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Biochemistry

बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और मानव मैट्रिक्स Metaloproteinase-3 के शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर

Published: March 30, 2022 doi: 10.3791/63263
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno
* These authors contributed equally

Summary

उनके टैग शुद्धिकरण, डायलिसिस, और सक्रियण बैक्टीरिया में घुलनशील, सक्रिय मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन प्रोटीन अभिव्यक्ति की पैदावार बढ़ाने के लिए नियोजित कर रहे हैं। प्रोटीन अंशों का विश्लेषण एसडीएस-पेज जैल के माध्यम से किया जाता है।

Abstract

मैट्रिक्स metaloproteinases (MMPs) extracellular मैट्रिक्स (ECM) गिरावट और remodeling में केंद्रीय भूमिकाओं के साथ metzincin proteases के परिवार से संबंधित हैं, साथ ही साथ कई विकास कारकों और साइटोकिन्स के साथ बातचीत। विशिष्ट एमएमपी का ओवरएक्सप्रेशन कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और हृदय रोग जैसे कई रोगों में जिम्मेदार है। एमएमपी हाल ही में ध्यान का केंद्र रहा है क्योंकि चिकित्सीय विकसित करने के लक्ष्य हैं जो एमएमपी ओवरएक्सप्रेशन से संबंधित बीमारियों का इलाज कर सकते हैं।

समाधान में एमएमपी तंत्र का अध्ययन करने के लिए, सक्रिय, घुलनशील एमएमपी के उत्पादन के लिए अधिक सरल और मजबूत पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधियों की आवश्यकता होती है। हालांकि, अधिकांश एमएमपी के उत्प्रेरक डोमेन को पोस्टट्रांसलेशनल मशीनरी की कमी के कारण घुलनशील रूप में एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) में व्यक्त नहीं किया जा सकता है, जबकि स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर महंगी होती है और कम पैदावार होती है। एमएमपी समावेशन निकायों को व्यापक शुद्धिकरण और रीफोल्डिंग की थकाऊ और श्रमसाध्य प्रक्रिया से गुजरना चाहिए, जो देशी संरचना में एमएमपी की उपज को काफी कम करता है। यह पेपर Rosetta2 (DE3) pLysS (इसके बाद R2DP के रूप में संदर्भित) कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ताकि मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस -3 उत्प्रेरक डोमेन (एमएमपी-3cd) का उत्पादन किया जा सके, जिसमें एक एन-टर्मिनल हिज़-टैग होता है जिसके बाद प्रो-डोमेन (Hisx6-pro-MMP-3cd) आत्मीयता शुद्धिकरण में उपयोग के लिए होता है। R2DP कोशिकाएं एक chloramphenicol-प्रतिरोधी प्लास्मिड के माध्यम से यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाती हैं जिसमें कोडोन आमतौर पर जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणालियों में दुर्लभ होते हैं। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, BL21 (DE3) के लिए पसंद की पारंपरिक सेल लाइन की तुलना में, इस नए तनाव का उपयोग करके शुद्धिकरण ने शुद्ध Hisx6-pro-MMP-3cd की उपज में सुधार किया। सक्रियण और desalting पर, समर्थक डोमेन एन-टर्मिनल हिस-टैग के साथ cleaved है, विट्रो अनुप्रयोगों में अनगिनत में तत्काल उपयोग के लिए सक्रिय MMP-3cd प्रदान करते हैं। इस विधि को महंगे उपकरण या जटिल संलयन प्रोटीन की आवश्यकता नहीं होती है और बैक्टीरिया में पुनः संयोजक मानव एमएमपी के तेजी से उत्पादन का वर्णन करता है।

Introduction

अधिकांश जटिल यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद विस्तृत पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों से गुजरते हैं, जिसके लिए अत्यधिक सहायता प्राप्त प्रोटीन तह और सह-कारकों को कार्यात्मक होने की आवश्यकता होती है। एक जीवाणु मेजबान में घुलनशील मानव प्रोटीन की बड़ी मात्रा का उत्पादन उच्च लागत और मजबूत अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधियों की कमी के कारण एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है, यहां तक कि छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए भी 2,3। एमएमपी, बड़े आणविक भार के साथ मानव एंडोपेप्टिडेस, आमतौर पर अघुलनशील समावेशन निकायों के रूप में व्यक्त किए जाते हैं जब ई कोलाई में व्यक्त किया जाता है। घुलनशील मानव एमएमपी का निष्कर्षण अक्सर एक श्रमसाध्य, समय लेने वाली घुलनशीलता और रीफोल्डिंग प्रक्रिया की ओर जाता है4।

एमएमपी दोनों शारीरिक और रोगजनक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मानव एमएमपी 23 जस्ता एंडोपेप्टिडेस का एक परिवार है, जिसे संरचना और सब्सट्रेट विशिष्टता द्वारा वर्गीकृत किया गया है, और अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक डोमेन 5, 6 के बावजूद अलग-अलग व्यक्त किया गया है। एमएमपी को निष्क्रिय zymogens के रूप में स्रावित किया जाता है, पोस्टट्रांसलेशनल सक्रियण और उनके अंतर्जात अवरोधकों के माध्यम से विनियमित किया जाता है, मेटालोप्रोटीनेस (टीआईएमपी) के ऊतक अवरोधक 7,8,9,10। हालांकि शुरू में ईसीएम टर्नओवर में उनकी भूमिका के लिए मान्यता प्राप्त है, एमएमपी को विकास, मॉर्फोजेनेसिस, ऊतक की मरम्मत और रीमॉडलिंग 8 में भी फंसाया गया है। एमएमपी के विकृतिकरण को विशेष रूप से अन्य बीमारियों के बीच न्यूरोडीजेनेरेटिव, कार्डियोवैस्कुलर और फाइब्रोटिक बीमारियों के साथ कैंसर से जोड़ा गया है5,7।

मजबूत बड़े पैमाने पर एमएमपी उत्पादन विधियों का विकास जैव रासायनिक और सेल-आधारित assays के माध्यम से एमएमपी तंत्र के भविष्य के अध्ययन की सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न एमएमपी को पहले बैक्टीरिया 11 में व्यक्त किया गया है, जिसमें एचएक्स 6-टैग किए गए एमएमपी शामिल हैं, एमएमपी गतिविधि 12,13,14,15 को बदलने के बिना। हालांकि, इन विधियों में थकाऊ, लंबे चरण शामिल हैं जिन्हें दोहराना मुश्किल हो सकता है।

