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Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63252
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

A enterocolite necrosante (NEC) é a doença gastrointestinal (GI) mais grave que ocorre frequentemente em bebês prematuros, especialmente bebês com baixo peso ao nascer, com alta mortalidade e patogênese pouco clara. A causa da NEC pode estar relacionada a anormalidades inflamatórias do sistema de regulação imunológica. Um modelo animal NEC é uma ferramenta indispensável para a pesquisa imunológica da doença NEC. Modelos animais NEC geralmente usam camundongos neonatais C57BL/6J; Os camundongos neonatais BALB/c raramente são usados. Estudos relacionados mostraram que quando os camundongos são infectados, a diferenciação celular Th2 é predominante em camundongos BALB/c em comparação com camundongos C57BL/6J. Estudos sugerem que a ocorrência e o desenvolvimento da NEC estão associados a um aumento nas células auxiliares T tipo 2 (Th2) e são geralmente acompanhados de infecção. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c neonatais para induzir um modelo NEC com características clínicas semelhantes e alterações patológicas intestinais observadas em crianças com NEC. Um estudo mais aprofundado é necessário para determinar se esse modelo animal poderia ser usado para estudar respostas de células Th2 na NEC.

Abstract

A enterocolite necrosante (NEC) é a doença gastrointestinal (GI) mais grave que ocorre frequentemente em bebês prematuros, especialmente bebês com baixo peso ao nascer, com alta mortalidade e patogênese pouco clara. A causa da NEC pode estar relacionada a anormalidades inflamatórias do sistema de regulação imunológica. Um modelo animal NEC é uma ferramenta indispensável para a pesquisa imunológica da doença NEC. Modelos animais NEC geralmente usam camundongos neonatais C57BL/6J; Os camundongos neonatais BALB/c raramente são usados. Estudos relacionados mostraram que quando os camundongos são infectados, a diferenciação celular Th2 é predominante em camundongos BALB/c em comparação com camundongos C57BL/6J. Estudos sugerem que a ocorrência e o desenvolvimento da NEC estão associados a um aumento nas células auxiliares T tipo 2 (Th2) e são geralmente acompanhados de infecção. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c neonatais para induzir um modelo NEC com características clínicas semelhantes e alterações patológicas intestinais observadas em crianças com NEC. Um estudo mais aprofundado é necessário para determinar se esse modelo animal poderia ser usado para estudar respostas de células Th2 na NEC.

Introduction

A enterocolite necrosante (NEC), a doença gastrointestinal mais grave (GI), ocorre na maioria dos bebês prematuros (>90%), especialmente aqueles com baixo peso ao nascer (VLBW)1. Em bebês VLBW, a incidência da doença varia de 10% a 12%, e a mortalidade de crianças diagnosticadas com NEC é entre 20% e 30%2,3. A causa da NEC pode estar relacionada a lesões mucosas, invasão por bactérias patogênicas e alimentação intestinal, o que pode levar a respostas inflamatórias e à indução de lesões intestinais em hospedeiros suscetíveis3. A patogênese da NEC não está clara. Pesquisas relevantes mostram que a resposta imune do bebê afetado é anormal, e a suscetibilidade genética, tensão microvascular e alterações bacterianas intestinais podem desempenhar papéis importantes na doença3.

O modelo animal nec é uma ferramenta indispensável para a pesquisa sobre a patogênese da NEC. As espécies animais utilizadas para modelos NEC são porcos, ratos e camundongos. No entanto, devido ao longo período de gestação, ciclos de crescimento e altos custos, nos últimos anos, os suínos não têm sido a primeira escolha para os modelos nec e foram substituídos por ratos ou ratos4. Como há diferenças no fundo imunológico de diferentes cepas de camundongos5, diferentes estudos precisam usar diferentes cepas de camundongos para estabelecer modelos animais NEC. Os ratos BALB/c têm uma característica importante; quando estão infectados ou lidam com danos externos, a polarização das células TH2 durante a infecção em camundongos é significativamente mais forte do que em outras cepas de camundongos6,7,8. As células auxiliares T desempenham um papel crucial na ocorrência e progressão da NEC, especialmente no desenvolvimento de células TH23,9,10,11. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c para estabelecer o modelo NEC, o que pode ser útil para a pesquisa da doença nec em células T.

