Summary
His-tag oprensning, dialyse og aktivering anvendes til at øge udbyttet af opløselig, aktiv matrix metalloproteinase-3 katalytisk domæneproteinekspression i bakterier. Proteinfraktioner analyseres via SDS-PAGE geler.
Abstract
Matrixmetalloproteinaser (MMP'er) tilhører familien af metzincinproteaser med centrale roller i ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning og ombygning samt interaktioner med flere vækstfaktorer og cytokiner. Overekspression af specifikke MMP'er er ansvarlig for flere sygdomme såsom kræft, neurodegenerative sygdomme og hjerte-kar-sygdomme. MMP'er har været centrum for opmærksomhed for nylig som mål for at udvikle terapi, der kan behandle sygdomme, der er korreleret med MMP-overekspression.
For at undersøge MMP-mekanismen i opløsning er der behov for mere letkøbte og robuste rekombinante proteinekspressions- og oprensningsmetoder til fremstilling af aktive, opløselige MMP'er. Det katalytiske domæne for de fleste MMP'er kan imidlertid ikke udtrykkes i Escherichia coli (E. coli) i opløselig form på grund af mangel på posttranslationsmaskiner, mens pattedyrs ekspressionssystemer normalt er dyre og har lavere udbytter. MMP-inklusionsorganer skal gennemgå den kedelige og besværlige proces med omfattende oprensning og omfoldning, hvilket reducerer udbyttet af MMP'er i indfødt konformation betydeligt. Dette papir præsenterer en protokol, der bruger Rosetta2 (DE3) pLysS (i det følgende benævnt R2DP) celler til fremstilling af matrixmetalloproteinase-3 katalytisk domæne (MMP-3cd), som indeholder et N-terminal His-tag efterfulgt af pro-domæne (Hisx6-pro-MMP-3cd) til brug i affinitetsrensning. R2DP-celler forbedrer ekspressionen af eukaryote proteiner gennem et chloramphenicolresistent plasmid indeholdende kodoner, der normalt er sjældne i bakterielle ekspressionssystemer. Sammenlignet med den traditionelle cellelinje til valg af rekombinant proteinekspression, BL21 (DE3), forbedrede oprensning ved hjælp af denne nye stamme udbyttet af renset Hisx6-pro-MMP-3cd. Ved aktivering og afsaltning spaltes pro-domænet sammen med N-terminal His-tagget, hvilket giver aktiv MMP-3cd til øjeblikkelig brug i utallige in vitro-applikationer . Denne metode kræver ikke dyrt udstyr eller komplekse fusionsproteiner og beskriver hurtig produktion af rekombinante humane MMP'er i bakterier.
Introduction
De fleste komplekse eukaryote proteiner gennemgår udførlige posttranslationelle modifikationer efter ekspression, hvilket kræver stærkt assisteret proteinfoldning og co-faktorer for at være funktionelle1. Produktion af store mængder opløseligt humant protein i en bakterievært er fortsat en betydelig udfordring på grund af høje omkostninger og manglen på robuste ekspressions- og oprensningsmetoder, selv for laboratorieforsøg i mindre skala2,3. MMP'er, humane endopeptidaser med stor molekylvægt, udtrykkes normalt som uopløselige inklusionslegemer, når de udtrykkes i E. coli. Ekstraktion af opløselige humane MMP'er fører ofte til en besværlig, tidskrævende opløseligheds- og genfoldningsproces4.
MMP'er har kritiske roller i både fysiologiske og patogene processer. Humane MMP'er er en familie af 23 zinkendopeptidaser, kategoriseret efter struktur og substratspecikalitet og forskelligt udtrykt på trods af et stærkt bevaret katalytisk domæne5,6. MMP'er udskilles som inaktive zymogener, reguleret via posttranslationel aktivering og deres endogene hæmmere, vævshæmmere af metalloproteinaser (TIMP'er)7,8,9,10. Selvom MMP'er oprindeligt blev anerkendt for deres rolle i ECM-omsætningen, har de også været impliceret i udvikling, morfogenese, vævsreparation og ombygning8. Dysregulering af MMP'er har især været forbundet med kræft sammen med neurodegenerative, kardiovaskulære og fibrotiske sygdomme, blandt andre sygdomme5,7.
Udviklingen af robuste MMP-produktionsmetoder i stor skala er afgørende for at sikre succesen med fremtidige undersøgelser af MMP-mekanismer gennem biokemiske og cellebaserede assays. Forskellige MMP'er er tidligere blevet udtrykt i bakterier11, herunder Hisx6-mærkede MMP'er, uden at ændre MMP-aktivitet12,13,14,15. Disse metoder inkluderer dog kedelige, lange trin, der kan være vanskelige at replikere.
