovrebbero essere di circa 6000 u.a. utilizzando un tempo di esposizione di 200 ms e una potenza laser dell'80%.
- Controlla i livelli di grigio facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine prodotta con la funzione Istantanea in ciascun canale e selezionando Mostra intensità. Quindi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto di interesse o sullo sfondo per visualizzare il livello di grigio per quel pixel.
- Regola la potenza del laser per mettere a punto l'intensità degli oggetti di interesse.
- Selezionare Tipo di piastra come piastra di imaging inferiore trasparente a 96 pozzetti.
- Salvare il protocollo di acquisizione.
- Passare a Esegui esperimento e immettere il nome della piastra.
- Eseguire l'esperimento.
5. Analisi dei dati
- Importare i dati nel software di imaging.
- Dopo aver acquisito tutte le immagini, esportare le misurazioni nel software di imaging. Ciò richiede la creazione di un server e la creazione di un account. Creare una schermata per i dati da esportare nel software di imaging.
- Nel software di imaging, selezionare Analisi immagini per iniziare a creare il protocollo di analisi.
- Caricare le misurazioni dall'esperimento di imaging facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file nell'elenco delle schermate e facendo clic su Seleziona. La mappa delle lastre dei pozzi ripresi e dei campi associati dovrebbe essere visibile nell'angolo in basso a sinistra della finestra.
- Scegli un pozzo con punti QD citoplasmatici luminosi per iniziare la segmentazione dell'immagine.
- Nel blocco predefinito dell'immagine di input, selezionare Correzione campo piatto.
- Aggiungere il blocco predefinito successivo al protocollo selezionando Trova nuclei.
- Qui, usa il DPC o il canale rosso lontano come marcatore nuclei.
- Selezionare prima il metodo che segmenta accuratamente gli oggetti, quindi ottimizzare la segmentazione utilizzando il menu a discesa e regolando i cursori.
NOTA: una buona segmentazione definisce con precisione la regione di interesse (ROI) per il nucleo, la cellula e le macchie. Solo i pixel positivi per il marcatore devono essere acquisiti all'interno di un singolo ROI. Il segnale di sfondo dovrebbe essere escluso. Se lo sfondo viene catturato nel ROI, la sensibilità del metodo può essere diminuita o la soglia di intensità può essere aumentata per aumentare il rigore dell'algoritmo di segmentazione. Questo è applicabile a tutti i blocchi predefiniti Trova.
- Quindi, aggiungi il blocco di costruzione Trova citoplasma per identificare il citoplasma.
- In questo caso, utilizzare il canale ACE2-GFP per la segmentazione citoplasmatica.
- Seleziona il metodo che meglio identifica il citoplasma di ogni cellula.
- Quindi, aggiungi il blocco di costruzione Trova punti per identificare la puntata QD-Spike.
- Selezionare Nuclei come popolazione ROI.
- Selezionare la cella come area ROI. Questo cattura il puncta all'interno dell'intera cellula.
- Selezionare il metodo che meglio identifica il QD puncta in ogni cella.
- Una volta che tutti gli oggetti nell'immagine sono stati segmentati e identificati con precisione in questo pozzo, scegliere altri pozzi per garantire che i blocchi e le impostazioni di costruzione possano essere generalmente applicati agli altri pozzi e ad altre condizioni.
- Aggiungere il Calcola proprietà di intensità per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
- Aggiungi il Calcola proprietà morfologiche per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
- Aggiungere il Calcola proprietà texture per tutti gli oggetti segmentati (nuclei, citoplasma/cellule e macchie).
- Definisci i risultati selezionando i parametri per ogni popolazione, inclusi nuclei e punti. Il numero di oggetti può essere utilizzato come misura indiretta della vitalità cellulare.
6. Esporta i dati
- Fare clic su Analisi batch. Attendere il completamento dell'analisi prima di procedere al passaggio successivo (passaggio 6.2).
NOTA: l'analisi batch consente al server software di analisi delle immagini di caricare il protocollo di analisi utilizzando le misurazioni selezionate per analizzare i dati in remoto. - Esportare il set di dati in un computer locale o in un'unità di rete.
- Collegare il software di analisi delle immagini a un'applicazione di supporto sul computer scaricando e aprendo un file di connessione.
