Summary
I detta protokoll, kvantprickar konjugerade till rekombinanta SARS-CoV-2 spike gör det möjligt cellbaserade analyser att övervaka spikbindning till hACE2 vid plasmamembranet och efterföljande endocytos av de bundna proteinerna i cytoplasman.
Abstract
Utvecklingen av ny teknik för cellulär fluorescensmikroskopi har underlättat screeningmetoder med hög genomströmning för läkemedelsupptäckt. Kvantprickar är fluorescerande nanopartiklar med utmärkta fotofysiska egenskaper genomsyrade av ljus och stabil fotoluminescens samt smala emissionsband. Kvantprickar är sfäriska i form, och med rätt modifiering av ytkemin kan användas för att konjugera biomolekyler för cellulära applikationer. Dessa optiska egenskaper, i kombination med förmågan att funktionalisera dem med biomolekyler, gör dem till ett utmärkt verktyg för att undersöka receptor-ligand interaktioner och cellulär handel. Här presenterar vi en metod som använder kvantprickar för att spåra bindning och endocytos av SARS-CoV-2 spike protein. Detta protokoll kan användas som en guide för experimentalister som vill använda kvantprickar för att studera protein-proteininteraktioner och trafficking i samband med cellulär fysiologi.
Introduction
Fluorescensmikroskopi gör det möjligt för forskare att kika in i cellens inre funktion med hjälp av specialiserade färgämnen1, genetiskt kodade fluorescerande proteiner2 och fluorescerande nanopartiklar i form av kvantprickar (QDs)3. För den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronaviruset 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi har forskare använt fluorescensmikroskopi för att förstå hur viruset interagerar med cellen både vid plasmamembranet och i cytoplasman. Till exempel har forskare kunnat få insikter om bindningen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virions yta till humant angiotensinkonverteringsenzym 2 (hACE2) på ytan av mänskliga celler, efterföljande internalisering via fusion vid plasmamembranet och endocytos av Spike:hACE2 proteinkomplex4,5. Stora insikter har också erhållits i SARS-CoV-2 utgående från celler via lysosomen med hjälp av cellulär fluorescensavbildning, en unik egenskap hos coronavirus som tidigare troddes inträffa via traditionell vesikel spirande från Golgi, som det är med många andra virus6. Den cellulära fluorescensmikroskopitekniken är en stöttepelare i nästan alla aspekter av biologisk forskning och har nödvändigtvis avancerat i sin bredd och omfattning av tillämpningar från superupplösningsavbildning av hela djur till automatiserad multiparmetrisk avbildning med högt innehåll för läkemedelsscreening. Här tillämpas automatiserad konfokal mikroskopi med högt innehåll på studien av SARS-CoV-2-cellinmatning med fluorescerande QDs konjugerade till virusspikproteinet.
Analys med högt innehåll av bilder som genereras av biologiska bildplattformar möjliggör större extraktion av värdefulla biologiska insikter än enskilda parametrar som hel brunnsintensitet, som man skulle få med hjälp av en multimodal plattläsare7. Genom att separera objekten i ett synfält med hjälp av automatiserade segmenteringsalgoritmer kan varje objekt eller en population av objekt analyseras för parametrar som intensitet, område och textur i varje tillgänglig fluorescenskanal8. Att kombinera många mätningar i multivariata data uppsättningar är en användbar metod för fenotypisk profilering. När den önskade fenotypen är känd, såsom QD internalisering i form av punkta, kan man använda mätningarna relaterade till punktera såsom storlek, antal och intensitet för att bedöma effekten av en behandling.
Molnbaserad programvara för bildanalys med högt innehåll kan rymma ett stort antal instrumentdatautgångar, inklusive plattformen för bildbehandling med högt innehåll. Genom att använda en molnbaserad server för bildlagring och onlineanalys kan användaren ladda upp sina data från antingen bildinstrumentet eller från nätverksenheten där data lagras. Analysdelen av protokollet utförs i moln program miljön och data kan exporteras i en mängd olika fil format för nedströms data visualisering.