Pattedyrceller kan også bruges til at udtrykke mange forskellige humane proteiner, samtidig med at de sikrer de korrekte posttranslationelle modifikationer16. Selv om pattedyrs ekspressionssystem er et ideelt valg til fremstilling af rekombinante humane proteiner med korrekte postoverensstemmende modifikationer, er de største ulemper ved denne metode indledende lave udbytter, dyre vækstmedier og reagenser, lange tidslinjer for at nå stabile ekspressionslinjer og risiko for forurening med andre arter såsom svampe eller bakterier2,11 . Desuden giver MMP-produktion i pattedyrs cellelinjer urenheder fra associerede cellulære proteiner såsom TIMP'er eller fibronectiner11. I modsætning til den langsomme cellevækst, der observeres i pattedyrceller, tilbyder bakterieekspressionssystemet storskala proteinproduktion på kort tid sammen med enklere medie- og vækstkrav. På grund af manglen på andre associerede cellulære proteiner (dvs. TIMP'er) i bakterielle ekspressionssystemer udsættes aktive MMP'er i højere koncentrationer imidlertid for nedbrydning gennem autoproteolyse, hvilket resulterer i dårligt MMP-udbytte17.
Dette papir beskriver en detaljeret metode til bakteriel ekspression, oprensning og aktivering af rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd ved hjælp af E. coli som ekspressionsvært på grund af dets overkommelige priser, enkelhed og succes med at producere højere udbytter af MMP'er2,3,18. Da E. coli mangler proteinfoldemaskineri og posttranslationel behandling, der kræves til rekombinante MMP'er og andre komplekse proteiner, er mange E. coli-stammer blevet konstrueret til at overvinde disse begrænsninger, hvilket gør E. coli til en mere egnet vært til ekspression af rekombinant human MMP-3cd,19,20 . For eksempel forbedrer R2DP-stammen, der anvendes i denne undersøgelse, eukaryot ekspression ved at levere et chloramphenicolresistent plasmid indeholdende kodoner, der sjældent anvendes i E. coli.
Som beskrevet i denne protokol ekstraheres hisx6-pro-MMP-3 katalytiske domæneproteiner (MMP-3cd) efter overekspression af relativt rene inklusionslegemer fra pET-3a-vektoren (figur 1) i R2DP-celler4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 blev renset ved hjælp af affinitetsmærkekromatografi. Ved omfoldning og dialyse blev pro-MMP-3cd (zymogen) aktiveret af 4-aminophenylmercuric acetat (APMA), og SDS-PAGE-analyse anvendes til at evaluere udbytter og behovet for yderligere oprensning5,21. Denne protokol beskriver ekspression, oprensning og aktivering af opløselig mMP-3cd som et eksempel. Det kan dog også anvendes som vejledning til ekspression af andre MMP'er og humane proteaser med lignende ekspression og aktiveringsmekanismer (figur 2). For andre proteiner end MMP-3cd rådes læseren til at bestemme optimale buffersammensætninger og metoder til deres målprotein, inden denne protokol forsøges.
Figur 1: Plasmidkort over pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-plasmidet. PET-3a-vektoren indbefatter et ampicillinresistensgen. En N-terminal Hisx6-tag-sekvens klones ind i den pET-3a-baserede vektor, herunder pro-MMP-3cd, for at give pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruktionen under kontrol af T7-promotor mellem BamHI- og NdeI-begrænsningssteder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bakteriel ekspression af pro-MMP-3cd, oprensning, omfoldning og aktivering. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid blev omdannet til BL21 (DE3) eller R2DP-celler. 1.2: Pro-MMP-3cd-proteinekspression blev induceret under anvendelse af IPTG. 1.3: Kemisk lysis og sonikering bruges til at ekstrahere Hisx6-pro-MMP-3cd-proteiner, der hovedsageligt er uopløselige og findes i inklusionsorganerne. Urea blev brugt til at denaturere og opløse protein fra inklusionslegemer. 2.1. Denatureret Hisx6-pro-MMP-3cd-protein blev oprenset via affinitetskromatografirensning. 3. Den eluerede Hisx6-pro-MMP-3cd blev langsomt foldet om under dialyse gennem gradvis fjernelse af urinstof fra bufferen. 4. Endelig blev genfoldet MMP-3cd-protein aktiveret ved hjælp af APMA ved at fjerne det N-terminale propeptiddomæne. APMA fjernes senere fra opløsningen ved afsaltning. Tallene svarer til protokolafsnit, der beskriver disse trin. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domæne; APMA = 4-aminophenylmercuric acetat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MMP-udtryk
- Kloning og transformation af pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd til R2DP-celler
- Fordøje pET-3a-plasmidet (se materialetabellen) med NdeI- og BamHI-restriktionsenzymer i Digest Buffer (se materialetabellen). I et samlet reaktionsvolumen på 40 μL tilsættes 4 μL Digest Buffer, 33 μL 100 ng/μL plasmid og 1,5 μL af hvert restriktionsenzym, og reaktionen tillades at fortsætte i ~2 timer, indtil den er færdig ved 37 °C.
- Udfør en PCR-reaktion på MMP-3cd-sekvensen for at indsætte et N-terminal His-tag. Brug 25 μL PCR-blanding (se materialetabellen), 2,5 μL 10 μM-primere (supplerende figur S1) og 1,25 μL af 100 ng/μL-insertsekvensen. Der tilsættes sterilt vand til et endeligt reaktionsvolumen på 50 μL.
- Kør PCR-produktet og fordøjet vektor på en 1% agarosegel. Rens gelbåndene ved hjælp af et Gel Recovery Kit (se materialetabellen) i henhold til producentens protokol.