- Selezionare il tipo di file dei risultati (.txt, .csv, .html o XML nativo).
- Scegli le impostazioni della cartella file con il menu a discesa.
7. Analizza i dati in un foglio di calcolo
- Aprire il file esportato. Se si tratta di un file .csv, salvarlo come formato di file .xls per consentire l'utilizzo di tabelle pivot. Se il percorso del file è troppo lungo, salvare il file .xls più in alto nella gerarchia di cartelle per evitare errori di salvataggio.
- Aggiungere colonne al foglio di calcolo che designano le condizioni per ogni pozzo. Ad esempio, il tipo di cellula, le varianti QD-Spike, le concentrazioni QD-Spike, il tempo di incubazione, ecc.
- Scegliere la funzione Tabella pivot e creare la tabella utilizzando le condizioni aggiunte come Righe e i parametri misurati come Colonne. Selezionare il calcolo per ciascun parametro, ad esempio Media, Deviazione standard, Mediana, Min, Max o Conteggio.
- Normalizzare i dati per controllare i campioni, inclusi i QD non coniugati come 0% e la più alta concentrazione di QD-Spike come 100%.
NOTA: Se si valuta l'efficacia di inibitori come gli anticorpi neutralizzanti, normalizzare i dati alle cellule trattate solo con media (efficacia al 100%) e QD-Spike senza inibitore (efficacia allo 0%). - Traccia i dati in un software di creazione grafica.
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Representative Results
Dopo il trattamento, i QD saranno internalizzati poiché la nanoparticella si legherà ad ACE2 sulla membrana plasmatica e indurrà l'endocitosi. Utilizzando una linea cellulare che esprime ACE2-GFP, la traslocazione di QD e ACE2 può essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una volta internalizzati, i due segnali QD e ACE2 mostrano una forte colocalizzazione. Da queste immagini è possibile eseguire la segmentazione delle immagini e la successiva analisi per estrarre parametri rilevanti come il conteggio degli spot (Figura 1, Figura 2B). La Figura 1A è un montaggio di cellule trattate con diverse concentrazioni di QD-Spike o media solo come controllo. Sono stati utilizzati tre canali, tra cui il contrasto di fase digitale, IL FITC e il canale QD personalizzato con eccitazione a 405 nm ed emissione a 608 nm. DPC fornisce un'immagine della forma generale della cella. L'immagine DPC fornisce un'indicazione approssimativa dell'intera morfologia cellulare. L'area di interesse si sovrappone al segnale DPC ed è sufficiente per rilevare QD internalizzati. Il canale FITC mostra l'ACE2-GFP che cambia localizzazione e si accumula nelle regioni che si colocalizzano con QD-Spike. Man mano che la concentrazione di QD-Spike diminuisce, i QD non sono più visibili e il segnale ACE2-GFP è simile al controllo. Il canale di unione dimostra la colocalizzazione di ACE2-GFP con QD-Spike. Questi oggetti sono una miscela di macchie e accumuli più grandi che possono essere segmentati con il software di analisi. La messa a punto del metodo di analisi del software utilizzato per la segmentazione delle immagini può essere utilizzata per segmentare gli oggetti di interesse.
Qui è stato eseguito un esperimento concentrazione-risposta con sei diverse concentrazioni di QD-Spike, a partire da 20 nM, per determinare le concentrazioni ottimali di QD (Figura 2A). I QD possono essere utilizzati a partire da 2,22 nM e mostrano ancora binding e internalizzazione. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare concentrazioni di 20 nM o superiori per garantire una risposta robusta.
Durante la coniugazione alla QD, può verificarsi l'aggregazione proteica. Il problema principale con gli aggregati è che si accumulano sopra le celle e causano artefatti nella fase di segmentazione dell'immagine. Gli aggregati non saranno in grado di entrare nelle cellule e le nanoparticelle nel loro insieme non assomiglieranno più a una particella virale (Figura 3). Gli aggregati possono essere individuati nella soluzione QD come precipitati luminosi e raggruppati.