स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग कई अलग-अलग मानव प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए भी किया जा सकता है, जबकि उचित पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को सुनिश्चित किया जा सकता है। यद्यपि स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली उचित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ पुनः संयोजक मानव प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक आदर्श विकल्प है, इस विधि के मुख्य नुकसान प्रारंभिक कम पैदावार, महंगे विकास मीडिया और अभिकर्मक, स्थिर अभिव्यक्ति लाइनों तक पहुंचने के लिए लंबी समयसीमा, और कवक या बैक्टीरिया जैसे अन्य प्रजातियों के साथ संदूषण का जोखिम 2,11 हैं। . इसके अलावा, स्तनधारी सेल लाइनों में एमएमपी उत्पादन संबंधित सेलुलर प्रोटीन जैसे कि टीआईएमपी या फाइब्रोनेक्टिन 11 से अशुद्धियों को उत्पन्न करता है। स्तनधारी कोशिकाओं में देखे गए धीमी गति से सेल विकास के विपरीत, जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली सरल मीडिया और विकास आवश्यकताओं के साथ-साथ एक छोटी अवधि में बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन प्रदान करती है। हालांकि, बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों में अन्य संबद्ध सेलुलर प्रोटीन (यानी, टीआईएमपी) की कमी के कारण, उच्च सांद्रता में सक्रिय एमएमपी ऑटोप्रोटियोलिसिस के माध्यम से गिरावट के अधीन हैं, जिसके परिणामस्वरूप खराब एमएमपी उपज 17 होती है।

यह पेपर बैक्टीरियल अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और पुनः संयोजक Hisx6-pro-MMP-3cd के सक्रियण के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है, जो ई कोलाई को अभिव्यक्ति होस्ट के रूप में उपयोग करता है क्योंकि इसकी सामर्थ्य, सादगी और MMPs2,3,18 की उच्च पैदावार का उत्पादन करने में सफलता। चूंकि ई कोलाई में पुनः संयोजक एमएमपी और अन्य जटिल प्रोटीन के लिए आवश्यक प्रोटीन तह मशीनरी और पोस्टट्रांसलेशनल प्रसंस्करण की कमी है, इसलिए इन सीमाओं को दूर करने के लिए कई ई कोलाई उपभेदों को इंजीनियर किया गया है, जिससे ई कोलाई पुनः संयोजक मानव एमएमपी -3सीडी, 19,20 की अभिव्यक्ति के लिए एक अधिक उपयुक्त मेजबान बन गया है। . उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला R2DP तनाव एक क्लोरैम्फेनिकोल-प्रतिरोधी प्लास्मिड की आपूर्ति करके यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति को बढ़ाता है जिसमें ई कोलाई में शायद ही कभी उपयोग किए जाने वाले कोडोन होते हैं।

जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, R2DP कोशिकाओं में pET-3a वेक्टर (चित्रा 1) से अपेक्षाकृत शुद्ध समावेशन निकायों के overexpression के बाद, Hisx6-pro-MMP-3 उत्प्रेरक डोमेन (MMP-3cd) प्रोटीन निकाले जाते हैं और विकृत 4 होते हैं। Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 को आत्मीयता टैग क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। refolding और डायलिसिस पर, प्रो-MMP-3cd (zymogen) को 4-aminophenylmercuric एसीटेट (APMA) द्वारा सक्रिय किया गया था, और SDS-PAGE विश्लेषण का उपयोग पैदावार का मूल्यांकन करने और आगे शुद्धिकरण की आवश्यकता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है5,21। यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में घुलनशील MMP-3cd की अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और सक्रियण का वर्णन करता है। हालांकि, इसका उपयोग समान अभिव्यक्ति के साथ अन्य एमएमपी और मानव प्रोटीज की अभिव्यक्ति के लिए एक गाइड के रूप में भी किया जा सकता है, और सक्रियण तंत्र (चित्रा 2)। एमएमपी -3सीडी के अलावा अन्य प्रोटीनों के लिए, पाठक को इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले अपने लक्ष्य प्रोटीन के लिए इष्टतम बफर रचनाओं और विधियों को निर्धारित करने की सलाह दी जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd प्लास्मिड का प्लास्मिड मानचित्र। पीईटी -3 ए वेक्टर में एक एम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन शामिल है। एक N-टर्मिनल Hisx6-टैग अनुक्रम pET-3a-आधारित वेक्टर में क्लोन किया जाता है, जिसमें प्रो-MMP-3cd भी शामिल है, ताकि BamHI और NdeI प्रतिबंध साइटों के बीच T7 प्रमोटर के नियंत्रण में pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd निर्माण प्राप्त किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रो-एमएमपी-3सीडी, शुद्धिकरण, रीफोल्डिंग और सक्रियण की बैक्टीरियल अभिव्यक्ति। 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd प्लास्मिड को BL21 (DE3) या R2DP कोशिकाओं में बदल दिया गया था। 1.2: प्रो-एमएमपी-3सीडी प्रोटीन अभिव्यक्ति आईपीटीजी का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। 1.3: रासायनिक lysis और sonication Hisx6-समर्थक-MMP-3cd प्रोटीन है कि मुख्य रूप से अघुलनशील हैं और शामिल निकायों में पाया जाता है निकालने के लिए उपयोग किया जाता है। यूरिया का उपयोग शामिल निकायों से प्रोटीन को विच्छेदित और घुलनशील बनाने के लिए किया गया था। 2.1. विकृत Hisx6-प्रो-MMP-3cd प्रोटीन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण के माध्यम से शुद्ध किया गया था. 3. eluted Hisx6-समर्थक-MMP-3cd धीरे-धीरे बफर से यूरिया के क्रमिक हटाने के माध्यम से डायलिसिस के दौरान refolded था. 4. अंत में, refolded MMP-3cd प्रोटीन एन टर्मिनल प्रो-पेप्टाइड डोमेन को हटाने से APMA का उपयोग कर सक्रिय किया गया था। एपीएमए को बाद में डिसाल्टिंग के माध्यम से समाधान से हटा दिया जाता है। संख्याएँ इन चरणों का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल अनुभागों के अनुरूप हैं. संक्षेप: MMP-3cd = मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन; APMA = 4-aminophenylmercuric एसीटेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. एमएमपी अभिव्यक्ति