- Klon det amplificerede PCR-produkt ind i den fordøjede vektor mellem NdeI- og BamHI-restriktionsstederne ved hjælp af DNA Assembly Mix (se materialetabellen). Brug onlineværktøjer til at bestemme det krævede volumen af indsats- og skærevektoren for et samlet reaktionsvolumen på 15 μL.
- Optø en 50 μL alikvot celler med høj transformationseffektivitet (se materialetabellen) på is, indtil den er optøet. Forvarm SOC-vækstmedium (se tabellen over materialer) til 37 °C og LB-ampicillin (LB Amp) plader (se materialetabellen).
- Tilsæt 1-2 μL af pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-samlingsreaktionen til 50 μL-alikvoten. Inkuber på is i 30 min.
- Varmechok cellerne ved at inkubere ved 42 °C i 30 s. Inkuber på is i 2 min.
- Tilsæt 950 μL SOC-vækstmedium til hver transformerende blanding. Ryst i 1 time ved 250 o / min og 37 ° C.
- Plade 100 μL af transformanterne på LB Amp-plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
- Inokuler hver isoleret koloni i 10 ml LB Amp medium. Ryst natten over ved 250 o / min og 37 ° C.
- Uddrag plasmid-DNA pr. producentens protokol for miniprep-sættet (se materialetabellen). Bekræft konstruktionens sekvens ved hjælp af T7 fremadgående og omvendte primere (supplerende figur S1).
BEMÆRK: PET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruktions-DNA'et kan opbevares ved -20 °C. Når du er klar, skal du fortsætte med transformationen til R2DP-celler. - Tø en 20 μL alikvote R2DP-celler (se materialetabellen) op på is i 2-5 min. Forvarm SOC-vækstmedium til stuetemperatur og LB Amp CamR-plader til 37 °C (se materialetabellen).
- Tilsæt 1 μL 100 ng/μL sekvensbekræftet pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd til 50 μL aliquot. Rør forsigtigt for at blande og sæt røret tilbage til is.
- Inkuber røret på is i 5 minutter.
- Varmechok cellerne ved at inkubere ved 42 °C i præcis 30 s. Ryst ikke.
- Læg cellerne på is i 2 min.
- Der tilsættes 80 μL SOC-medium ved stuetemperatur til den transformerende blanding. Ryst i 1 time ved 250 o / min og 37 ° C.
- Plade transformanterne på LB Amp CamR plader og inkubere natten over ved 37 ° C.
- Vækst og induktion
- Inokuler en enkelt, isoleret koloni af R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd transformeringsmiddel fra en LB Amp CamR plade i 10 ml LB Amp CamR medier ved 37 ° C. Ryst ved 250 o / min natten over (~ 16 timer). Gem alikvoter fra hver kultur og tilbered 40% (v/v) glycerol (se tabellen over materialer), hvis det ønskes.
- Pr. dyrkning natten over podes en 1 L kolbe indeholdende 500 ml LB Amp CamR-medium til en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 0,05-0,1.
BEMÆRK: Dette skal returnere cellerne til logaritmisk vækst. - Mål OD600 på flere tidspunkter, typisk i 3-4 timer, indtil den falder mellem 0,4 og 0,6.
- Før induktion aliciterer en brøkdel af kulturen i et 1,5 ml mikrofugerør (se materialetabellen) og mærker det Ikke-induceret fraktion. Opbevar det ved -80 °C til gelanalyse. Hvis du ikke kører en SDS-PAGE gel, skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 1.2.5.
- Kulturerne induceres til en endelig koncentration på 1 mM ved anvendelse af 1 M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (se materialetabellen). Fortsæt med at inkubere i 37 °C-rysteren i yderligere 3-4 timer.
BEMÆRK: Under ekspression skal læseren bestemme den optimale OD600 på induktionstidspunktet og IPTG-koncentrationen. Hvis udbyttet falder væsentligt efter oprensning, kan imidazolkoncentrationen i oprensningsbuffere kræve justering, eller det kan være nødvendigt at sonikere yderligere. - Før centrifugering af kulturerne, aliquot en brøkdel af kulturen i et andet 1,5 ml mikrofugerør og mærke det Induceret fraktion. Opbevar det ved -80 °C til gelanalyse. Hvis du ikke kører en SDS-PAGE-gel, skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 1.2.7.
- Centrifugering af cellekulturen i 250 ml koniske flasker (se materialetabellen) ved maksimal hastighed og 4 °C i 10 minutter.
- Gentag trin 1.2.7, indtil kulturerne er fuldstændig pelleteret.
BEMÆRK: PAUSE: Cellepiller kan fryses ved -80 °C og optøes senere til videre forarbejdning. Ellers skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 1.3.1.
- Inklusion kropsekstraktion og opløselighed
BEMÆRK: Forbered frisk 10 M urinstof, helst tidligst en dag i forvejen, omrør grundigt, indtil det er helt opløst. Opvarm eller autoklave ikke urinstof; opbevar det ved stuetemperatur.- Genbrug pillen (fra trin 1.2.8) i lysisbuffer (se materialetabellen). Pr. Gram pellet tilsættes 3 ml lysisbuffer og suspenderes igen ved hvirvel eller pipettering. Ryst natten over ved 4 °C.