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Protocol

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Centro Médico da Mulher e da Criança de Guangzhou (Nº 174A01) e pelo Comitê de Ética Animal do Centro animal do Laboratório de Biociências de Guangzhou Forevergen (IACUC-G160100). Todos os animais foram criados na mesma sala em um ambiente específico livre de patógenos (SPF), e experimentos foram realizados em ambiente convencional. Os camundongos utilizados para reprodução tinham de 7 a 8 semanas; os camundongos para induzir NEC (n = 72) foram separados da barragem no dia 4, e as barragens(n=14) foram mantidas na gaiola original e amamentaram os ratos do grupo controle (Cont.) (n=24).

1. Preparação de reagentes e dispositivos

  1. Prepare o substituto do leite para os camundongos BALB/c na proporção correspondente (leite em pó prematuro: leite em pó de cabra = 2:1).
    NOTA: As composições nutricionais finais do leite de fórmula12 são mostradas na Tabela 1.
  2. Solução LPS (2,5 mg/mL)
    1. Dissolva um total de 10 mg de pó LPS em 4 mL de água esterilizada dupla destilada, misture bem e armazene em uma geladeira a -20 °C após a aliquotação.
      NOTA: A solução LPS é armazenada no escuro a 2-8 °C para uso imediato ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo.

2. Induzir enterocolite necrosante em camundongos BALB/c neonatais

  1. Alimente os ratos neonatais.
    1. Mantenha os camundongos neonatais na mesma gaiola com a represa, amamentados pela represa nos dias 0-4.
    2. Na noite do dia 4 (quando os camundongos neonatais pesam 2,5-3 g), separe os camundongos neonatais do grupo NEC da barragem para induzir nec, mantê-los em uma incubadora animal e alimentá-los com fórmula. No entanto, o grupo Cont. está autorizado a ficar e ser alimentado pela represa.
      NOTA: Os camundongos neonatais separados da barragem devem ser criados em uma incubadora devido à sua fraca regulação da temperatura corporal.
  2. Prepare o tubo de gavage, encharcando-o em recipientes de álcool de 75% por 1-2 min e lave-os duas vezes em água limpa e dupla destilada.
    NOTA: Para evitar a contaminação cruzada entre os camundongos, o processo acima deve ser realizado após a alimentação de cada rato.
  3. Induzir o modelo NEC.
    1. Pegue os ratos neonatais da represa no dia 4 e acelere-os por uma noite.
    2. Gavage os ratos com LPS (20-30 μL de cada vez) e alimente-os com fórmula no dia 5 (40-50 μL de cada vez).
    3. A partir do dia 5, submia os camundongos a um ciclo de choque frio-de hipoxia-reoxigenação duas vezes por dia durante 5 dias. Coloque os camundongos em um dispositivo de hipóxia a 5% de O2 para 90 s e reoxigená-los por 3 min; repetir este processo cinco vezes. Em seguida, coloque os ratos em um ambiente de 4 °C por 15 minutos e depois transfira-os para uma incubadora. Consulte a Figura 1A,B para o processo de indução.
      NOTA: Um ciclo de estimulação hipóxia-reoxigenação-fria foi realizado uma vez pela manhã e uma vez à tarde. Uma mistura de 5% de O2 com 95% N2 foi preparada no recipiente, e a concentração foi medida com detector de oxigênio.
  4. Observe minuciosamente todos os camundongos, pese-os todos os dias, registe os camundongos durante o período de indução e registe as características das fezes (com ou sem fezes pegajosas/fezes ensanguentadas).
    NOTA: O modelo NEC estabelecido dura 5 dias.
  5. No dia 10 ou mais cedo, quando os camundongos apresentam sintomas nec (íleo, hematochezia, diarreia)13, eutanize os camundongos por anestesia de inalação com isoflurano, depois colete imediatamente o tecido intestinal. Não recolha tecidos dos camundongos que morreram espontaneamente.
    NOTA: Neste estudo, o ponto final da euenasia do rato foi adaptado quando o mouse exibiu hematochezia e cianose de todo o corpo.