  1. क्लोनिंग और PET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd का R2DP कोशिकाओं में रूपांतरण
    1. डाइजेस्ट बफर में NdeI और BamHI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ pET-3a प्लास्मिड ( सामग्री की तालिका देखें) को पचाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। 40 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में, डाइजेस्ट बफर के 4 μL, 100 ng / μL प्लास्मिड के 33 μL, और प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 μL जोड़ें और प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा होने तक ~ 2 h के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    2. एक N-टर्मिनल His-टैग सम्मिलित करने के लिए MMP-3cd अनुक्रम पर एक PCR प्रतिक्रिया निष्पादित करें। PCR मिश्रण के 25 μL का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें), 10 μM प्राइमरों के 2.5 μL (पूरक चित्रा S1), और 100 ng / μL सम्मिलित अनुक्रम के 1.25 μL। 50 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में बाँझ पानी जोड़ें।
    3. एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद और पचा वेक्टर चलाएँ। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल रिकवरी किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके जेल बैंड को शुद्ध करें।
    4. डीएनए असेंबली मिक्स का उपयोग करके NdeI और BamHI प्रतिबंध साइटों के बीच पचे हुए वेक्टर में प्रवर्धित PCR उत्पाद क्लोन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 15 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए सम्मिलित करें और कट वेक्टर की आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए ऑनलाइन उपकरणों का उपयोग करें।
    5. पिघलने तक बर्फ पर उच्च परिवर्तन दक्षता कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) के एक 50 μL ऐलीकोट को पिघलाएं। Prewarm SOC विकास माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) 37 डिग्री सेल्सियस और एलबी-एम्पिसिलिन (एलबी Amp) प्लेटों के लिए ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. 50 μL ऐलीकोट के लिए pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd असेंबली प्रतिक्रिया का 1-2 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    7. गर्मी-30 s के लिए 42 °C पर incubating द्वारा कोशिकाओं सदमे. 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    8. प्रत्येक ट्रांसफॉर्मेंट मिश्रण में एसओसी विकास माध्यम के 950 μL जोड़ें। 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हिलाएं।
    9. LB Amp प्लेटों पर transformants की प्लेट 100 μL और 37 °C पर रात भर इनक्यूबेट.
    10. LB Amp माध्यम के 10 mL में प्रत्येक पृथक कॉलोनी को टीका लगाएं। 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाएं।
    11. Miniprep किट के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल प्रति प्लास्मिड डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)। T7 आगे और रिवर्स प्राइमर (पूरक चित्रा S1) का उपयोग कर निर्माण के अनुक्रम की पुष्टि करें।
      नोट: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd निर्माण डीएनए को -20 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है। तैयार होने पर, R2DP कक्षों में रूपांतरण के साथ आगे बढ़ें।
    12. 2-5 मिनट के लिए बर्फ पर R2DP कोशिकाओं के एक 20 μL ऐलीकोट ( सामग्री की तालिका देखें) को पिघलाएं। Prewarm SOC वृद्धि कमरे के तापमान और LB Amp CamR प्लेटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें).
    13. 50 μL ऐलीकोट में 100 ng/μL अनुक्रम-पुष्टि किए गए pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd के 1 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे से हिलाएं और ट्यूब को बर्फ में वापस कर दें।
    14. ट्यूब को 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    15. हीट-शॉक कोशिकाओं को ठीक 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके। हिलाओ मत।
    16. कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    17. परिवर्तनकारी मिश्रण में कमरे के तापमान एसओसी माध्यम के 80 μL जोड़ें। 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हिलाएं।
    18. LB Amp CamR प्लेटों पर transformants प्लेट प्लेटें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट.
  2. वृद्धि और प्रेरण
    1. R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd ट्रांसफॉर्मेंट के एक एकल, पृथक कॉलोनी को LB Amp CamR मीडिया के 10 mL में LB Amp CamR प्लेट से 37 °C पर संक्रमित करें। रात भर में 250 आरपीएम पर हिलाएं (~ 16 ज)। प्रत्येक संस्कृति से एलीकोट सहेजें और यदि वांछित हो तो 40% (v / v) ग्लिसरॉल ( सामग्री की तालिका देखें) स्टॉक तैयार करें।
    2. प्रति रात भर की संस्कृति, 0.05-0.1 के 600 एनएम (OD600) पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए एलबी Amp CamR माध्यम के 500 मिलीलीटर युक्त एक 1 एल फ्लास्क को टीका लगाएं।
      नोट:: यह लॉगरिदमिक वृद्धि के लिए कक्षों को वापस करना चाहिए।
    3. कई समय बिंदुओं पर OD600 को मापें, आमतौर पर 3-4 घंटे के लिए, जब तक कि यह 0.4 और 0.6 के बीच न हो जाए।
    4. प्रेरण से पहले, एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में संस्कृति का एक अंश एलीकोट करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित अंश लेबल करें। जेल विश्लेषण के लिए इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि कोई SDS-PAGE जेल नहीं चल रहा है, तो इस चरण को छोड़ दें और चरण 1.2.5 पर आगे बढ़ें।
