Summary
그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.
Abstract
매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs)는 세포외 매트릭스(ECM) 분해 및 리모델링에서 중심적인 역할을 하는 메친신 프로테아제 패밀리에 속하며, 여러 성장 인자 및 사이토카인과의 상호작용에 속한다. 특정 MMPs의 과발현은 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환과 같은 여러 질병에 책임이 있다. MMPs는 MMP 과발현과 상관관계가 있는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 표적으로서 최근 주목의 중심이 되고 있다.
용액 중의 MMP 메카니즘을 연구하기 위해, 활성, 가용성 MMPs의 생산을 위해 보다 용이하고 강력한 재조합 단백질 발현 및 정제 방법이 필요하다. 그러나, 대부분의 MMPs의 촉매 도메인은 번역 후 기계의 부족으로 인해 가용성 형태로 에스케리치아 콜라 이 (E. coli)에서 발현될 수 없는 반면, 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 수율이 낮다. MMP 봉입체는 광범위한 정제 및 재폴딩의 지루하고 힘든 과정을 거쳐야하며, 천연 입체 형태에서 MMP의 수율을 현저하게 감소시켜야합니다. 이 논문은 로제타2(DE3)pLysS(이하 R2DP로 지칭됨) 세포를 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인(MMP-3cd)을 생산하는 프로토콜을 제시하며, 이는 친화성 정제에 사용하기 위한 N 말단 His-태그에 이어 프로도메인(Hisx6-pro-MMP-3cd)을 함유한다. R2DP 세포는 박테리아 발현 시스템에서 일반적으로 희귀한 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 통해 진핵 단백질의 발현을 향상시킨다. 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 전통적인 세포주 BL21(DE3)과 비교하여, 이 새로운 균주를 이용한 정제는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 수율을 향상시켰다. 활성화 및 탈염시, 프로 도메인은 N 말단 His-태그와 함께 절단되어, 무수한 시험관내 적용에서 즉시 사용하기 위한 활성 MMP-3cd를 제공한다. 이 방법은 고가의 장비나 복잡한 융합 단백질을 필요로 하지 않으며, 박테리아에서 재조합 인간 MMPs의 신속한 생산을 기술한다.
Introduction
대부분의 복잡한 진핵 단백질은 발현 후 정교한 번역 후 변형을 거치며, 고도로 보조된 단백질 폴딩 및 보조 인자가 기능적이어야 합니다1. 박테리아 숙주에서 다량의 가용성 인간 단백질을 생산하는 것은 소규모 실험실 실험에서도 높은 비용과 강력한 발현 및 정제 방법의 부족으로 인해 중요한 과제로 남아 있습니다2,3. MMPs, 큰 분자량을 가진 인간 endopeptidases는 일반적으로 대장균 에서 발현될 때 불용성 봉입체로서 발현된다. 가용성 인간 MMP의 추출은 종종 힘들고 시간이 많이 걸리는 가용화 및 재접힘 공정4으로 이어진다.
MMP는 생리적 및 병원성 과정 모두에서 중요한 역할을 한다. 인간 MMPs는 구조 및 기질 특이성에 의해 분류되고, 고도로 보존된 촉매 도메인5,6에도 불구하고 차등적으로 발현되는 23개의 아연 엔도펩티다제의 패밀리이다. MMPs는 비활성 효소원으로서 분비되고, 번역 후 활성화 및 이들의 내인성 억제제, 메탈로프로테이나제 (TIMPs)의 조직 억제제 7,8,9,10을 통해 조절된다. 처음에는 ECM 회전율에서 그들의 역할에 대해 인정되었지만, MMP는 또한 발달, 형태 형성, 조직 복구 및 리모델링에 연루되어 있습니다8. MMPs의 조절 장애는 다른 질병 중에서도 신경 퇴행성, 심장 혈관 및 섬유성 질환과 함께 암과 특히 관련이 있습니다5,7.
강력한 대규모 MMP 생산 방법의 개발은 생화학 및 세포 기반 분석을 통해 MMP 메커니즘에 대한 향후 연구의 성공을 보장하는 데 중요합니다. 다양한 MMP가 MMP 활성을 변경하지 않고 Hisx6-태그된 MMP를 포함하는 박테리아11에서 이전에 발현되었다12,13,14,15. 그러나 이러한 방법에는 복제하기 어려울 수 있는 지루하고 긴 단계가 포함됩니다.