3. Gavage o mouse

  1. Conserte a cabeça do rato, segurando a sonda gástrica na mão direita. Insira a sonda gástrica do canto esquerdo da boca do mouse.
    NOTA: A cabeça foi fixada com o dedo indicador na cabeça do mouse e gentilmente pressionada para trás e para baixo para evitar que o rato se dobrasse para frente durante a operação e afetasse a inserção da sonda gástrica.
  2. Mova lentamente o tubo para o centro da boca. Depois de inserir o tubo aproximadamente 2-3 cm, empurre 40-50 μL de fórmula ou 20-30 μL de LPS no trato digestivo. Veja a Figura 2A,B para o gavage.
    NOTA: Em circunstâncias normais, a sonda gástrica é inserida suavemente no trato digestivo. Se o camundongo tem um forte reflexo de vômito, a sonda gástrica foi inserida na traqueia por engano. A sonda gástrica deve ser retirada suavemente e o rato pode descansar por um tempo antes de tentar gavage novamente. Além disso, o procedimento de gavage é usado para induzir o modelo de NEC antes da eutanásia de camundongos.

4. Coletar amostras de tecido intestinal fresco para coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

  1. Mergulhe o tecido íleo fresco do mouse em 10% de formalina por 24 h.
  2. Incorpore os tecidos em parafina e corte-os em seções de 4 μm.
  3. Desparafinar as seções em xileno e reidratá-las sucessivamente em etanol absoluto, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol e água destilada, de molho por 5 minutos em cada etapa. Manche as seções com solução de hematoxilina por 5 min e diferencie-as em 1% de ácido clorídrico em 75% de álcool para 5 s. Finalmente, manche-os com solução de eosina por 1 min.
    NOTA: Após a coloração com solução de hematoxilina, deve ser diferenciado com ácido clorídrico de 1% no etanol para remover solução de hematoxilina excessivamente ligada e corante de hematoxíquia citoplasmica. A concentração de 1% de ácido clorídrico é adequada para tecido intestinal.
  4. Examine a histopatologia do tecido intestinal a 40x de ampliação.

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Representative Results

O modelo NEC do rato BALB/c foi induzido pela alimentação de fórmulas, alimentação de LPS, hipóxia e estimulação fria. Durante o período de indução, os camundongos foram observados para patologia intestinal, características das fezes, alterações de peso corporal e sobrevida diária. Imagens representativas do intestino delgado durante a indução da NEC; os números no quadro representam o escore da patologia intestinal de 0 (epitélio normal) a 4 (o mais grave) (Figura 3A). O escore de patologia intestinal foi significativamente maior no grupo NEC do que no grupo Cont. (Figura 3B). Os números na imagem representam pontuações de 0 (pelotas bem formadas) a 3 (bancos líquidos) (Figura 3C). No dia 10, os escores das fezes dos grupos nec foram significativamente maiores no grupo NEC, indicando que a disfunção intestinal no grupo NEC foi mais grave (Figura 3D). No dia 5, primeiro dia de indução do modelo NEC, não houve diferença significativa no tamanho do corpo entre os dois grupos. No entanto, no dia 10, os camundongos do grupo NEC eram significativamente mais finos e menores da cabeça à cauda do que os ratos do grupo Cont. (Figura 4A).

Durante os 5 dias durante os quais o modelo foi estabelecido, o peso dos camundongos no grupo NEC aumentou lentamente ou mesmo apresentou crescimento negativo, e a taxa de sobrevivência dos camundongos no grupo NEC diminuiu gradualmente em comparação com o grupo Cont. (Figura 4B,C). Além disso, outro lote de camundongos foi usado para induzir o modelo NEC, mas sem coletar os tecidos; até o dia 13, todos os camundongos deste grupo NEC tinham morrido, e a curva de sobrevivência foi significativamente reduzida (Figura Suplementar S1). A Figura 5A mostra a morfologia e os resultados patológicos (necrose do tecido mucosa intestinal) da área ileocecal ressecizada do tecido intestinal de pacientes com NEC neste hospital. Neste estudo, os camundongos do grupo NEC (1/13) desenvolveram hemorragia ileocecal e necrose (Figura 5B).