- Der tilsættes 1,25 ml 10 % natriumdeoxycholat (w/v) (se materialetabellen) pr. 1 liter kultur. Ryst ved stuetemperatur i 30 minutter ved 150 o / min.
- Der tilsættes 10 μL DNase I (se materialetabellen) pr. 1 liter kultur. Ryst ved stuetemperatur i 30 minutter ved 150 o / min.
- Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 × g og 4 °C.
- Afsæt en brøkdel af lyseret MMP til gelanalyse. Opbevar den ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 1.3.6.
BEMÆRK: Efter centrifugering kan pillen være streng og ikke kompakt pakket, hvilket gør det risikabelt at kassere supernatanten. Hvis dette er tilfældet, skal du springe trin 1.3.6 over og fortsætte til trin 1.3.7. - Supernatanten kasseres fra de centrifugerede prøver.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt, og cellepillerne fryses ved -80 °C og optøes senere. Ellers skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 1.3.7. - Resuspend pelleten i 100 ml / l kultur af Inclusion Body Buffer (se tabellen over materialer) ved at pipettere op og ned.
- Under sonikering skal du holde prøverne på is for at forhindre overophedning. Sonikere hver prøve i 6 cyklusser på 15 s, output 5 og 50% puls. Tillad 15 s hvileperioder til afkøling mellem cyklusser.
BEMÆRK: Overfør om nødvendigt prøverne til 50 ml koniske rør for yderligere centrifugering (se materialetabellen). Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 × g og 4 °C. - Afsæt en brøkdel af Sonicated MMP til gelanalyse. Opbevar den ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 1.3.11.
- Kontroller pelleten. Hvis du er streng, skal du gentage trin 1.3.8-1.3.10. Hvis pelleten er kompakt, kasseres supernatanten og fortsætter til trin 1.3.12.
BEMÆRK: Sonikering i Inclusion Body Buffer kan gentages for at genvinde mere protein fra det lyserede celleaffald. Imidlertid kan for meget sonikering forårsage forskydning, hvilket skader MMP-udbyttet. Protokollen kan sættes på pause på dette stadium, og cellepillerne kan fryses ved -80 °C og optøes senere. - Resuspend hver pellet fra en 1 L kultur i 5 ml opløselighedsbuffer (se materialetabellen) ved pipettering. Inkuber i mindst 30 minutter på is for at lade proteinerne opløses.
- Afsæt en brøkdel af opløselig MMP til gelanalyse. Opbevar den ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 1.3.14.
- Centrifugering af cellerne i 10 minutter ved 13.000 × g og 4 °C. KASSÉR IKKE SUPERNATANTEN.
- Hvis en pellet dannes/forbliver efter centrifugering, hældes supernatanten i et separat 50 ml konisk rør. Genbrug pillen i yderligere 5 ml opløselighedsbuffer (pr. 1 liter kultur) ved pipettering op og ned.
- Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 × g og 4 °C. KASSER IKKE SUPERNATANTEN.
- Gentag trin 1.3.13 og 1.3.14, indtil der dannes lidt eller ingen pellet efter centrifugering, eller kun gråt bundfald er tilbage. Pool supernatanterne. Kassér eller opbevar pelleten ved -80 °C for yderligere sonikering.
2. MMP-oprensning og -omfoldning
- His-tag (HT) affinitetsrensning
- I henhold til producentens protokol skal du fylde en tyngdekraftsstrømskolonne (se materialetabellen) med godt blandet Ni-NTA-harpiks (se materialetabellen). Lad harpiksen sætte sig og adskille sig fra lagringsbufferen, således at der dannes en særskilt linje mellem de to lag.
BEMÆRK: Lad aldrig harpiksen tørre, da luft vil trænge ind i harpiksen og skade proteinudbyttet. Mellem anvendelserne udføres den i punkt 2.2 beskrevne procedure for regenerering af harpiks. - Lad lagerbufferen dræne. Fyld kolonnen med to harpiks-seng volumener af HT Equilibration Buffer.
- Tøm HT Equilibration Buffer og kassér. Når søjlen drænes, centrifugeres proteinekstraktet ved 13.000 × g i 1 min og filtersteriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter (se materialetabellen).
- Byt affaldsbeholderen ud med et 50 ml konisk rør mærket HT Flowthrough. Tilsæt det tilberedte proteinekstrakt til kolonnen.
- Genanvend gennemstrømningen for at maksimere bindingen.
- Afsæt en brøkdel af Flowthrough Fraction til gelanalyse. Opbevar den ved -80 °C. Hvis gelanalysen ikke udføres, skal du fortsætte til trin 2.1.7.
- Vask straks harpiksen med 15 ml HT-vaskebuffer (se materialetabellen). Saml gennemstrømningen i 15 ml koniske rør (se materialetabellen) mærket HT Wash.