포유동물 세포는 또한 적절한 번역 후 변형을 보장하면서 많은 상이한 인간 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다16. 포유동물 발현 시스템이 적절한 번역 후 변형을 갖는 재조합 인간 단백질을 생산하기 위한 이상적인 선택이지만, 이 방법의 주요 단점은 초기 낮은 수율, 값비싼 성장 배지 및 시약, 안정적인 발현 라인에 도달하기 위한 긴 타임라인, 진균 또는 박테리아와 같은 다른 종과의 오염 위험이다2,11 . 더욱이, 포유동물 세포주에서의 MMP 생산은 TIMPs 또는 피브로넥틴11과 같은 관련 세포 단백질로부터의 불순물을 산출한다. 포유류 세포에서 관찰되는 느린 세포 성장과는 달리, 박테리아 발현 시스템은 더 간단한 배지 및 성장 요건과 함께 단기간에 대규모 단백질 생산을 제공합니다. 그러나, 박테리아 발현 시스템에서 다른 관련 세포 단백질(즉, TIMPs)의 부족으로 인해, 더 높은 농도에서의 활성 MMP는 자가단백질 분해를 통해 분해될 수 있고, 결과적으로 불량한 MMP 수율17을 초래한다.
이 논문은 MMPs2,3,18의 더 높은 수율을 생산하는데 있어서 경제성, 단순성 및 성공으로 인해 대장균을 발현 숙주로 사용하는 재조합 Hisx6-pro-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제 및 활성화를 위한 상세한 방법을 기술한다. 대장균은 재조합 MMP 및 기타 복잡한 단백질에 필요한 단백질 폴딩 기계 및 번역 후 처리가 부족하기 때문에 많은 대장균 균주가 이러한 한계를 극복하도록 설계되어 대장균을 재조합 인간 MMP-3cd,19,20의 발현에 더 적합한 숙주로 만들었습니다. . 예를 들어, 본 연구에 사용된 R2DP 균주는 대장균에서 거의 사용되지 않는 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 공급함으로써 진핵 발현을 향상시킨다.
이 프로토콜에 기재된 바와 같이, R2DP 세포에서 pET-3a 벡터 (도 1)로부터 비교적 순수한 봉입체를 과발현시킨 후, Hisx6-pro-MMP-3 촉매 도메인 (MMP-3cd) 단백질이 추출되고 변성된다4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19는 친화성 태그 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 재접힘 및 투석시에, 프로-MMP-3cd (자이모겐)를 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트 (APMA)에 의해 활성화시키고, SDS-PAGE 분석은 수율 및 추가 정제의 필요성을 평가하기 위해 사용된다5,21. 이러한 프로토콜은 가용성 MMP-3cd의 발현, 정제 및 활성화를 예로 들어 설명한다. 그러나, 유사한 발현 및 활성화 메카니즘을 갖는 다른 MMPs 및 인간 프로테아제의 발현을 위한 가이드로서 또한 사용될 수 있다(도 2). MMP-3cd 이외의 다른 단백질의 경우, 독자는 이 프로토콜을 시도하기 전에 그들의 표적 단백질에 대한 최적의 완충액 조성물 및 방법을 결정하는 것이 권고된다.
도 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드의 플라스미드 맵. pET-3a 벡터는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. N 말단 Hisx6-태그 서열은 프로-MMP-3cd를 포함하는 pET-3a 기반 벡터 내로 클로닝되어, BamHI 및 NdeI 제한 부위 사이의 T7 프로모터의 제어 하에 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 구축물을 수득한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 프로-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제, 리폴딩 및 활성화. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드를 BL21(DE3) 또는 R2DP 세포로 형질전환시켰다. 1.2: 프로-MMP-3cd 단백질 발현은 IPTG를 사용하여 유도하였다. 1.3 : 화학적 용해 및 초음파 처리는 주로 불용성이며 봉입체에서 발견되는 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 추출하는 데 사용됩니다. 우레아는 봉입체로부터 단백질을 변성시키고 가용화하는데 사용되었다. 2.1. 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 친화성 크로마토그래피 정제를 통해 정제하였다. 3. 용출된 Hisx6-pro-MMP-3cd를 완충제로부터 요소들의 점진적인 제거를 통해 투석 동안 천천히 재접었다. 4. 마지막으로, 재접힌 MMP-3cd 단백질은 N 말단 프로펩타이드 도메인을 제거함으로써 APMA를 사용하여 활성화시켰다. APMA는 나중에 탈염을 통해 용액에서 제거됩니다. 숫자는 이러한 단계를 설명하는 프로토콜 섹션에 해당합니다. 약어: MMP-3cd = 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인; APMA = 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. MMP 발현
- pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd를 R2DP 세포로의 클로닝 및 형질전환
- pET-3a 플라스미드 (물질의 표 참조)를 다이제스트 버퍼에서 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 소화한다 (물질의 표 참조). 총 반응 부피 40μL에 다이제스트 버퍼 4μL, 100ng/μL 플라스미드 33μL 및 각 제한 효소 1.5μL를 첨가하고 37°C에서 완료될 때까지 ~2시간 동안 반응을 진행시킨다.