SARS-CoV-2-viruset består av icke-strukturella och strukturella proteiner som hjälper till i dess sammansättning och replikering. SARS-CoV-2 spike har två domäner som kallas S1 och S2, där S1 innehåller den receptorbindande domänen som ansvarar för hACE2-interaktioner vid plasmamembranet9. Spike har också visat sig interagera med andra molekyler vid plasmamembranet som kan fungera som co-receptorer utöver hACE210,11. Genom hela spikproteinsekvensen och särskilt vid S1/S2-gränssnittet finns det proteasklyvningsplatser som möjliggör fusion vid membranet efter transmembran serinproteas 2 (TMPRSS2)12. Olika rekombinanta SARS-CoV-2 Spike proteiner har producerats från enskilda receptor bindande domäner, till S1, S2, S1 med S2, och hela spik trimers från flera kommersiella leverantörer för användning i forskningsverksamhet13.
I detta arbete, ytan av QDs funktionaliserades med rekombinanta spik trimers som innehåller en histidin tagg (QD-Spike). QDs som produceras av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section innehåller en kadmium selenidkärna och ett zinksulfidskal14,15. Zinken på QD-ytan koordinerar histidinresterna i det rekombinanta proteinet för att bilda en funktionaliserad QD som liknar en SARS-CoV-2 viruspartikel i form och funktion. Genereringen av nanopartiklar och proteinkonjugation beskrevs tidigare med hjälp av QD-konjugerade receptorbindningsdomänen15. Denna metod beskriver cellodlingspreparat, QD-behandling, bildförvärv och dataanalysprotokoll som kan vägleda en forskare i att studera SARS-CoV-2 Spike aktivitet i det fysiologiska sammanhanget för en mänsklig cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hek293T-cellinjen som används i denna studie är en odödlig cellinje. Inga försökspersoner på människa eller djur användes i denna studie.
1. Cellodling och sådd
- Inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, med personlig skyddsutrustning (inklusive labbhandskar, labbrock och skyddsglasögon), förbered cellodlingsmedium genom att komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovinserum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P /S) och 250 μg / mL G418.
- För 500 ml media, lägg till 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S och 1,25 ml G418.
- Filtrera genom en filterkolv på 0,2 μm och behåll steriliteten för att undvika bakteriell förorening.
- Inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, så de inre 60 brunnarna i en svart, klar botten, poly-D-lysin belagd 96-brunnsplatta med 20 000 celler i 100 μL per brunn av cellodlingsmedium. Fyll de yttre 36 brunnarna med 100 μL per brunn av fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- För att räkna cellerna, tillsätt 2 μL akridinorange och propidiumjodidfläck till 18 μL cellfjädring.
- Ladda 10 μL av denna lösning i ena sidan av en cellräkningsbild.
- Upprepa steg 1.2.1. och 1.2.2. för att ladda båda sidorna av bilden.
- Placera bilden i en automatiserad cellräknare.
- Välj fluorescensräkningsprotokollet och tryck på Räkna. Räkna båda sidorna av bilden och beräkna medelvärdet av de två håla.
- Om du vill beräkna volymen av cellavstängningen som krävs delar du det totala antalet celler som behövs med den genomsnittliga celltätheten.
- Inspektera brunnarna efter sådd under ett ljusmikroskop för att säkerställa att korrekt densitet och fördelning har uppnåtts.
- Inkubera plattan över natten i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
2. Behandling av celler med QD-Spike
- Förbered 0,1% bovint serumalbumin (BSA) genom utspädning i bildmedier.
- För 10 ml bildmedier, tillsätt 130 μL 7,5% BSA och blanda.
- I en 12-brunnsreservoar eller analysplatta späd ut 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) lager till 20 nM med 0,1% BSA i bildmedia.
- För 1 brunn QD-Spike, tillsätt 2,27 μL 440 nM QD-Spike till 47,73 μL av 0,1% BSA imaging media för en slutlig koncentration på 20 nM.