Questo test può anche essere utilizzato per valutare i biologici, come gli anticorpi neutralizzanti che bloccano l'ingresso virale. I QD sono stati incubati con anticorpi neutralizzanti (Figura 4A), a partire da 30 μg/mL, per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'aggiunta alle cellule. Sono stati utilizzati anticorpi sollevati contro il ceppo di riferimento di Washington, SARS-CoV-2 RBD. Hanno bloccato il legame, l'internalizzazione e hanno causato una riduzione del numero di spot misurati rispetto alle cellule trattate con solo QD (Figura 4B).
Figura 1: Analisi di immagini ad alto contenuto e segmentazione di cellule ACE2-GFP trattate con QD608-Spike. Immagini rappresentative di segmentazione accurata. In primo luogo, i nuclei vengono segmentati dal canale contenente il marcatore nucleare per creare una popolazione ROI. Dalla popolazione ROI, una regione ROI che delinea la cella viene segmentata utilizzando il canale ACE2-GFP. Infine, gli spot QD608-Spike sono segmentati dalla regione del ROI delle celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: QD608-Spike lega hACE2 ed è endocitoso in cellule hACE2-GFP HEK293T. (A) Montaggio di immagini di cellule HACE2-GFP (giallo) HEK293T trattate con diverse concentrazioni di QD608-Spike (magenta) o solo media. Il contrasto di fase digitale (ciano) è stato utilizzato per visualizzare il corpo cellulare. Barra di scala: 20 μm. (B) Analisi ad alto contenuto dei conteggi spot QD608-Spike normalizzati a 20 nM QD608-Spike (100%) e controllo (0%). N = pozzi triplicati. Le barre di errore indicano la deviazione standard (S.D.). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: QD608-Spike aggregato non è internalizzato nelle celle hACE2-GFP HEK293T. Montaggio di immagini di cellule hACE2-GFP HEK293T trattate con 10 nM QD608-Spike o solo media. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'anticorpo neutralizzante blocca l'endocitosi di QD608-Spike nelle cellule hACE2-GFP HEK293T. (A) Montaggio dell'immagine di cellule hACE2-GFP (gialle) HEK293T trattate con QD608-Spike (magenta) preincubate con concentrazioni decrescenti di anticorpi neutralizzanti, utilizzando il contrasto di fase digitale (ciano) per identificare i corpi cellulari. Barra di scala: 20 μm. (B) Analisi ad alto contenuto dei conteggi spot QD608-Spike normalizzati al controllo solo multimediale (100%) e solo QD608-Spike 10 nM (0%). N = pozzi triplicati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo descritto in questo articolo fornisce i passaggi necessari per l'imaging di QD funzionalizzati in cellule umane utilizzando la microscopia confocale ad alto rendimento. Questo metodo è più adatto per le cellule in cui l'endocitosi è la principale via di ingresso virale piuttosto che l'attività di TMPRSS2 e fusione di membrana, in quanto consente lo studio dell'endocitosi SARS-CoV-2 Spike e hACE2. A causa della natura del modello QD e del C-terminal His-tag sul trimero Spike disponibile in commercio, qualsiasi scissione TMPRSS2 dei domini Spike S1 e S2 lascerebbe il QD attaccato solo al dominio S212. Ciò potrebbe impedire l'internalizzazione, dato che l'RBD si trova in S1. Pertanto, se la sequenza di eventi sulla superficie cellulare fosse precisa, dove hACE2 è legato e quindi TMPRSS2 fende Spike, ci si aspetta un segnale negativo senza internalizzazione.
Poiché questo protocollo si occupa di imaging dei processi cellulari, le cellule coltivate devono essere permissive all'infezione virale con l'espressione di hACE2. hACE2 può essere trasfettato transitoriamente in cellule o può essere generata una linea cellulare stabile che esprime hACE217. Si raccomanda di verificare l'espressione e la localizzazione di hACE2 utilizzando l'immunofluorescenza con anticorpi contro hACE2 a meno che l'hACE2 non abbia un tag proteico fluorescente come GFP che può essere osservato al microscopio. HACE2 con tag GFP conferisce l'ulteriore vantaggio di visualizzare il traffico di hACE2 dopo l'endocitosi QD-Spike. Possono essere utilizzate alcune linee cellulari con espressione endogena di hACE2, ma questo deve essere confermato utilizzando l'immunocitochimica. In alcuni casi, l'espressione endogena non fornisce abbastanza partner di legame hACE2 per QD-Spike e può provocare un segnale che viene scarsamente rilevato dalla microscopia confocale ad alto rendimento.