- MMP-3cd 서열에 대해 PCR 반응을 수행하여 N 말단 His-tag를 삽입한다. 25μL의 PCR 믹스( 물질 표 참조), 2.5μL의 10μM 프라이머(보충 그림 S1) 및 100ng/μL 삽입 서열 1.25μL를 사용합니다. 멸균수를 50 μL의 최종 반응 부피에 첨가한다.
- PCR 산물을 실행하고 1% 아가로스 겔 상에서 벡터를 소화시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 회수 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 젤 밴드를 정제합니다.
- 증폭된 PCR 산물을 DNA 어셈블리 믹스를 사용하여 NdeI 및 BamHI 제한 부위 사이의 소화된 벡터 내로 복제 한다(표 참조). 온라인 도구를 사용하여 15 μL의 총 반응 부피에 대해 삽입 및 절단 벡터의 필요한 부피를 결정하십시오.
- 해동될 때까지 얼음 상에서 50 μL 분취량의 고형질전환 효율 세포(물질 표 참조)를 해동시킨다. SOC 성장 배지(표 참조)를 37°C로 예열하고 LB-암피실린(LB Amp) 플레이트(재료 표 참조).
- 1-2 μL의 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 조립 반응을 50 μL 분취량에 첨가한다. 얼음 위에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 세포를 42°C에서 30초 동안 인큐베이션함으로써 열충격시킨다. 얼음 위에서 2 분 동안 배양하십시오.
- 950 μL의 SOC 성장 배지를 각각의 형질전환체 혼합물에 첨가한다. 250 rpm 및 37°C에서 1시간 동안 진탕한다.
- 형질전환체 100 μL를 LB Amp 플레이트 상에 플레이트하고 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 각각의 단리된 콜로니를 LB Amp 배지 10 mL에 접종한다. 250 rpm 및 37°C에서 밤새 진탕한다.
- 미니프렙 키트에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 추출 한다(표 참조). T7 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 구축물의 서열을 확인하였다(보충도 S1).
참고: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 구축물 DNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. 준비가 되면 R2DP 세포로의 형질전환을 진행한다. - R2DP 세포의 20 μL 분취량 하나를 얼음 상에서 2-5분 동안 해동시킨다( 물질 표 참조). SOC 성장 배지를 실온으로 예열하고 LB Amp CamR 플레이트를 37°C로 예열 한다(재료 표 참조).
- 50 μL 분취량에 100 ng/μL 서열-확인된 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 중 1 μL를 첨가한다. 부드럽게 저어 튜브를 섞어서 얼음으로 되돌립니다.
- 튜브를 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 세포를 정확히 30초 동안 42°C에서 인큐베이션함으로써 열충격시킨다. 흔들리지 마십시오.
- 세포를 얼음 위에 2 분 동안 놓습니다.
- 80 μL의 실온 SOC 배지를 형질전환체 혼합물에 첨가한다. 250 rpm 및 37°C에서 1시간 동안 진탕한다.
- 형질전환체를 LB Amp CamR 플레이트 상에 플레이트화하고 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 성장과 유도
- LB Amp CamR 플레이트로부터 R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 형질전환체의 단일, 단리된 콜로니를 10 mL의 LB Amp CamR 배지에 37°C에서 접종한다. 하룻밤 동안 250 rpm (~ 16 h)에서 흔들어주십시오. 각 배양물에서 분취량을 저장하고 원하는 경우 40 % (v / v) 글리세롤 (재료 표 참조) 주식을 준비하십시오.