    5. संस्कृतियों को 1 M isopropyl-π-D-thiogalactopyranoside (IPTG) स्टॉक का उपयोग करके 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रेरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक अतिरिक्त 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में इनक्यूबेट करना जारी रखें।
      नोट:: अभिव्यक्ति के दौरान, पाठक प्रेरण और IPTG एकाग्रता के समय इष्टतम OD600 निर्धारित करना चाहिए। यदि शुद्धि करण के बाद उपज काफी हद तक गिर जाती है, तो शुद्धिकरण बफर में इमिडाज़ोल एकाग्रता को समायोजन की आवश्यकता हो सकती है, या सेल गोली को आगे सोनिकेट करने की आवश्यकता हो सकती है।
    6. संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करने से पहले, संस्कृति के एक अंश को दूसरे 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में एलीकोट करें और इसे प्रेरित अंश लेबल करें। जेल विश्लेषण के लिए इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि कोई SDS-PAGE जेल नहीं चल रहा है, तो इस चरण को छोड़ दें और चरण 1.2.7 पर आगे बढ़ें।
    7. 250 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतलों में सेल संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें) अधिकतम गति पर और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    8. चरण 1.2.7 को दोहराएं जब तक कि संस्कृतियों को पूरी तरह से गोली नहीं मार दी जाती है।
      नोट: रोकें: सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है और आगे के प्रसंस्करण के लिए बाद में पिघलाया जा सकता है। अन्यथा, इस चरण को छोड़ दें और चरण 1.3.1 पर आगे बढ़ें।
  3. समावेशन शरीर निष्कर्षण और घुलनशीलता
    नोट: ताजा 10 एम यूरिया तैयार करें, अधिमानतः पहले से एक दिन से पहले नहीं, पूरी तरह से भंग होने तक अच्छी तरह से सरगर्मी करें। यूरिया को गर्म या आटोक्लेव न करें; इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    1. lysis बफर में गोली (चरण 1.2.8 से) को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। गोली के प्रति ग्राम, lysis बफर के 3 mL जोड़ें और भंवर या pipetting द्वारा resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाएं।
    2. 1.25 मिलीलीटर 10% (डब्ल्यू / वी) सोडियम डीऑक्सीकोलेट ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति 1 एल संस्कृति जोड़ें। 150 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं।
    3. DNase I के 10 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) संस्कृति के प्रति 1 एल। 150 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं।
    4. 13,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    5. जेल विश्लेषण के लिए Lysed MMP का एक अंश अलग सेट करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 1.3.6 पर आगे बढ़ें।
      नोट: centrifugation के बाद, गोली stringy हो सकता है और compactly पैक नहीं है, यह supernatant को त्यागने के लिए जोखिम भरा बनाने. यदि यह मामला है, तो चरण 1.3.6 को छोड़ दें और चरण 1.3.7 पर आगे बढ़ें।
    6. centrifuged नमूनों से supernatant छोड़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और बाद में पिघलाया जा सकता है। अन्यथा, इस चरण को छोड़ दें और चरण 1.3.7 पर आगे बढ़ें।
    7. शामिल शरीर बफर के 100 mL / L संस्कृति में गोली resuspend ( सामग्री की तालिका देखें) ऊपर और नीचे pipetting द्वारा.
    8. sonication के दौरान, overheating को रोकने के लिए बर्फ पर नमूने रखें। 15 s, आउटपुट 5, और 50% पल्स के 6 चक्रों के लिए Sonicate प्रत्येक नमूना। चक्रों के बीच ठंडा करने के लिए 15 s आराम की अवधि की अनुमति दें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो नमूनों को आगे सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 13,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    9. जेल विश्लेषण के लिए Sonicated MMP का एक अंश अलग सेट करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 1.3.11 पर आगे बढ़ें।
    10. गोली की जाँच करें। यदि स्ट्रिंगी, चरण 1.3.8-1.3.10 दोहराएँ। यदि गोली कॉम्पैक्ट है, तो supernatant को छोड़ दें और चरण 1.3.12 पर आगे बढ़ें।
      नोट:: शामिल करें शरीर बफ़र में Sonication lysed सेल मलबे से अधिक प्रोटीन को पुनर्प्राप्त करने के लिए दोहराया जा सकता है। हालांकि, बहुत अधिक sonication कर्तन, जो एमएमपी उपज को नुकसान पहुंचाता है कारण हो सकता है. प्रोटोकॉल को इस स्तर पर रोका जा सकता है, और सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और बाद में पिघलाया जा सकता है।
    11. सोल्यूबिलाइजेशन बफर के 5 मिलीलीटर में 1 एल संस्कृति से प्रत्येक छर्रे को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) पिपेटिंग द्वारा। प्रोटीन को घुलनशील बनाने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. जेल विश्लेषण के लिए Solubilized MMP का एक अंश अलग सेट करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 1.3.14 पर आगे बढ़ें।
    13. 13,000 × g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। SUPERNATANT को न छोड़ें।
    14. यदि एक गोली सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद बनती है / बनी रहती है, तो supernatant को एक अलग 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डालें। सोल्यूबिलाइजेशन बफर (संस्कृति के प्रति 1 एल) के एक और 5 मिलीलीटर में गोली को ऊपर और नीचे पिपेट करके फिर से निलंबित कर दिया।
    15. 13,000 × g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज SUPERNATANT को त्यागें नहीं।
    16. 1.3.13 और 1.3.14 चरणों को दोहराएं जब तक कि सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कोई गोली रूपों के लिए थोड़ा सा नहीं या केवल ग्रे अवक्षेप रहता है। Supernatants पूल. छोड़ें या अतिरिक्त sonication के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली की दुकान.