- För att generera en seriell utspädning med sex punkter 1:3 (i tre exemplar) tillsätt 14,26 μL QD-Spike till 285,74 μL av 0,1% BSA-bildmedier för att göra den högsta koncentrationen på 20 nM. Tillsätt 100 μL 20 nM QD-Spike till 200 μL 0,1% BSA-media för att göra den andra utspädningen på 6,67 nM QD-Spike. Upprepa fyra gånger för att generera de sex koncentrationspunkterna.
- Använd en flerkanalig aspirator och ta bort alla förbrukade media från varje brunn. Tvätta en gång med bildmedium (100 μL/brunn) med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Aspirera 100 μL bildmedium och lägg tillbaka 50 μL/brunn av QD-Spike-lösningen.
- Inkubera plattan i 3 h i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2. Fortsätt till steg 4.
3. Fixering och kärnor färgning
- Inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, med personlig skyddsutrustning (inklusive labbhandskar, labbrock och skyddsglasögon), förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1% BSA-bildmedier.
- Aspirera 50 μL QD-Spike från varje brunn och tillsätt 100 μL/brunn på 4% PFA.
- Låt inte brunnarna torka ut. Använd en automatiserad flerkanalig pipett för att undvika torkning av brunnarna (rekommenderas).
- Inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Förbered det djupröda kärnämnet genom att späda ut 5 mM-stamlösningen till 1:1000 utspädning i PBS.
- Aspirera ut PBS och tillsätt tillbaka 50 μL/brunn av utspädd kärnfärg.
- Inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Avbilda plattan eller tätningen med en plattförsegling för avbildning vid ett senare tillfälle. Förvara plattan vid 4 °C. Fluorescens bör vara stabil i flera veckor eller mer.
4. Förvärvsuppsättning och avbildning
- Starta programvaran för bildplattformen. Slå på bildplattformen med högt innehåll och lampan på statusfältet ska vara tänd. Om datorn inte är ansluten kommer programvaran att gå in i offlineanalysläge.
- Logga in på bildplattformen.
- Skapa ett nytt förvärvsprotokoll.
- Välj Plåttyp som 96-väl klar bottenbildplatta.
OBS: Plåtvalet i instrumentet kan variera och kan anpassas genom att ladda rätt plattdefinitioner som inkluderar plåtdimensioner som höjd, bredd och andra avstånd för att definiera brunnsavstånd och kontaktpunkter. - Välj Optiskt läge som konfokalt läge och förstoring som 40x vattensänkning.
- Välj Binning som 1.
- Välj kanaler och fluorescerande excitation/emissionsvåglängder enligt beskrivningen i steg 4.3.5-4.3.8. Ta en ögonblicksbild när inställningarna är markerade för att visa bilden och se till att inställningarna är lämpliga.
OBS: Digital Faskontrast (DPC) möjliggör visualisering av levande celler utan cellfläck eller fluorescerande färgämne. Det rekommenderas inte för fasta celler. - Välj läget för DPC, till exempel Högkontrast om du vill skapa väldefinierade cellkroppar. Ta en ögonblicksbild för att bekräfta att den här inställningen är lämplig, som visas i bildfönstret.
- Välj FITC-kanalen för användning med ACE2-GFP-cellinjen som möjliggör visualisering av ACE2-handel i cellen.
- Om du vill skapa en anpassad kanal för QD-kanalen väljer du den rullgardinsmenyn för kanalen och väljer excitation i 405 nm-området och utsläpp i 608 nm-området.
- Om celler fixerades och ett djupt rött kärnämne användes, välj den långt röda kanalen med utsläpp större än 630 nm för att ytterligare avgränsa cellkroppen och fungera som en cellmask.
- Välj en brunn med en stark cytoplasmisk QD-signal för att ställa in exponeringstiden, lasereffekten och Z-höjdpositionen. Följ stegen från 4.3.10-4.3.13.
- Kontrollera om standardhöjden ger en bild där cellerna finns i önskat fokalplan. Om den endocytosed puncta är målorganellet, kommer Z-positionen att vara lägre än om plasmamembranet är målorganellet.