- 하룻밤 배양 당에, 500 mL의 LB Amp CamR 배지를 함유하는 1 L 플라스크를 0.05-0.1의 광학 밀도 (OD600)에서 600 nm (OD600)로 접종한다.
참고: 이렇게 하면 세포가 대수 성장으로 되돌아갑니다. - OD600은 0.4와 0.6 사이에 떨어질 때까지 일반적으로 3-4 시간 동안 여러 시점에서 측정하십시오.
- 유도 전에, 배양물의 분획을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 ( 물질의 표 참조)에 분취하고, 이를 비유도 분획으로 라벨링한다. 겔 분석을 위해 -80°C에 보관한다. SDS-PAGE 젤을 실행하지 않는 경우 이 단계를 건너뛰고 1.2.5단계로 진행하십시오.
- 배양물을 1 M 이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 스톡을 사용하여 1 mM의 최종 농도로 유도하였다 ( 물질의 표 참조). 추가의 3-4 h 동안 37°C 진탕기에서 계속 인큐베이션한다.
참고: 표현식 중에 리더는 유도 시 최적의 OD600과 IPTG 농도를 결정해야 합니다. 정제 후 수율이 실질적으로 떨어지면, 정제 완충액 중의 이미다졸 농도는 조정이 필요할 수 있거나, 세포 펠릿을 추가로 초음파 처리해야 할 수도 있다. - 배양물을 원심분리하기 전에, 배양물의 분획을 분취하여 초분리기 1.5 mL 마이크로분리 튜브에 넣고 이를 유도 분획으로 라벨링한다. 겔 분석을 위해 -80°C에 보관한다. SDS-PAGE 젤을 실행하지 않는 경우 이 단계를 건너뛰고 1.2.7단계로 진행하십시오.
- 세포 배양물을 250 mL 원뿔형 병( 물질 표 참조)에서 최대 속도 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
- 배양물이 완전히 펠릿화될 때까지 단계 1.2.7을 반복한다.
참고: PAUSE: 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 추가 처리를 위해 나중에 해동될 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 1.3.1단계로 진행합니다.
- 봉입체 추출 및 가용화
참고: 신선한 10 M 우레아를 하루 전에 준비하고, 완전히 용해 될 때까지 완전히 저어줍니다. 요소나 오토클레이브 요소를 가열하지 마십시오; 실온에서 보관하십시오.- 펠릿을 용해 완충액 (단계 1.2.8로부터)에 재현탁 시킨다 (물질의 표 참조). 펠릿 그램 당 용해 완충액 3mL를 넣고 볼텍싱 또는 피펫팅으로 재현탁하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 진탕한다.
- 배양 1 L 당 1.25 mL의 10% (w/v) 소듐 데옥시콜레이트 ( 물질 표 참조)를 첨가한다. 실온에서 150 rpm으로 30분 동안 흔들어 주십시오.
- 배양물 1 L 당 10 μL의 DNase I ( 물질 표 참조)를 첨가한다. 실온에서 150 rpm으로 30분 동안 흔들어 주십시오.
- 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
- 겔 분석을 위해 용해된 MMP 의 분획을 따로 설정한다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.6 단계로 진행하십시오.
참고 : 원심 분리 후 펠렛은 끈끈하고 컴팩트하게 포장되지 않아 상층액을 버리는 것이 위험합니다. 이 경우 1.3.6단계를 건너뛰고 1.3.7단계로 진행합니다. - 원심분리된 샘플로부터 상층액을 버린다.
참고: 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지되고 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 1.3.7단계로 진행합니다. - 펠렛을 100 mL/L 봉입체 완충액 배양물( 재료 표 참조)에 재현탁하여 위아래로 피펫팅합니다.
- 초음파 처리 중에는 과열을 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플을 15초의 6사이클 동안 초음파 처리하고, 5회 및 50% 펄스를 출력합니다. 사이클 사이의 냉각을 위해 15초의 휴식 기간을 허용하십시오.
참고: 필요한 경우 추가 원심분리를 위해 샘플을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. - 겔 분석을 위해 초음파 처리된 MMP 의 분획을 따로 떼어놓는다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.11 단계로 진행하십시오.