2. एमएमपी शुद्धिकरण और refolding

  1. His-tag (HT) आत्मीयता शुद्धिकरण
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, अच्छी तरह से मिश्रित नी-एनटीए राल के साथ एक गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह स्तंभ ( सामग्री की तालिका देखें) भरें ( सामग्री की तालिका देखें)। राल को व्यवस्थित करने और भंडारण बफर से अलग होने की अनुमति दें ताकि दो परतों के बीच एक अलग रेखा बन सके।
      नोट: राल को सूखने की अनुमति कभी न दें, क्योंकि हवा राल में प्रवेश करेगी और प्रोटीन उपज को नुकसान पहुंचाएगी। उपयोग के बीच में, अनुभाग 2.2 में वर्णित राल पुनर्जनन प्रक्रिया निष्पादित करें।
    2. संग्रहण बफ़र को नाली करने की अनुमति दें. एचटी संतुलन बफर के दो राल-बिस्तर वॉल्यूम के साथ कॉलम भरें।
    3. एचटी संतुलन बफ़र निकालें और छोड़ें। जैसा कि स्तंभ draining है, 1 मिनट के लिए 13,000 × जी पर प्रोटीन निकालने centrifuge और एक 0.22 μm फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर-sterilize ( सामग्री की तालिका देखें).
    4. एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब HT Flowthrough लेबल के लिए अपशिष्ट कंटेनर स्वैप. तैयार प्रोटीन निकालने को स्तंभ में जोड़ें.
    5. बाइंडिंग को अधिकतम करने के लिए flowthrough पुन: लागू करें।
    6. जेल विश्लेषण के लिए Flowthrough Fraction का एक अंश अलग सेट करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 2.1.7 पर आगे बढ़ें।
    7. तुरंत एचटी वॉश बफर के 15 मिलीलीटर के साथ राल को धोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। 15 मिली शंक्वाकार ट्यूबों में flowthrough ले लीजिए ( सामग्री की तालिका देखें) एचटी वॉश लेबल.
      नोट: 280 एनएम (A280) पर अवशोषण मूल्यों को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से प्राप्त किया गया था और प्रोटीन सांद्रता का अनुमान लगाने के लिए आणविक वजन और विलुप्त होने के गुणांक, ε के साथ उपयोग किया गया था। विकृत Hisx6-pro-MMP-3cd के लिए, आणविक भार 29.86 kDa है, और ε 34.38 M-1 सेमी-1 है।
    8. एचटी वॉश बफ़र के खिलाफ रिक्त करना, A280 को मापना और रिकॉर्ड करना। अतिरिक्त धोने के अंशों के साथ चरण 2.1.7 और 2.1.8 दोहराएँ। एक बार जब A280 बेसलाइन और अशुद्धियों को कम कर दिया गया है, तो चरण 2.1.9 पर आगे बढ़ें।
    9. जेल विश्लेषण के लिए वॉश अंश का एक अंश अलग सेट करें। एकाधिक धोने के अंशों के लिए दोहराएँ। भिन्नों को -80 °C पर संग्रहीत करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 2.1.10 पर आगे बढ़ें।
    10. तुरंत एचटी क्षालन बफर के 5 मिलीलीटर जोड़कर अपने टैग किए गए प्रोटीन को दूर करें (सामग्री की तालिका देखें)। 0.5-1 mL अंशों के रूप में HT क्षालन लेबल microfuge ट्यूबों में के रूप में flowthrough ले लीजिए.
    11. जेल विश्लेषण के लिए क्षालन अंश का एक अंश अलग सेट करें। एकाधिक क्षालन अंशों के लिए दोहराएँ। भिन्नों को -80 °C पर संग्रहीत करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 2.1.12 पर आगे बढ़ें।
    12. यदि A280 >0.3 mg/mL है, तो HT संतुलन बफर के साथ अंश को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: डायलिसिस के दौरान वर्षा को रोकने के लिए 0.3 मिलीग्राम / एमएल या उससे कम के ए 280 को पतला किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और पूल किए गए अंशों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और बाद में पिघलाया जा सकता है। अन्यथा, इस चरण को छोड़ दें और चरण 2.2.1 पर आगे बढ़ें।
  2. राल पुनर्जनन
    1. एचटी पुनर्जनन बफर के दस राल-बिस्तर की मात्रा के साथ राल को धोएं ( सामग्री की तालिका देखें) और बाँझ पानी के दस राल-बिस्तर की मात्रा।
    2. पानी में 20% (v / v) इथेनॉल में 50% घोल के रूप में राल को स्टोर करें।

3. प्रोटीन refolding

नोट: छोटे वॉल्यूम के लिए, डायलिसिस कैसेट का उपयोग नमूना हानि के कम जोखिम पर किया जा सकता है। डायलिसिस टयूबिंग की आवश्यकता होती है यदि बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. अपोहन
    नोट: डायलिसिस के लिए इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता ~ 0.3 मिलीग्राम / एमएल है। यदि डायलिसिस के दौरान महत्वपूर्ण वर्षा होती है, तो चरणबद्ध डायलिसिस विधि का उपयोग करके प्रत्येक डायलिसिस के बीच यूरिया एकाग्रता ढाल को कम करें और अधिक मध्यवर्ती चरणों को जोड़ें (उदाहरण के लिए, 6 एम से 5 एम तक, और फिर 5 एम से 4 एम, 5 एम चरण को छोड़ने के बजाय)। चूंकि फ्रीज-पिघलने वाले चक्र सेलुलर और प्रोटीन संरचना को नुकसान पहुंचाते हैं, इसलिए प्रोटोकॉल में ठहराव को कम करना महत्वपूर्ण है।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, इल्यूशन अंश नमूनों की मात्रा के अनुसार डायलिसिस ट्यूबिंग की उचित मात्रा का उपयोग करें।
    2. डायलिसिस बफर 1 के 1 एल में डायलिसिस टयूबिंग में एल्यूटेड एमएमपी अंशों को डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। टयूबिंग और इसकी सामग्री को चुंबकीय हलचल पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे से कम नहीं के लिए हिलाएं।
    3. डायलिसिस बफर 2 के 1 एल में स्थानांतरण ( सामग्री की तालिका देखें)। टयूबिंग और इसकी सामग्री को चुंबकीय हलचल पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे से कम नहीं के लिए हिलाएं।
    4. डायलिसिस बफर 3 के 1 एल में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। टयूबिंग और इसकी सामग्री को चुंबकीय हलचल पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे से कम नहीं के लिए हिलाएं।
    5. नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में नमूने को स्थानांतरित करें और उन्हें डायलिज़्ड एमएमपी के रूप में लेबल करें।
    6. किसी भी अवक्षेप के लिए ट्यूब की जांच करें। यदि अवक्षेप का गठन किया गया है, तो नमूने को 13,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में supernatant स्थानांतरण और उन्हें Refolded एमएमपी के रूप में लेबल.
    8. जेल विश्लेषण के लिए एक अंश को अलग रखें और इसे रीफोल्डेड एमएमपी के रूप में लेबल करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 3.1.9 पर आगे बढ़ें।
      नोट: यदि पैदावार कम हैं, तो अवक्षेप को एचटी संतुलन बफर में भंग किया जा सकता है और डायलिसिस टयूबिंग के साथ दोहराए गए अनुभाग 3.1 में चरण। यदि जेल विश्लेषण नहीं किया जाना है या यदि प्रोटोकॉल को यहां रोका जाना चाहिए, तो नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और बाद में उन्हें पिघलाएं। यदि पैदावार वांछित श्रेणी में हैं, तो चरण 3.2.1 पर आगे बढ़ें।
  2. पुन: संकेंद्रण
    नोट:: refolded और विकृत Hisx6-प्रो-MMP-3cd के लिए विलुप्त होने के गुणांक समान होने की उम्मीद कर रहे हैं; इसलिए, A280 गणना प्रभावित नहीं होते हैं।
    1. नमूने को 0.5 मिलीग्राम / एमएल तक फिर से केंद्रित करें। नमूने को 15 मिलीलीटर तक केंद्रित करने के लिए एक 400 एमएल हलचल वाले सेल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फोमिंग को रोकने के लिए, यदि आवश्यक हो तो आगे ध्यान केंद्रित करने के लिए 50 मिलीलीटर पुनर्केंद्रण ट्यूब का उपयोग करें।
      नोट:: यदि एक अवक्षेप प्रपत्र, यह छर्रे और एचटी संतुलन बफर में भंग किया जा सकता है। उसके बाद, अनुभाग 3.1 और चरण 3.2.1 दोहराएँ। अन्यथा, चरण 3.2.2 करने के लिए जारी रखें।
    2. जेल विश्लेषण के लिए एक अंश को अलग रखें और इसे केंद्रित एमएमपी के रूप में लेबल करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं और बाद में पिघला हुआ है।