- Välj en exponeringstid som ger en ljus bild med grå nivåer som är minst trefaldiga större än bakgrundssignalen. Detta är vanligtvis mellan 100 och 300 ms. Vid 20 nM bör de grå nivåerna vara cirka 6000 a.u. med en exponeringstid på 200 ms och lasereffekt på 80%.
- Kontrollera grå nivåer genom att högerklicka på bilden som produceras med funktionen Ögonblicksbild i varje kanal och välja Visa intensitet. Klicka sedan vänster på objektet av intresse eller bakgrund för att visa den grå nivån för den pixeln.
- Justera lasereffekten för att finjustera intensiteten hos de objekt som är av intresse.
- Välj Plåttyp som 96-väl klar bottenbildplatta.
- Spara anskaffningsprotokollet.
- Växla till Kör experiment och ange plåtnamnet.
- Kör experimentet.
5. Dataanalys
- Importera data till bildprogrammet.
- När du har skaffat alla bilder exporterar du mätningar till bildprogrammet. Detta kräver att en server upprättas och att ett konto skapas. Skapa en skärm för de data som ska exporteras till bildbehandlingsprogrammet.
- I bildbehandlingsprogramvaran väljer du Bildanalys för att börja bygga analysprotokollet.
- Läs in mätningarna från bildexperimentet genom att högerklicka på filen i skärmlistan och klicka på Välj. Plåtkartan över avbildade brunnar och tillhörande fält ska vara synlig längst ner till vänster i fönstret.
- Välj en brunn med ljusa cytoplasmiska QD-fläckar för att påbörja bildsegmentering.
- Välj Flatfield-korrigering i byggblocket för indatabilder.
- Lägg till nästa byggsten i protokollet genom att välja Hitta kärnor.
- Här använder du DPC eller långröd kanal som Nuclei-markör.
- Markera den metod som segmenterar objekten noggrant först och finjustera sedan segmenteringen med den nedrullningsbara menyn och justera skjutreglagen.
OBS: Bra segmentering definierar noggrant intresseområdet (ROI) för kärnan, cellen och fläckarna. Endast pixlarna som är positiva för markören ska fångas in i en enskild ROI. Bakgrundssignal bör uteslutas. Om bakgrunden fångas in i ROI kan metodens känslighet minskas eller tröskelvärdet för intensitet ökas för att öka segmenteringsalgoritmens stringens. Detta gäller för alla find byggstenar.
- Lägg sedan till Find Cytoplasm Building Block för att identifiera cytoplasma.
- I det här fallet, använd ACE2-GFP-kanalen för cytoplasmisk segmentering.
- Välj den metod som bäst identifierar cytoplasmans för varje cell.
- Lägg sedan till byggblocket Hitta fläckar för att identifiera QD-Spike-punktan.
- Välj Nuclei som ROI-population.
- Markera cellen som ROI-region. Detta fångar punktan i hela cellen.
- Välj den metod som bäst identifierar QD-punktan i varje cell.
- När alla objekt i bilden har segmenterats och identifierats korrekt i denna brunn, välj andra brunnar för att säkerställa att byggstenarna och inställningarna i allmänhet kan tillämpas på andra brunnar och andra förhållanden.
- Lägg till beräkningsintensitetsegenskaperna för alla segmenterade objekt (kärnor, cytoplasma/celler och fläckar).
- Lägg till beräkningsmorfologiegenskaperna för alla segmenterade objekt (kärnor, cytoplasma/celler och fläckar).
- Lägg till calculate texture properties för alla segmenterade objekt (atomkärnor, cytoplasma/celler och fläckar).
- Definiera resultat genom att välja parametrar för varje population, inklusive kärnor och fläckar. Antalet objekt kan användas som ett indirekt mått på cellens livskraft.
6. Exportera data
- Klicka på Batchanalys. Vänta tills analysen är klar innan du går vidare till nästa steg (steg 6.2).
Batchanalysen gör det möjligt för bildanalysprogramvaran att läsa in analysprotokollet med hjälp av de valda mätningarna för att analysera data på distans. - Exportera datauppsättningen till en lokal dator eller nätverksenhet.