BEMÆRK: Absorbansværdier ved 280 nm (A280) blev opnået via spektrofotometri og anvendt sammen med molekylvægt og udryddelseskoefficient, ε, til at estimere proteinkoncentrationer. For denatureret Hisx6-pro-MMP-3cd er molekylvægten 29,86 kDa, og ε er 34,38 M-1 cm-1. - Blanking mod HT Wash Buffer, mål og registrer A280. Gentag trin 2.1.7 og 2.1.8 med yderligere vaskefraktioner. Når A280 nærmer sig baseline, og urenheder er minimeret, skal du fortsætte til trin 2.1.9.
- Afsæt en brøkdel af wash fraction til gelanalyse. Gentag for flere vaskefraktioner. Fraktionerne opbevares ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 2.1.10.
- Eluer straks His-mærkede proteiner ved at tilsætte 5 ml HT Elution Buffer (se tabellen over materialer). Opsaml gennemstrømningen som 0,5-1 ml fraktioner i mikrofugerør mærket HT Elution.
- Afsæt en brøkdel af Elution Fraction til gelanalyse. Gentag for flere elueringsfraktioner. Fraktionerne opbevares ved -80 °C. Hvis gelanalysen ikke udføres, skal du fortsætte til trin 2.1.12.
- Hvis A280 er >0,3 mg/ml, fortyndes fraktionen med HT-ligevægtsbuffer (se materialetabellen).
BEMÆRK: Den eluerede fraktion skal fortyndes til en A280 på 0,3 mg/ml eller derunder for at forhindre udfældning under dialyse. Protokollen kan sættes på pause her, og de samlede fraktioner fryses ved -80 °C og optøes senere. Ellers skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 2.2.1.
- I henhold til producentens protokol skal du fylde en tyngdekraftsstrømskolonne (se materialetabellen) med godt blandet Ni-NTA-harpiks (se materialetabellen). Lad harpiksen sætte sig og adskille sig fra lagringsbufferen, således at der dannes en særskilt linje mellem de to lag.
- Regenerering af harpiks
- Vask harpiksen med ti harpiks-bed volumener af HT Regenerering Buffer (se tabellen over materialer) og ti harpiks-bed volumener af sterilt vand.
- Opbevar harpiksen som en 50% opslæmning i 20% (v/v) ethanol i vand.
3. Omfoldning af protein
BEMÆRK: Til mindre volumener kan dialysekassetter anvendes med en lavere risiko for prøvetab. Dialyseslanger er påkrævet, hvis der anvendes større mængder (se materialetabellen).
- Dialyse
BEMÆRK: Den optimale proteinkoncentration til dialyse er ~0,3 mg/ml. Hvis der forekommer signifikant nedbør under dialyse, skal du reducere urinstofkoncentrationsgradienten mellem hver dialyse ved hjælp af en trinvis dialysemetode og tilføje flere mellemliggende trin (f.eks. Fra 6 M til 5 M og derefter 5 M til 4 M i stedet for at springe over 5 M-trinnet). Da fryse-optøningscyklusser beskadiger celle- og proteinstrukturen, er det vigtigt at minimere pauser i protokollen.- I henhold til producentens protokol skal du bruge den passende mængde dialyseslanger i henhold til mængden af Elution Fraction-prøver .
- Nedsænk de eluerede MMP-fraktioner i dialyseslanger i 1 liter dialysebuffer 1 (se materialetabellen). Slangen og dens indhold røres på en magnetisk omrører i mindst 8 timer ved 4 °C.
- Overførsel til 1 liter dialysebuffer 2 (se materialetabellen). Slangen og dens indhold røres på en magnetisk omrører i mindst 8 timer ved 4 °C.
- Overførsel til 1 liter dialysebuffer 3 (se materialetabellen). Slangen og dens indhold røres på en magnetisk omrører i mindst 8 timer ved 4 °C.
- Overfør prøven til nye 50 ml koniske rør og mærk dem som dialyseret MMP.
- Undersøg røret for ethvert bundfald. Hvis der er dannet bundfald, centrifugeres prøven i 1 min. ved 13.000 × g og 4 °C.
- Overfør supernatanten til nye 15 ml koniske rør og mærk dem som Omfoldet MMP.
- Afsæt en brøkdel til gelanalyse, og mærk den som Refolded MMP. Opbevar den ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 3.1.9.
BEMÆRK: Hvis udbyttet er lavt, kan bundfaldet opløses i HT Equilibration Buffer og trin i pkt. 3.1 gentages med dialyseslanger. Hvis gelanalysen ikke skal udføres, eller hvis protokollen skal sættes på pause her, fryses prøverne ved -80 °C og optøes senere. Hvis udbyttet er i det ønskede område, skal du fortsætte til trin 3.2.1.
- Rekoncentration
BEMÆRK: Udryddelseskoefficienterne for omfoldet og denatureret Hisx6-pro-MMP-3cd forventes at være de samme; A280-beregningerne påvirkes derfor ikke.- Prøven rekoncentrerer op til 0,5 mg/ml. Brug en 400 ml omrørt celle (se materialetabellen) til at koncentrere prøven til 15 ml. For at forhindre skumdannelse skal du bruge et 50 ml rekoncentratationsrør til at koncentrere sig yderligere, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Hvis der dannes et bundfald, kan det pelleteres og opløses i HT Equilibration Buffer. Gentag derefter afsnit 3.1 og trin 3.2.1. Ellers skal du fortsætte til trin 3.2.2. - Afsæt en brøkdel til gelanalyse og mærk den som Koncentreret MMP.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne fryses ved -80 °C og optøes senere.