- 펠릿을 확인하십시오. 문자열이 있는 경우 1.3.8-1.3.10단계를 반복합니다. 펠렛이 콤팩트한 경우, 상청액을 버리고 단계 1.3.12로 진행한다.
참고: 봉입체 버퍼의 초음파 처리는 용해된 세포 파편으로부터 더 많은 단백질을 회수하기 위해 반복될 수 있습니다. 그러나 너무 많은 초음파 처리는 전단을 일으킬 수 있으며 이는 MMP 수율에 해를 끼칩니다. 프로토콜은 이 단계에서 일시 중지될 수 있고, 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다. - 1 L 배양물로부터의 각 펠렛을 5 mL의 가용화 완충액 (표 참조) 에 피펫팅하여 재현탁시킨다. 단백질이 가용화될 수 있도록 얼음 위에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한다.
- 겔 분석을 위해 가용화된 MMP 의 분획을 따로 설정한다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 1.3.14 단계로 진행하십시오.
- 세포를 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 상청액을 버리지 않는다.
- 원심분리 후 펠렛이 형성되거나 남아 있으면 상층액을 별도의 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 펠렛을 또 다른 5 mL의 가용화 완충액 (배양액 1 L 당)에 재현탁시켜 위아래로 피펫팅한다.
- 13,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 버리지 않는다.
- 원심분리 후 펠릿이 약간 또는 전혀 형성되지 않거나 회색 침전물만 남을 때까지 1.3.13 및 1.3.14 단계를 반복한다. 상청액을 풀링하십시오. 펠렛을 폐기하거나 추가 초음파 처리를 위해 -80°C에서 보관하십시오.
2. MMP 정제 및 재접힘
- 그의 태그 (HT) 친화성 정제
- 제조업체의 프로토콜에 따라 중력 흐름 컬럼 (재료 표 참조)을 잘 혼합 된 Ni-NTA 수지 (재료 표 참조)로 채 웁니다. 수지가 침전되고 저장 버퍼로부터 분리되어 두 층 사이에 별개의 선이 형성되도록하십시오.
참고: 공기가 수지에 침투하여 단백질 수율을 해칠 수 있으므로 수지가 건조되도록 허용하지 마십시오. 사용 사이에, 섹션 2.2에 기재된 수지 재생 절차를 수행하십시오. - 저장소 버퍼가 드레인되도록 합니다. 컬럼을 HT 평형 버퍼의 두 개의 수지 베드 볼륨으로 채 웁니다.
- HT 평형 버퍼를 배수하고 버립니다. 컬럼이 배수되면서, 단백질 추출물을 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하고, 필터-0.22 μm 필터를 사용하여 멸균한다( 표 참조).
- 폐기물 용기를 HT Flowthrough라고 표시된 50mL 원뿔형 튜브로 바꿉니다. 제조된 단백질 추출물을 컬럼에 첨가한다.
- 흐름선을 다시 적용하여 바인딩을 최대화합니다.
- 겔 분석을 위해 Flowthrough 분획의 일부분을 따로 보관하십시오. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.7로 진행하십시오.
- 즉시 수지를 15 mL의 HT 세척 완충액으로 세척 한다(물자의 표 참조). HT 워시로 라벨링된 15 mL 원뿔형 튜브 ( 물질 표 참조)에 유동관을 수집 한다.
참고: 분광광도측정법을 통해 280nm(A280)의 흡광도 값을 얻었으며 단백질 농도를 추정하기 위해 분자량 및 흡광 계수(ε)와 함께 사용했습니다. 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 경우, 분자량은 29.86 kDa이고, ε는 34.38 M-1 cm-1이다. - HT 세척 버퍼에 대한 블랭킹, A280을 측정하고 기록하십시오. 추가 세척 분획으로 단계 2.1.7 및 2.1.8을 반복하십시오. A280이 기준선에 접근하고 불순물이 최소화되면 2.1.9단계로 진행하십시오.
- 겔 분석을 위해 세척 분획의 일부분을 따로 보관하십시오. 여러 세척 분수에 대해 반복하십시오. 분획을 -80°C에서 저장한다. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.10으로 진행하십시오.
- 즉시 5 mL의 HT 용출 완충액을 첨가하여 His-tagged 단백질을 용출시킨다( 표 참조). 유동을 HT 용출로 표지된 마이크로퍼지 튜브에서 0.5-1 mL 분획으로서 수집한다.