- Anslut bildanalysprogramvaran till ett hjälpprogram på datorn genom att hämta och öppna en anslutningsfil.
- Välj resultatfiltypen (.txt, .csv, .html eller Inbyggd XML).
- Välj inställningarna för mappen med den nedrullningsbar menyn.
7. Analysera data i ett kalkylblad
- Öppna den exporterade filen. Om det är en .csv fil sparar du den som ett .xls filformat för att aktivera användning av pivottabeller. Om filsökvägen är för lång sparar du den .xls filen högre upp i mapphierarkin för att undvika fel i sparandet.
- Lägg till kolumner i kalkylbladet som anger villkoren för varje brunn. Till exempel celltyp, QD-Spike-varianter, QD-Spike-koncentrationer, inkubationstid etc.
- Välj pivottabellfunktionen och skapa tabellen med de tillagda villkoren som rader och de uppmätta parametrarna som kolumner. Välj beräkningen för varje parameter, dvs. genomsnitt, standardavvikelse, median, min, max eller antal.
- Normalisera data för att styra prover, inklusive okonjugerade QDs som 0% och den högsta koncentrationen av QD-Spike som 100%.
OBS: Vid bedömning av effekten av inhibitorer såsom neutraliserande antikroppar, normalisera data till medier-endast behandlade celler (100% effekt) och QD-Spike utan hämmare (0% effekt). - Rita data i grafprogramvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid behandling kommer QDs att internaliseras eftersom nanopartikeln binder till ACE2 på plasmamembranet och inducerar endocytos. Med hjälp av en ACE2-GFP-uttryckscell kan flyttning av både QDs och ACE2 visualiseras med fluorescensmikroskopi. När de två QD- och ACE2-signalerna har internaliserats visar de en stark colocalisering. Från dessa bilder kan bildsegmentering och efterföljande analys utföras för att extrahera relevanta parametrar som dekorantal (figur 1, figur 2B). Figur 1A är ett montage av celler som behandlas med olika koncentrationer av QD-Spike eller media endast som en kontroll. Tre kanaler användes, inklusive digital faskontrast, FITC och den anpassade QD-kanalen med excitation vid 405 nm och utsläpp vid 608 nm. DPC ger en bild av den allmänna cellformen. DPC-bilden ger en ungefärlig indikation på hela cellmorfologin. Intresseområdet överlappar DPC-signalen och är tillräckligt för att identifiera internaliserade QDs. FITC-kanalen visar ACE2-GFP ändra lokalisering och ackumuleras i regioner som colocalize med QD-Spike. När koncentrationen av QD-Spike minskar är QDs inte längre synliga och ACE2-GFP-signalen liknar kontroll. Sammanslagningskanalen demonstrerar colocalization av ACE2-GFP med QD-Spike. Dessa objekt är en blandning av fläckar och större ackumuleringar som kan segmenteras med analysprogramvaran. Finjustering av den programvaruanalysmetod som används för bildsegmentering kan användas för att segmentera objekt av intresse.
Här utfördes ett koncentrations-responsexperiment med sex olika koncentrationer av QD-Spike, med början vid 20 nM, för att bestämma optimala koncentrationer av QD (figur 2A). QDs kan användas så lågt som 2,22 nM och visar fortfarande bindning och internalisering. Det rekommenderas dock att använda koncentrationer på 20 nM eller högre för att säkerställa ett robust svar.
Under konjugation till QD kan proteinaggregering förekomma. Det största problemet med aggregat är att de ackumuleras ovanpå celler och orsakar artefakter i bildsegmenteringssteget. Aggregat kommer inte att kunna komma in i celler, och nanopartiklarna som helhet kommer inte längre att likna en viruspartikel (figur 3). Aggregat kan ses i QD-lösningen som ljusa, klumpade fällningar.
Denna analys kan också användas för att bedöma biologiska läkemedel, såsom neutraliserande antikroppar som blockerar virusinträde. QDs inkuberades med neutraliserande antikroppar (figur 4A), från 30 μg/ml, i 30 minuter vid rumstemperatur före tillsats av celler. Antikroppar som uppkom mot den refererande Washington-stammen, SARS-CoV-2 RBD, användes. De blockerade bindning, internalisering och orsakade en minskning av det uppmätta antalet döda jämfört med celler som behandlats med endast QD (figur 4B).