- Prøven rekoncentrerer op til 0,5 mg/ml. Brug en 400 ml omrørt celle (se materialetabellen) til at koncentrere prøven til 15 ml. For at forhindre skumdannelse skal du bruge et 50 ml rekoncentratationsrør til at koncentrere sig yderligere, hvis det er nødvendigt.
4. Aktivering
- 4-Aminophenylmercuric acetat (APMA) aktivering
BEMÆRK: APMA er meget giftigt. Lav en frisk lageropløsning på 20 mM APMA inden aktivering, og arbejd altid under en stinkhætte, når du bruger APMA. Kassér APMA-affaldet i beholderen.- Pr. 1 ml Alikvote MMP (1 mg/ml) tilsættes 50 μL 20 mM APMA (se materialetabellen) for at nå en endelig APMA-koncentration på 1 mM. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Hvis der dannes et bundfald, centrifugeres det ved maksimal hastighed i 10 minutter ved 4 °C. Opbevar supernatanten i et 1,5 ml mikrofugerør mærket Aktiveret MMP. Kasser bundfaldet i en beholder, der er mærket til APMA-affald.
- Afsæt en brøkdel til gelanalyse, og mærk den Aktiveret MMP.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne fryses ved -80 °C og optøes senere. Hvis der ikke udføres gelanalyse, skal du fortsætte til trin 4.2.1. Efter aktivering er molekylvægten og udryddelseskoefficienten for MMP-3cd henholdsvis 19, 40 kDa og 28, 42 M-1 cm-1.
- Afsaltning
- Fjern APMA fra den aktiverede MMP-3cd-prøve med en afsaltningskolonne på 2 ml (se materialetabellen) efter producentens protokol.
- Sæt en brøkdel til side til gelanalyse og mærk den Afsaltet MMP. Opbevar den ved -80 °C. Hvis der ikke udføres gelanalyse, fortsættes til pkt. 4.3 med de resterende prøver.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne fryses ved -80 °C og optøes senere.
- Kørsel af SDS-PAGE gelerne
- Kør alle proteinfraktioner på SDS-PAGE geler: Ikke-induceret fraktion, induceret fraktion, lyseret MMP, sonikeret MMP, opløselig MMP, flowthrough fraktion, vaskefraktion, elueringsfraktion, omfoldet MMP, koncentreret MMP, aktiveret MMP og afsaltet MMP.
- Langtidsopbevaring af MMP-3
- Tilsæt 0,05 % (v/v) ikke-iionisk overfladeaktivt stof (se materialetabellen) til de afsaltede MMP-3cd-prøver, og opbevar dem ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du kører prøver på SDS-PAGE, fordi proteinet udtrykkes i form af uopløselige inklusionsorganer, bør de lyserede og sonikerede fraktioner indeholde lidt eller ingen Hisx6-pro-MMP-3cd-ekstrakt, da proteinet endnu ikke er blevet reopløseligt i urinstof. Figur 3 sammenligner His-tag-oprensningselueringsfraktionerne af Hisx6-pro-MMP-3cd fra BL21 (DE3) celler og R2DP-celler. Elueringsfraktioner blev samlet separat for både BL21(DE3) og R2DP-celler før dialyse. Fraktioner fra hvert trin blev kørt, efter at proteinerne blev afsaltet (figur 4). Alle Hisx6-pro-MMP-3cd-prøver viser et bånd på ca. 30 kDa, og aktiv MMP-3cd viser et bånd på ca. 20 kDa ved fjernelse af His-tag og pro-domæne (figur 4 og supplerende figur S1).
Det samlede udbytte af protein i mg/l E. coli-kultur blev bestemt efter oprensning og afsaltning af BL21(DE3)- og R2DP-kulturer (tabel 1). Brug af R2DP-celler giver væsentligt højere niveauer af MMP-ekspression. Mens almindelige BL21 (DE3) celler kun gav 3,5 mg oprenset Hisx6-pro-MMP-3cd pr. Liter kultur, producerede R2DP-celler 45 mg / L-kultur. Tilsvarende steg udbyttet af funktionel, afsaltet MMP-3cd fra 0,13 mg/l-dyrkning til 6,2 mg/l-dyrkning for henholdsvis BL21(DE3)- og R2DP-celler. Human pro-MMP-3cd overvælder det cellulære maskineri i standard BL21 (DE3) stammen på grund af dens størrelse (ca. 30 kDa) og de udførlige posttranslationelle modifikationer, der kræves, der er eksklusive for eukaryoter. R2DP-stammerne er BL21 (DE3) derivater, designet til at forbedre ekspressionen af eukaryote proteiner. R2DP-stammen bærer tRNA'er til AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC og CGG, som sjældent anvendes i E.coli , men rigelige i pro-MMP-3cd DNA-sekvensen. Dette er potentielt en nøglefaktor i de øgede niveauer af proteinekspression, der observeres i R2DP-celler.