Figure 1
Figura 1: Indução do processo do modelo BALB/c NEC. (A) Os camundongos do grupo NEC foram separados da barragem ao nascer até os 4 dias de idade (no dia 4) e jejuaram naquela noite. O modelo NEC foi induzido a partir do dia 5 após o nascimento e durou 5 dias. Amostras de tecido intestinal foram coletadas no dia 10 ou antes. Os ratos do grupo Cont. foram alojados e amamentados pela represa. (B) A sequência de operações para cada dia após a indução do modelo NEC. Abreviaturas: Cont. = controle; NEC = enterocolite necrosante; LPS = lipopolisacarídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gavage gástrico. (A) Foi utilizado neste estudo um dispositivo de gavage especializado, combinado com tubo plástico e seringa. (B) O tubo de gavage entrou do canto da boca em um ângulo de 45° para a linha vertical. (C) O tubo foi lentamente movido para o centro da boca do camundongo para garantir que a sonda gástrica e o esôfago estivessem no mesmo nível vertical. Abreviaturas: D= diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: MODELO NEC do rato BALB/c. (A) Fotomicrogramas do escore de patologia intestinal dos dois grupos, por exemplo, mostrando mucosa intacta e normal no grupo Cont. (pontuação 0), separação leve de inchaço submucosal ou lamina propria em dois grupos (pontuação 1), separação submucosal moderada e/ou lamina propria no grupo NEC (pontuação 2), separação submucosal e/ou lamina propria grave no grupo NEC (pontuação 3), desaparecimento de villi intestinal com necrose intestinal no grupo NEC (pontuação 4). (B) Os escores de patologia intestinal nos camundongos após a indução da NEC foram superiores aos do grupo Cont. (n = 9 no grupo Cont.n = 35 no grupo NEC, *** P < 0,001 com teste t do Aluno). (C) Fotomicrographs de escores de fezes de dois grupos, por exemplo, mostrando pelotas bem formadas no grupo Cont. (pontuação 0), formaram fezes em dois grupos (pontuação 1), fezes semiformadas no grupo NEC (pontuação 2) e bancos líquidos no grupo NEC (pontuação 3). (D) As pontuações de fezes no grupo NEC foram significativamente maiores do que as do grupo Cont. (n = 6 no grupo Cont., n = 13 no grupo NEC, *** P < 0,001 com teste t do Aluno). O triângulo vermelho representa a separação da mucosa e da lamina propria, e a seta preta aponta para fezes de rato. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: Cont. = controle; NEC = enterocolite necrosante; HE = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparação da forma corporal e sobrevivência de camundongos entre o grupo Cont. e o grupo NEC. (A) O aparecimento dos dois grupos de camundongos nos dias 5 e 10. (B) Esta seção mostra as mudanças de peso dos camundongos em dois grupos ao longo do tempo; o eixo x representa o número de dias após o nascimento dos camundongos, e o eixo y representa as mudanças de peso dos camundongos; **P < 0,01, ***P < 0,001 com o teste t do Aluno para comparar o grupo Cont. (n = 10) e o grupo NEC (n = 27) (C) Esta seção mostra as curvas de sobrevivência dos ratos no grupo controle (n = 10) e no grupo NEC (n = 25). Abreviaturas: Cont. = controle; NEC = enterocolite necrosante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Hemorragia ileocecal em crianças com NEC e camundongos com NEC. (A) Hemorragia e necrose da área ileocecal em crianças com NEC. (B) Hemorragia e necrose na área ileocecal de camundongos com NEC (1/13); no entanto, os intestinos dos camundongos do grupo Cont. estavam normais, sem hemorragia e necrose. O triângulo negro refere-se à hemorragia intestinal e necrose, e a seta vermelha mostra hemorragia e necrose da área ileocecal. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: Cont. = controle; NEC = enterocolite necrosante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composição Mouse (g/L) Substituto de leite (g/L)
proteína 69-118 100
gordura 93-175 100
carboidrato 28-37 50
cálcio 0.97-6.2 2.84
fósforo 1.6-2.72 1.62
sódio 0.66-1.4 1
potássio 1.08-1.7 1.2
cloreto 1.17-1.76 1.76
magnésio 0.0001-0.3 >0.12
zinco 0.009-0.055 0.018
ferro 0.004-0.007 0.017
cobre 0.0017-0.007 0.0018

Tabela 1: Ingredientes de leite de fórmula leiteira.