4. सक्रियण

  1. 4-Aminophenylmercuric एसीटेट (APMA) सक्रियण
    नोट: APMA अत्यधिक विषाक्त है। सक्रियण से पहले 20 mM APMA का एक ताजा स्टॉक समाधान बनाएं, और हमेशा APMA का उपयोग करते समय एक धुएं के हुड के तहत काम करें। APMA अपशिष्ट को इसके कंटेनर में छोड़ दें.
    1. एमएमपी (1 मिलीग्राम / एमएल) के प्रति 1 एमएल एलीकोट, 1 एमएम की अंतिम एपीएएमए एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 20 एमएम एपीएमए के 50 μL ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. यदि एक अवक्षेप बनता है, तो इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज करें। एक 1.5 mL microfuge ट्यूब सक्रिय एमएमपी लेबल में supernatant स्टोर. APMA अपशिष्ट के लिए चिह्नित कंटेनर में अवक्षेप को छोड़ दें।
    3. जेल विश्लेषण के लिए एक अंश को अलग रखें और इसे सक्रिय एमएमपी लेबल करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं और बाद में पिघला हुआ है। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो चरण 4.2.1 पर आगे बढ़ें। सक्रियण के बाद, MMP-3cd के आणविक भार और विलुप्त होने का गुणांक क्रमशः 19.40 kDa और 28.42 M-1 सेमी-1 है।
  2. डीसाल्टिंग
    1. एक 2 mL desalting स्तंभ ( सामग्री की तालिका देखें), निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, के साथ सक्रिय MMP-3cd नमूने से APMA निकालें।
    2. जेल विश्लेषण के लिए एक अंश को अलग रखें और इसे Desalted MMP लेबल करें। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि जेल विश्लेषण नहीं कर रहा है, तो शेष नमूनों के साथ अनुभाग 4.3 पर आगे बढ़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं और बाद में पिघला हुआ है।
  3. SDS-PAGE जैल चला रहा है
    1. एसडीएस-पेज जैल पर सभी प्रोटीन अंशों को चलाएं: संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित अंश, प्रेरित अंश, लाइसेड एमएमपी, सोनिकेटेड एमएमपी, घुलनशील एमएमपी, फ्लोथ्रू अंश, वॉश अंश, क्षालन अंश, रीफोल्डेड एमएमपी, केंद्रित एमएमपी, सक्रिय एमएमपी, और डिसाल्टेड एमएमपी।
  4. एमएमपी-3 का दीर्घकालिक भंडारण
    1. desalted MMP-3cd नमूनों के लिए 0.05% (v / v) nonionic surfactant ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

एसडीएस-पेज पर नमूने चलाते समय, क्योंकि प्रोटीन को अघुलनशील समावेशन निकायों के रूप में व्यक्त किया जाता है, लिसेटेड और सोनिकेटेड अंशों में कोई हिसक्स 6-प्रो-एमएमपी-3सीडी अर्क नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्रोटीन को अभी तक यूरिया में पुन: स्थिर नहीं किया गया है। चित्रा 3 BL21 (DE3) कोशिकाओं और R2DP कोशिकाओं से Hisx6-pro-MMP-3cd के अपने-टैग शुद्धिकरण क्षालन अंशों की तुलना करता है। डायलिसिस से पहले BL21 (DE3) और R2DP कोशिकाओं दोनों के लिए क्षालन अंशों को अलग से पूल किया गया था। प्रत्येक चरण से अंशों को प्रोटीन के डीसाल्ट किए जाने के बाद चलाया गया था (चित्रा 4)। सभी Hisx6-pro-MMP-3cd नमूने लगभग 30 kDa पर एक बैंड प्रदर्शित करते हैं, और सक्रिय MMP-3cd लगभग 20 kDa पर एक बैंड प्रदर्शित करता है, जो उसके-टैग और प्रो-डोमेन (चित्रा 4 और पूरक चित्रा S1) को हटाने पर होता है।

ई कोलाई संस्कृति के मिलीग्राम / एल में प्रोटीन की कुल उपज BL21 (DE3) और R2DP संस्कृतियों (तालिका 1) के शुद्धिकरण और डीसॉल्टिंग के बाद निर्धारित की गई थी। R2DP कोशिकाओं का उपयोग करने से एमएमपी अभिव्यक्ति का काफी उच्च स्तर प्राप्त होता है। जबकि नियमित रूप से BL21 (DE3) कोशिकाओं ने केवल 3.5 मिलीग्राम शुद्ध Hisx6-pro-MMP-3cd प्रति लीटर संस्कृति उत्पन्न की, R2DP कोशिकाओं ने 45 मिलीग्राम / एल संस्कृति का उत्पादन किया। इसी तरह, कार्यात्मक, desalted MMP-3cd की पैदावार क्रमशः BL21 (DE3) और R2DP कोशिकाओं के लिए 0.13 mg/ L संस्कृति से 6.2 mg/ L संस्कृति तक बढ़ गई। मानव प्रो-एमएमपी -3सीडी मानक BL21 (DE3) तनाव की सेलुलर मशीनरी को अभिभूत करता है क्योंकि इसके आकार (लगभग 30 kDa) और विस्तृत पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों की आवश्यकता होती है जो यूकेरियोट्स के लिए अनन्य हैं। R2DP उपभेदों BL21 (DE3) डेरिवेटिव हैं, जो यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। R2DP तनाव AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC, और CGG के लिए tRNAs वहन करता है, जो शायद ही कभी E.coli में उपयोग किया जाता है लेकिन प्रो-MMP-3cd डीएनए अनुक्रम में प्रचुर मात्रा में होता है। यह संभावित रूप से R2DP कोशिकाओं में देखे गए प्रोटीन अभिव्यक्ति के बढ़े हुए स्तर में एक महत्वपूर्ण कारक है।