Figur 3: SDS-PAGE gelanalyse af Hisx6-pro-MMP-3cd-ekspression i BL21(DE3) og R2DP-celler. (A) De første otte elueringsfraktioner af Hisx6-pro-MMP-3cd i BL21(DE3)-celler. (B) De første otte elueringsfraktioner af Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP-celler. Efter ekstraktion og opløselighed af MMP-inklusionslegemer i urinstof blev Hisx6-pro-MMP-3cd-prøver renset gennem Ni-NTA-kromatografikolonnen under anvendelse af batch-tyngdekraftsflow. Geler afkortes for kun at vise elueringsfraktionerne. På grund af høje koncentrationer af protein er fraktioner 1-5 oprindeligt 1 ml. Senere fraktioner (6-8) er mellem 5 og 8 ml hver. Hisx6-pro-MMP-3cd-båndet observeres ved ~30 kDa. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domæne; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese; Ni-NTA = nikkel-nitrilogeddikesyre; FT = gennemløb. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Proteolytisk spaltning af His-tag og pro-domæne ved aktivering af MMP-3cd. De inducerede, omfoldede, koncentrerede, aktiverede og afsaltede fraktioner af MMP-3cd i R2DP-celler er vist. Efter dialyse koncentreres Hisx6-pro-MMP-3cd og aktiveres ved hjælp af APMA. Ved aktivering er molekylvægten af det aktiverede MMP-3cd-bånd ca. 20 kDa i modsætning til det His-mærkede zymogen, som forbliver på ~ 30 kDa. Urenheder fjernes i aktiverings- og afsaltningstrinnene. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domæne; APMA = 4-aminophenylmercuric acetat. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Faser | BL21(DE3)-celler | R2DP-celler | ||||
| Volumen (ml) | Koncentration (mg/ml) | Udbytte (mg/l-kultur) | Volumen (ml) | Koncentration (mg/ml) | Udbytte (mg/l-kultur) | |
| Rensning | 23 | 0.30 | 3.5 | 42 | 2.1 | 45 |
| Afsaltning | 1.5 | 0.17 | 0.13 | 72 | 0.17 | 6.2 |
Tabel 1: Tabel over volumener og koncentrationer på tværs af stadier af MMP-3cd-oprensning. Hisx6-pro-MMP-3cd blev udtrykt enten i 2 L af en dyrkning af BL21 (DE3) eller i 2 L R2DP-celler. Volumen, koncentration og udbytte (mg pr. liter) kultur rapporteres for BL21 (DE3) og R2DP celler. Udbytte (mg pr. Liter kultur) blev opnået ved at dividere det samlede udbytte af protein (mg) opnået med volumen af kultur, hvilket var 2 L for både BL21 (DE3) og R2DP tilfælde. Proteinmængder udbytter rapporteres for to faser: Hisx6-pro-MMP-3cd efter Hisx6-tag rensning og aktiv MMP-3cd efter afsaltning.
Supplerende figur S1: Sekvenser af T7-primere og MMP-3cd-protein før og efter aktivering. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den storstilede produktion af opløselige, humane, rekombinante MMP'er er fortsat en udfordrende opgave. Pattedyrceller kan udtrykke funktionelle MMP'er til høje omkostninger og lange ventetider, mens E. coli hurtigt producerer store mængder MMP-inklusionsorganer, der skal renses og genfoldes11,16. R2DP-celler øger udbyttet af MMP-inklusionsorganer betydeligt, hvilket muliggør en mere omkostningseffektiv og produktiv MMP-omfoldningsproces. E. coli mangler imidlertid det posttranslationelle maskineri, der er nødvendigt for at folde MMP'er, og selvom konstruerede stammer viser stærkt forbedrede ekspressionsniveauer, er kun nogle mellemprodukter korrekt foldet ved fjernelse af denatureringsmiddel4. Derfor forventes der stadig lejlighedsvis udfældning af MMP'er under omfoldning og aktivering. Disse resultater viser, at en betydelig del af det rensede Hisx6-pro-MMP-3cd-udbytte går tabt efter omfoldning, aktivering og afsaltning.
Disse faser kan optimeres yderligere ved at tilføje flere dialysestadier sammen med testkoncentrationer af MMP-3cd og APMA. Pr. Liter kultur er udbyttet af funktionel MMP-3cd imidlertid 49 gange højere i R2DP-celler end BL21 (DE3) celler. Derudover steg andelen af funktionelle, afsaltede MMP-3cd genvundet fra renset Hisx6-pro-MMP-3cd fra 3,7% for BL21 (DE3) celler til 14% for R2DP-celler. Derfor tilbyder R2DP-celler et levedygtigt alternativ til de nuværende MMP-produktionsmuligheder, såsom ekspression i pattedyrceller, hvilket giver mere konkurrencedygtige udbytter pr. Liter kultur.