Un passo fondamentale nel protocollo include l'approvvigionamento di QD di alta qualità coniugati al ricombinante SARS-CoV-2 Spike. Il prerequisito per questo è una proteina adeguatamente purificata che può essere coniugata ai QD senza causare aggregazione. I QD aggregati avranno diversi problemi che impediscono un esperimento di successo. Pertanto, il test di QD-Spike utilizzando strumenti di analisi (ad esempio, spettroscopia UV-visibile, microscopia elettronica a trasmissione o diffusione dinamica della luce) prima della sperimentazione completa è altamente raccomandato per preservare risorse preziose se si testano preziosi reagenti16. Durante l'etichettatura dei QD con spike, concentrazioni specifiche di QD e Spike vengono miscelate per ottenere un rapporto specifico di molecole. Solo QD e Spike sono miscelati ed entrambe le soluzioni sono altamente purificate. Per valutare l'etichettatura dei QD, un gel di acrilammide può essere fuso e caricato con QD da solo e coniugato QD a Spike, il che si traduce in bande di peso molecolare più pesanti.
I QD utilizzati in questo protocollo hanno uno spettro di eccitazione/emissione a fluorescenza sintonizzato sull'emissione di 608 nm dopo l'eccitazione UV (≤405 nm) poiché la maggior parte dei QD ha un elevato assorbimento vicino alla gamma UV che produce un'elevata fotoluminescenza18. Questa è una combinazione di eccitazione / emissione non convenzionale che richiede un microscopio per avere canali personalizzabili. Molti microscopi confocali tradizionali possono essere impostati con i filtri e le linee laser giusti per ottenere questa eccitazione / emissione. In alternativa, l'eccitazione del QD al primo massimo di assorbimento, a circa 10-20 nm di distanza dal picco di emissione (ad esempio, 592 nm per QD608 qui utilizzato), sarà anche in grado di produrre una fotoluminescenza sufficiente.
Il software basato su cloud utilizzato in questo protocollo di analisi ad alto contenuto utilizza uno schema di denominazione basato sui passaggi precedenti. Ad esempio, i primi oggetti segmentati sono nuclei, che creano una popolazione chiamata Nuclei. Successivamente, la cellula o il citoplasma può essere identificato come una regione ROI all'interno dei nuclei della popolazione. La terminologia utilizzata nel software di analisi delle immagini imposta il nome della popolazione di oggetti segmentati utilizzando il blocco di costruzione del nucleo come nuclei. Tuttavia, non devono necessariamente essere nuclei e possono essere corpi cellulari se non è disponibile alcun colorante nucleare. Questo schema di denominazione può anche essere modificato e personalizzato all'interno di ogni nome di output del blocco predefinito.
Il nostro protocollo non ha tenuto conto delle interazioni di membrana, ma questo potrebbe essere fatto aggiungendo una macchia di membrana aggiuntiva indipendente dal traffico ACE2-GFP. Per bloccare il legame non specifico, lo 0,1% di BSA è incluso nel mezzo di analisi (DMEM + 0,1% BSA) e le cellule vengono coltivate anche nel 10% di FBS. Le proteine spike mutanti potevano essere utilizzate, ma eravamo limitati alle proteine spike disponibili in commercio. In questo caso, una proteina Spike non legante l'ACE2 mutante SARS-CoV-2 non era disponibile.
Il metodo delle nanoparticelle QD presenta una potente tecnologia per studiare il legame e l'internalizzazione dei virus che si basano sull'ingresso mediato da Spike. Questo test può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento in modo analogo, come mostrato nella Figura 4, per riutilizzare e identificare potenti antivirali che bloccano l'ingresso cellulare. Mentre questo protocollo ha dimostrato solo l'uso di QD coniugati al ceppo di riferimento Washington WA-1 di SARS-CoV-2, questo test può essere facilmente adattato per studiare le proprietà di legame di nuove varianti emergenti come Alpha, Beta, Gamma e Delta attraverso l'uso delle rispettive proteine spike coniugate a QD.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Il Naval Research Laboratory ha fornito finanziamenti attraverso il suo Nanoscience Institute interno. La preparazione dei reagenti è stata supportata tramite il fondo base NRL COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
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