Figure 3
चित्रा 3: SDS-पृष्ठ जेल विश्लेषण Hisx6-pro-MMP-3cd अभिव्यक्ति में BL21 (DE3) और R2DP कोशिकाओं में अभिव्यक्ति. (ए) BL21 (DE3) कोशिकाओं में Hisx6-pro-MMP-3cd के पहले आठ क्षालन अंश। (बी) R2DP कोशिकाओं में Hisx6-pro-MMP-3cd के पहले आठ क्षालन अंश। यूरिया में एमएमपी समावेशन निकायों के निष्कर्षण और घुलनशीलता के बाद, Hisx6-pro-MMP-3cd नमूनों को बैच-गुरुत्वाकर्षण प्रवाह का उपयोग करके Ni-NTA क्रोमैटोग्राफी कॉलम के माध्यम से शुद्ध किया गया था। जैल को केवल क्षालन अंशों को दिखाने के लिए छोटा किया जाता है। प्रारंभ में, प्रोटीन की उच्च सांद्रता के कारण, अंश 1-5 1 एमएल होते हैं। बाद के अंश (6-8) प्रत्येक 5 और 8 मिलीलीटर के बीच होते हैं। Hisx6-pro-MMP-3cd बैंड ~ 30 kDa पर मनाया जाता है। संक्षेप: MMP-3cd = मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन; SDS-PAGE = सोडियम dodecylsulfate polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन; Ni-NTA = निकल-नाइट्रिलोट्रायएसिटिक एसिड; FT = flowthrough कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमएमपी-3सीडी के सक्रियण पर उनके-टैग और प्रो-डोमेन के प्रोटियोलिटिक दरार। प्रेरित, refolded, केंद्रित, सक्रिय, और R2DP कोशिकाओं में MMP-3cd के desalted अंश दिखाए जाते हैं। डायलिसिस के बाद, Hisx6-pro-MMP-3cd APMA का उपयोग करके केंद्रित और सक्रिय होता है। सक्रियण पर, सक्रिय एमएमपी -3सीडी बैंड का आणविक वजन लगभग 20 केडीए है, जैसा कि उनके टैग किए गए जाइमोजेन के विपरीत है, जो ~ 30 केडीए पर रहता है। अशुद्धियों को सक्रियण और desalting चरणों में हटा दिया जाता है। संक्षेप: MMP-3cd = मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन; APMA = 4-aminophenylmercuric एसीटेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चरणों BL21(DE3) कक्ष R2DP कक्ष
वॉल्यूम (mL) एकाग्रता (mg/mL) उपज (मिलीग्राम / एल संस्कृति) वॉल्यूम (mL) एकाग्रता (mg/mL) उपज (मिलीग्राम / एल संस्कृति)
शोधन 23 0.30 3.5 42 2.1 45
डीसाल्टिंग 1.5 0.17 0.13 72 0.17 6.2

तालिका 1: एमएमपी -3सीडी शुद्धिकरण के चरणों में वॉल्यूम और सांद्रता की तालिका। Hisx6-pro-MMP-3cd को या तो BL21 (DE3) की संस्कृति के 2 L में या R2DP कोशिकाओं के 2 L में व्यक्त किया गया था। मात्रा, एकाग्रता, और उपज (मिलीग्राम प्रति लीटर) संस्कृति BL21 (DE3) और R2DP कोशिकाओं के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। उपज (मिलीग्राम प्रति लीटर संस्कृति) को संस्कृति की मात्रा से प्राप्त प्रोटीन (मिलीग्राम) की कुल उपज को विभाजित करके प्राप्त किया गया था, जो बीएल 21 (डीई 3) और आर 2 डीपी दोनों मामलों के लिए 2 एल था। प्रोटीन की मात्रा की पैदावार दो चरणों के लिए रिपोर्ट की जाती है: Hisx6-pro-MMP-3cd Hisx6-टैग शुद्धिकरण और सक्रिय MMP-3cd के बाद desalting के बाद।

पूरक चित्रा S1: सक्रियण से पहले और बाद में T7 प्राइमरों और MMP-3cd प्रोटीन के अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

घुलनशील, मानव, पुनः संयोजक एमएमपी का बड़े पैमाने पर उत्पादन एक चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है। स्तनधारी कोशिकाएं उच्च लागत और लंबे समय तक प्रतीक्षा समय पर कार्यात्मक एमएमपी व्यक्त कर सकती हैं, जबकि ई कोलाई तेजी से एमएमपी समावेशन निकायों की उच्च मात्रा का उत्पादन करती हैं जिन्हें शुद्ध और फिर से जोड़ा जाना चाहिए11,16। R2DP कोशिकाएं MMP समावेशन निकायों की उपज में काफी वृद्धि करती हैं, जिससे अधिक लागत प्रभावी और उत्पादक MMP रीफोल्डिंग प्रक्रिया सक्षम होती है। हालांकि, ई कोलाई में एमएमपी को मोड़ने के लिए आवश्यक पोस्टट्रांसलेशनल मशीनरी की कमी होती है, और हालांकि इंजीनियर उपभेदों में बहुत सुधार होता है अभिव्यक्ति के स्तर में सुधार होता है, केवल कुछ मध्यवर्ती को विकृत हटाने पर ठीक से मोड़ा जाता है4। नतीजतन, एमएमपी की कभी-कभार वर्षा अभी भी रीफोल्डिंग और सक्रियण के दौरान अपेक्षित है। इन परिणामों से पता चलता है कि शुद्ध Hisx6-pro-MMP-3cd उपज का एक महत्वपूर्ण हिस्सा refolding, सक्रियण, और desalting के बाद खो जाता है।

इन चरणों को एमएमपी -3सीडी और एपीएमए के परीक्षण सांद्रता के साथ अधिक डायलिसिस चरणों को जोड़कर और अधिक अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, संस्कृति के प्रति लीटर, कार्यात्मक एमएमपी -3सीडी की उपज बीएल 21 (डीई 3) कोशिकाओं की तुलना में आर 2 डीपी कोशिकाओं में 49 गुना अधिक है। इसके अतिरिक्त, शुद्ध Hisx6-pro-MMP-3cd से बरामद कार्यात्मक, desalted MMP-3cd का अनुपात BL21 (DE3) कोशिकाओं के लिए 3.7% से बढ़कर R2DP कोशिकाओं के लिए 14% हो गया। इसलिए, R2DP कोशिकाएं वर्तमान एमएमपी उत्पादन विकल्पों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करती हैं, जैसे कि स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति, संस्कृति के प्रति लीटर अधिक प्रतिस्पर्धी पैदावार की पेशकश करती हैं।