Bild 1: Bildanalys med högt innehåll och segmentering av ACE2-GFP-celler som behandlats med QD608-Spike. Representativa bilder av korrekt segmentering. För det första är atomkärnor segmenterade från kanalen som innehåller kärnmarkören för att skapa en ROI-population. Från ROI-populationen segmenteras en ROI-region som beskriver cellen med hjälp av ACE2-GFP-kanalen. Slutligen segmenteras QD608-Spike-fläckar från regionen Cell ROI. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: QD608-Spike binder hACE2 och är endocytosed i hACE2-GFP HEK293T celler. (A) Bildmontage av hACE2-GFP (gul) HEK293T celler behandlas med flera koncentrationer av QD608-Spike (magenta) eller endast media. Digital faskontrast (cyan) användes för att visualisera cellkroppen. Skalstreck: 20 μm. (B) Analys av hög innehållsanalys av QD608-Spike Spot Counts normaliseras till 20 nM QD608-Spike (100%) och kontrollen (0%). N = tredubbla brunnar. Felstaplar anger standardavvikelse (S.D.). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Aggregerad QD608-Spike internaliseras inte till hACE2-GFP HEK293T-celler. Bildmontage av hACE2-GFP HEK293T celler behandlas med 10 nM QD608-Spike eller endast media.Image montage of hACE2-GFP HEK293T celler behandlas med 10 nM QD608-Spike eller endast media.Image montage of hACE2-GFP HEK293T cells behandlade med 10 nM QD608-Spike eller endast media-only. Skalningsfält: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Neutraliserande antikropp blockerar endocytos av QD608-Spike i hACE2-GFP HEK293T-celler. (A) Bildmontage av hACE2-GFP (gul) HEK293T-celler behandlade med QD608-Spike (magenta) preincubated med minskande koncentrationer av neutraliserande antikroppar, med hjälp av digital faskontrast (cyan) för att identifiera cellkroppar. Skalningsstapel: 20 μm. (B) Analys med högt innehåll av QD608-Spike Spot Counts normaliseras till endast mediekontroll (100%) och 10 nM QD608-Spike (0%). N = tredubbla brunnar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs i den här artikeln ger de nödvändiga stegen för avbildning funktionella QDs i mänskliga celler med hjälp av hög-genomströmning confocal mikroskopi. Denna metod är bäst lämpad för celler där endocytos är huvudvägen för viral inmatning snarare än aktiviteten hos TMPRSS2 och membranfusion, eftersom det möjliggör studier av SARS-CoV-2 Spike och hACE2 endocytos. På grund av QD-modellens natur och C-terminalen His-tag på den kommersiellt tillgängliga Spike-trimern skulle alla TMPRSS2-klyvning av Spike S1- och S2-domäner lämna QD kopplad till S2-domänen endast12. Detta kan förhindra internalisering, med tanke på att RBD finns i S1. Därför, om sekvensen av händelser på cellytan var exakt, där hACE2 är bunden och sedan TMPRSS2 klyver Spike, förväntas en negativ signal utan internalisering.
Eftersom detta protokoll behandlar avbildning cellulära processer, de odlade cellerna måste tillåta viral infektion med uttrycket av hACE2. hACE2 kan övergående överföras till celler, eller en stabil cellinje som uttrycker hACE2 kan genereras17. Det rekommenderas att verifiera hACE2 uttryck och lokalisering med immunofluorescens med antikroppar mot hACE2 om inte hACE2 har en fluorescerande protein tagg såsom GFP som kan observeras med mikroskopi. GFP-taggade hACE2 ger den extra fördelen med att visualisera hACE2 handel efter QD-Spike endocytosis. Vissa cellinjer med endogent hACE2 uttryck kan användas, men detta bör bekräftas med immunocytochemistry. I vissa fall ger det endogena uttrycket inte tillräckligt med hACE2-bindningspartners för QD-Spike och kan resultera i en signal som är dåligt detekterad av konfokal mikroskopi med hög genomströmning.