Denne protokol beskriver en detaljeret metode til at udtrykke og rense Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP E. coli-celler sammen med aktivering og genfoldning af MMP-3cd. Da protokollen tager flere dage at gennemføre, er omhyggelig planlægning afgørende for at minimere tabet af funktionelle MMP'er på grund af flere fryse-optøningscyklusser. Da R2DP-celler er den vigtigste forbedring i denne metode, er det altafgørende at optimere ekspressionsudbyttet, da store mængder kan gå tabt gennem genfoldning og aktivering. Under ekspressionen skal operatøren bestemme den optimale OD600- og IPTG-koncentration inden induktion. Efter His-tag-oprensning, hvis udbyttet falder betydeligt, skal harpiksen muligvis regenereres eller udskiftes, eller cellepillen skal muligvis sonikeres yderligere.
Hvis der forekommer signifikant nedbør under dialyse, skal du reducere ændringerne i urinstofkoncentrationen mellem trinvis dialyse ved at tilføje flere trin (f.eks. Fra 6 M til 5M og derefter 5 M til 4 M i stedet for at springe over 5 M-stadiet). Når de er foldet om, og især efter aktivering, er MMP'er væsentligt mere tilbøjelige til nedbør eller nedbrydning gennem autoproteolyse17. Efter at pH- og saltkoncentrationerne af alle buffere er blevet optimeret, og de ønskede tests er udført, skal alle trin efter dialyse afsluttes hurtigst muligt.
Stigende opmærksomhed mod MMP'er som potentielle mål for terapi er blevet opfyldt med hurtige innovationer inden for proteinteknik til forbedring af binding, hæmning og selektivitet af MMP-terapi9. Derfor bliver de engang ambitiøse udsigter inden for MMP-terapi stadig mere opnåelige6. Behovet for hurtige, pålidelige metoder til at genvinde opløselige, aktive MMP'er vil utvivlsomt blive mere bydende nødvendigt med tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Evette Radisky og Alexandra Hockla på Mayo Clinic i Jacksonville, Florida, for at have leveret pET-3a-pro-MMP-3cd-plasmidet som skabelon til kloning af Hisx6pro-MMP-3cd-genet og deres kommentarer sammen med Dr. Paul Hartley fra Nevada Genomics Center ved University of Nevada, Reno, til DNA-sekventering. Forfatterne vil også gerne takke Cassandra Hergenrader for at hjælpe med en del af proteinekspressionen. M.R.-S. vil gerne takke NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience-bevillingen og UNR R&D mICRO SEED Grant Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging |
| 1 L Erlenmeyer flasks | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
| 1 L glass bottles | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
| 1.5 mL microfuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
| 18 G, 1-in. beveled needle | Amazon | B07S7VBHM2 | Used in combination with the dialysis casette |
| 2 mL desalting column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Removes APMA following activation |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
| 250 mL conical bottle cushions | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation |
| 250 mL conical bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
| 400 mL stirred cell | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit |
| 4-aminophenylmercuric acetate (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Activates MMP-3 by cleaving the propeptide |
| 5 mL syringe | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Used in combination with the dialysis casette |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Used for storage in many purification steps |
| 50 mL re-concentration tube | Sigma Aldrich | UFC901024D | Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media |
| BamHI | NEB | R3136S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Calcium chloride (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | The calcium ion stabilizes MMP structure |
| Cell spreaders | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Can be used to spread cells across a petri dish after transformation |
| Chloramphenicol | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media |
| Dialysis Buffer 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea. |
| Dialysis Buffer 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea. |
| Dialysis Buffer 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2. |
| Dialysis clips | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Used in combination with snakeskin dialysis tubing |
| Dialysis tubing | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss |
| Digest buffer | NEB | B7204S | Buffer used in digesting the pET3a vector |
| Disposable cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds |
| DNA assembly mix | NEB | E2621S | Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector |
| DNase I | NEB | M0303S | Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds |
| Gel recovery kit | Promega | A9281 | Isolates and purifies DNA from agarose gels |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C |
| Gravity flow column | BioRad | 7321010 | Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins |
| High-transformation efficiency cells | NEB | C2987 | High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct |
| HT Elution Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| HT Equilibration Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4 |
| HT Regeneration Buffer | n/a | n/a | 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0 |
| HT Wash Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Used to pH buffers |
| Imidazole | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein |
| Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C |
| LB Amp CamR media | n/a | n/a | To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Amp CamR plates | n/a | n/a | To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride |
| Lysis Buffer | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0 |
| Lysozyme | MP Biomedicals | 195303 | Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls |
| Miniprep kit | Promega | A1330 | If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants |
| NdeI | NEB | R0111S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Ni-NTA resin | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole |
| Nonionic surfactant | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity. |
| PCR mix | NEB | M0492S | A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector |
| pET plasmid | Addgene | n/a | The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | Used for plating transformants on LB agar media |
| R2DP cells | Novagen | 714033 | BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli |
| SOC growth media | NEB | B9020S | Non-selective growth media for rapid growth during transformation |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Used in buffers and helps with protein stability |
| Sodium deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls |
| Solubilization Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Detergent used for cell lysis |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure |
| Zinc chloride (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3 |
References
- Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).
- Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).
- Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).
- Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).
- Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313 (2020).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
- Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
- Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
- Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
- Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
- Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
- Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
- Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).
- McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
- Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).
- Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).
- Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).