यह प्रोटोकॉल MMP-3cd के सक्रियण और refolding के साथ R2DP ई कोलाई कोशिकाओं में Hisx6-pro-MMP-3cd को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है। जैसा कि प्रोटोकॉल को पूरा करने में कई दिन लगते हैं, सावधानीपूर्वक योजना कई फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों के कारण कार्यात्मक एमएमपी के नुकसान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि R2DP कोशिकाएं इस विधि में महत्वपूर्ण सुधार हैं, इसलिए अभिव्यक्ति उपज को अनुकूलित करना सर्वोपरि है, क्योंकि बड़ी मात्रा में रीफोल्डिंग और सक्रियण के माध्यम से खो दिया जा सकता है। अभिव्यक्ति के दौरान, ऑपरेटर को प्रेरण से पहले इष्टतम OD600 और IPTG एकाग्रता निर्धारित करनी चाहिए। अपने-टैग शुद्धिकरण के बाद, यदि उपज काफी हद तक गिर जाती है, तो राल को पुनर्जीवित या प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है, या सेल पैलेट को आगे सोनिकेट करने की आवश्यकता हो सकती है।

यदि डायलिसिस के दौरान महत्वपूर्ण वर्षा होती है, तो अधिक चरणों को जोड़कर स्टेपवाइज डायलिसिस में चरणों के बीच यूरिया एकाग्रता में परिवर्तन को कम करें (उदाहरण के लिए, 6 एम से 5 एम तक, और फिर 5 एम से 4 एम, 5 एम चरण को छोड़ने के बजाय)। एक बार refolded, और विशेष रूप से सक्रियण के बाद, MMPs काफी हद तक autoproteolysis17 के माध्यम से वर्षा या गिरावट के लिए प्रवण हैं। सभी बफ़र्स के पीएच और नमक सांद्रता को अनुकूलित करने और वांछित परीक्षण किए जाने के बाद, डायलिसिस के बाद के सभी चरणों को तात्कालिकता के साथ पूरा किया जाना चाहिए।

चिकित्सीय के लिए संभावित लक्ष्यों के रूप में एमएमपी की ओर बढ़ते ध्यान को एमएमपी थेराप्यूटिक्स 9 के बंधन, निषेध और चयनात्मकता में सुधार के लिए प्रोटीन इंजीनियरिंग में तेजी से नवाचारों के साथ पूरा किया गया है। नतीजतन, एमएमपी चिकित्सीय के क्षेत्र में एक बार महत्वाकांक्षी संभावनाएं लगातार अधिक प्राप्य हो रही हैं6। घुलनशील, सक्रिय एमएमपी को पुनर्प्राप्त करने के लिए तेजी से, विश्वसनीय तरीकों की आवश्यकता निस्संदेह समय के साथ अधिक अनिवार्य हो जाएगी।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक जैक्सनविले, फ्लोरिडा में मेयो क्लिनिक में डॉ. एवेट रेडीस्की और एलेक्जेंड्रा हॉकला को स्वीकार करना चाहते हैं, जो कि Hisx6pro-MMP-3cd जीन की क्लोनिंग के लिए टेम्पलेट के रूप में pET-3a-pro-MMP-3cd प्लास्मिड प्रदान करने के लिए, और उनकी टिप्पणियां, डीएनए अनुक्रमण के लिए नेवादा विश्वविद्यालय, रेनो में नेवादा जीनोमिक्स सेंटर से डॉ पॉल हार्टले के साथ। लेखक प्रोटीन अभिव्यक्ति के हिस्से के साथ मदद करने के लिए कैसंड्रा हर्जेनेराडर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। M.R.-S. एनआईएच-P20 GM103650-COBRE एकीकृत तंत्रिका विज्ञान अनुदान और UNR आर एंड डी mICRO बीज अनुदान पुरस्कार धन्यवाद करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm sterile filter Sigma Aldrich SLGP033RS Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks Thermo Fisher Scientific S76106F n/a
1 L glass bottles Thermo Fisher Scientific 06-414-1D n/a
1.5 mL microfuge tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002 n/a
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339650 n/a
18 G, 1-in. beveled needle Amazon B07S7VBHM2 Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column Thermo Fisher Scientific 89890 Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Thermo Fisher Scientific AAA1610422 n/a
250 mL conical bottle cushions Thermo Fisher Scientific 05-538-53A Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles Thermo Fisher Scientific 05-538-53 n/a
400 mL stirred cell Sigma Aldrich UFSC40001 Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA) Sigma Aldrich A9563-5G Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe Thermo Fisher Scientific NC0829167 Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339650 Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube Sigma Aldrich UFC901024D Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-500 Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25 Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI NEB R3136S Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2) Thermo Fisher Scientific 600-30-23 The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders Thermo Fisher Scientific 50-189-7544 Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol Thermo Fisher Scientific 22-055-125GM Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips Thermo Fisher Scientific 68011 Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing Thermo Fisher Scientific 88243 Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer NEB B7204S Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes Thermo Fisher Scientific 21-200-257 Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific D107125G Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix NEB E2621S Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I NEB M0303S Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol Thermo Fisher Scientific A995-4 n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Fisher Scientific J15694-AE Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit Promega A9281 Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-500 Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column BioRad 7321010 Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
High-transformation efficiency cells NEB C2987 High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer n/a n/a 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl) Thermo Fisher Scientific A144C-212 Used to pH buffers
Imidazole Thermo Fisher Scientific AAA1022122 Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific FERR0392 A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media n/a n/a To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates n/a n/a To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth Thermo Fisher Scientific BP1426-2 Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer n/a n/a 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme MP Biomedicals 195303 Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit Promega A1330 If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI NEB R0111S Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin Thermo Fisher Scientific PI88221 Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
Nonionic surfactant Thermo Fisher Scientific PI28316 Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity.
PCR mix NEB M0492S A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid Addgene n/a The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes VWR 25384-342 Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells Novagen 714033 BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media NEB B9020S Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1 Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate Thermo Fisher Scientific PI89905 Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base Thermo Fisher Scientific BP152-1 Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific M1122980101 Detergent used for cell lysis
Urea Thermo Fisher Scientific AAJ75826A7 First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2) Thermo Fisher Scientific AAA162810E Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3

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References

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जैव रसायन अंक 181 मैट्रिक्स metaloproteinase MMP-3cd जीवाणु अभिव्यक्ति घुलनशीलता और ई कोलाई में मानव प्रोटीन के refolding अपने टैग आत्मीयता प्रोटीन शुद्धिकरण.
बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और मानव मैट्रिक्स Metaloproteinase-3 के शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर
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Bolt, A. J., Do, L. D., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M. Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (181), e63263, doi:10.3791/63263 (2022).

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