Figura suplementar S1: A curva de sobrevivência foi significativamente reduzida no grupo NEC de modo que todos os camundongos morreram espontaneamente (n = 5 no grupo Cont., n = 10 no grupo NEC). Abreviaturas: Cont. = controle; NEC = enterocolite necrosante. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A NEC é a emergência do sistema gastrointestinal mais comum para recém-nascidos, com alta incidência e mortalidade, especialmente em bebês prematuros1,2,3. No entanto, sua patogênese ainda não está clara. Acredita-se atualmente que danos mucosos, invasão de patógenos e alimentação enteral são fatores de alto risco para o NEC3. Até o momento, os animais utilizados para o modelo NEC são principalmente suínos, ratos e ratos. A maioria dos estudos tem usado camundongos neonatais C57BL/6 para induzir NEC13,14,15,16, e muito poucos estudos têm usado camundongos neonatais BALB/c para induzir NEC. No entanto, os camundongos BALB/c têm a vantagem da polarização celular th6,7,8, o que garante um estudo mais aprofundado para determinar se eles podem ser um bom modelo nec para a pesquisa de células th da doença.

Referimos-nos ao padrão de pontuação patológica Nadler do modelo NEC17 e descobrimos que a pontuação do grupo NEC foi significativamente maior do que a do grupo controle. Uma pontuação ≥ 2 indica NEC, e a taxa de sucesso de induzir NEC é de 38-50%, o que é inferior à taxa de sucesso de 77% da modelagem nec no estudo por Caplan et al. (DOI:10.3109/15513819409037698). Também avaliamos os escores de fezes18 dos dois grupos de camundongos e descobrimos que os escores do grupo NEC foram superiores aos do grupo controle. Quanto maior a pontuação, mais grave é a disfunção intestinal. Todos esses dados mostram que o estabelecimento do modelo NEC foi bem sucedido. Além disso, é encorajador que o modelo de rato BALB/c neonatal da NEC possa simular nec humano até certo ponto. Hemorragia e necrose ocorrem nos intestinos de crianças com NEC3,19; condições patológicas semelhantes foram observadas neste modelo.

Gavage é o passo chave para induzir nec no modelo do mouse. Se a operação de gavage não foi proficientemente dominada, foi fácil colocar erroneamente a sonda gástrica na traqueia e causar a morte do rato. Durante o gavage gástrico, o polegar esquerdo, o dedo médio e o dedo anelar foram usados para fixar ambos os lados do tronco do rato, e o dedo indicador foi colocado na cabeça para fixar o rato no lugar. Isso foi para evitar que o rato se mova e fez com que a sonda gástrica danifice o esôfago. A sonda gástrica foi inserida do canto esquerdo da boca do rato. É só quando a sonda gástrica entra no esôfago sem resistência podemos continuar inserindo-a. LPS ou leite de fórmula só devem ser injetados após inserir a sonda gástrica de 2 a 3 cm do lábio inferior do camundongo.

O comprimento da hipóxia deve ser cuidadosamente monitorado. Neste estudo, a hipóxia durou 90 s cada vez. Se a hipóxia for muito longa, os ratos não serão capazes de tolerá-la e morrerão. Este modelo pode ser usado para pesquisar células imunes relacionadas à NEC, especialmente células TH1 e TH23,9,10,11,20. No futuro, planejamos investigar se esse modelo é útil para estudar respostas celulares Th2 na NEC. Além disso, este estudo também introduziu um novo método de pontuação nas fezes para avaliar a disfunção intestinal em camundongos com NEC18. No entanto, existem algumas limitações para este estudo. Por exemplo, a taxa de sucesso do modelo não era muito alta. Esforços estão em andamento para melhorar o método de modelagem BALB/c NEC para aumentar a taxa de sucesso, ajustando o nível de hipóxia de 5% O2 para 1% O2, como descrito anteriormente15.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Banco de Recursos Biológicos Clínicos do Centro Médico de Mulheres e Crianças de Guangzhou por fornecer a amostra clínica e o Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center por fornecer camundongos. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China 81770510 (R.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 100092683
Goat Milk powder  Petag  71795558417
HE dye solution Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. G1003
Isoflurane RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. R510  
LPS Sigma-Adrich L2880
Medical oxygen various various
Microscope NIKON NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10004160
Paraffin various various
Premature baby milk powder Abbott 57430
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10023418
1% Hydrochloric acid various various
10% Formalin LEAGENE DF0110

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References

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Medicina Edição 177 Enterocolite necrosante ratos BALB/c Imunologia Células tipo 2 do auxiliar T

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 03/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante
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Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., … More

Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., Chen, J., Chen, Y., Zhang, R., Zhong, W. A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (177), e63252, doi:10.3791/63252 (2021).

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