Ett viktigt steg i protokollet inkluderar upphandling av högkvalitativa QDs som är konjugerade till den rekombinanta His-taggade SARS-CoV-2 Spike. Förutsättningen för detta är ett korrekt renat protein som kan konjugeras till QDs utan att orsaka aggregering. Aggregerade QDs kommer att ha flera problem som förhindrar ett framgångsrikt experiment. Därför rekommenderas testning av QD-Spike med hjälp av analysverktyg (t.ex. UV-synlig spektroskopi, transmissionselektronmikroskopi eller dynamisk ljusspridning) före fullständig experimentering för att bevara värdefulla resurser om du testar värdefulla reagenser16. Under märkningen av QDs med spik blandas specifika koncentrationer av QD och Spike för att uppnå ett specifikt förhållande mellan molekyler. Endast QD och Spike blandas, och båda lösningarna är mycket renade. För att bedöma märkningen av QDs kan en akrylamidgel gjutas och laddas med QD ensam samt QD-konjugerad till Spike, vilket resulterar i tyngre molekylviktsband.
De QDs som används i detta protokoll har en fluorescens excitation / emissionsspektrum justerat till 608 nm utsläpp efter UV-excitation (≤405 nm) eftersom de flesta QDs har hög absorption nära UV-området som producerar hög fotoluminescens18. Detta är en okonventionell excitation/ emissionskombination som kräver ett mikroskop för att ha anpassningsbara kanaler. Många traditionella konfokala mikroskop kan ställas in med rätt filter och laserlinjer för att uppnå denna excitation/emission. Alternativt kommer excitation av QD vid den första absorptions maximum, cirka 10 till 20 nm från utsläppstoppen (t.ex. 592 nm för QD608 som används här), också att kunna producera tillräcklig fotoluminescens.
Den molnbaserade programvaran som används i det här analysprotokollet med högt innehåll använder ett namnschema som bygger på tidigare steg. De första objekten som är segmenterade är till exempel kärnor, som skapar en population som kallas Kärnor. Därefter kan cellen eller cytoplasma identifieras som en ROI-region inom populationen Nuclei. Terminologin som används i bildanalysprogramvaran anger namnet på populationen av objekt segmenterade med hjälp av kärnbyggnadsblocket som Nuclei. De behöver dock inte nödvändigtvis vara kärnor och kan vara cellkroppar om det inte finns något kärnämne. Det här namnschemat kan också ändras och anpassas inom varje utdatanamn för byggsten.
Vårt protokoll tog inte hänsyn till membraninteraktioner, men detta kunde göras genom att lägga till en ytterligare membran fläck som är oberoende av ACE2-GFP trafficking. För att blockera ospecificerad bindning ingår 0,1% BSA i analysmediet (DMEM + 0,1% BSA), och cellerna odlas också i 10% FBS. Mutanta spikproteiner kunde användas, men vi var begränsade till kommersiellt tillgängliga spikproteiner. I detta fall var en SARS-CoV-2 mutant icke-ACE2 bindande Spike protein inte tillgänglig.
QD-nanopartikelmetoden presenterar en kraftfull teknik för att studera bindning och internalisering av virus som förlitar sig på Spike-medierad post. Denna analys kan användas för screening med hög genomströmning på ett liknande sätt, som visas i figur 4, för att återanvända och identifiera potenta antivirala medel som blockerar cellulär inmatning. Medan detta protokoll endast visade användningen av QDs konjugerade till Washington WA-1 referens stam av SARS-CoV-2, denna analys kan enkelt anpassas för att studera bindande egenskaper hos nyligen framväxande varianter såsom Alpha, Beta, Gamma, och Delta genom användning av deras respektive spik proteiner konjugerade till QDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av Intramural Research Program vid National Center for Advanceing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory tillhandahöll finansiering via sitt interna nanovetenskapliga institut. Reagensberedningen stöddes via BASFONDEN NRL COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