- 겔 분석을 위해 용출 분획의 분율을 따로 두십시오. 여러 용출 분획에 대해 반복하십시오. 분획을 -80°C에서 저장한다. 겔 분석을 수행하지 않으면 단계 2.1.12로 진행하십시오.
- A280이 >0.3 mg/mL인 경우, HT 평형 완충액으로 분획을 희석 한다(물자 표 참조).
참고: 용출된 분획은 투석 중 침전을 방지하기 위해 0.3mg/mL 이하의 A280으로 희석해야 합니다. 상기 프로토콜은 여기서 일시 중지되고 풀링된 분획을 -80°C에서 동결시키고 나중에 해동시킬 수 있다. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 2.2.1단계로 진행합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 중력 흐름 컬럼 (재료 표 참조)을 잘 혼합 된 Ni-NTA 수지 (재료 표 참조)로 채 웁니다. 수지가 침전되고 저장 버퍼로부터 분리되어 두 층 사이에 별개의 선이 형성되도록하십시오.
- 수지 재생
- HT 재생 버퍼 ( 재료 표 참조)의 열 개의 수지 베드 볼륨과 열 개의 수지 베드 부피의 멸균수로 수지를 씻으십시오.
- 수지를 50% 슬러리로 물에 20%(v/v) 에탄올에 보관합니다.
3. 단백질 리폴딩
참고: 더 작은 부피의 경우, 투석 카세트는 시료 손실의 위험이 낮은 상태에서 사용할 수 있습니다. 더 많은 양을 사용하는 경우 투석 튜브가 필요합니다 ( 재료 표 참조).
- 투 석
참고 : 투석을위한 최적의 단백질 농도는 ~ 0.3 mg / mL입니다. 투석 중에 상당한 침전이 발생하는 경우, 단계적 투석 방법을 사용하여 각 투석 사이의 요소 농도 구배를 감소시키고 더 많은 중간 단계를 추가합니다 (예를 들어, 6 M 내지 5 M, 그리고 이어서 5 M 내지 4 M, 5 M 단계를 건너 뛰는 것보다는). 동결 해동 사이클은 세포 및 단백질 구조를 손상시키기 때문에 프로토콜의 일시 중지를 최소화하는 것이 중요합니다.- 제조업체의 프로토콜에 따라 용출 분획 샘플의 양에 따라 적절한 양의 투석 튜브를 사용하십시오.
- 용출된 MMP 분획을 투석 튜브 중의 1 L의 투석 완충액 1에 잠입 시킨다(표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
- 투석 완충액 2 1 L로 옮긴다( 표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
- 투석 완충액 3 1 L로 옮긴다( 재료 표 참조). 튜빙 및 그의 내용물을 4°C에서 8 h 이상 자석 교반기 상에서 교반한다.
- 샘플을 새로운 50 mL 코니컬 튜브로 옮기고 투석된 MMP로 라벨링합니다.
- 튜브에 침전물이 있는지 검사하십시오. 침전물이 형성된 경우, 샘플을 13,000 × g 및 4°C에서 1분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 새로운 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 리폴딩된 MMP로 라벨링한다.
- 겔 분석을 위해 분수를 따로 놓고 리폴딩된 MMP로 라벨링하십시오. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 3.1.9 단계로 진행하십시오.
참고: 수율이 낮으면, 침전물을 HT 평형 완충액에 용해시킬 수 있고, 섹션 3.1의 단계를 투석 튜브로 반복할 수 있다. 겔 분석을 수행하지 않거나 프로토콜이 여기에서 일시 중지되어야하는 경우 -80 °C에서 샘플을 동결시키고 나중에 해동하십시오. 수율이 원하는 범위에 있으면 3.2.1단계로 진행하십시오.
- 재집중
참고: 재접히고 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd에 대한 소멸 계수는 동일할 것으로 예상된다; 따라서 A280 계산은 영향을 받지 않습니다.- 샘플을 최대 0.5 mg/mL까지 재농축합니다. 400 mL 교반 셀( 표 참조)을 사용하여 샘플을 15 mL로 농축하였다. 거품을 방지하려면 필요한 경우 50mL 재농축 튜브를 사용하여 추가로 농축하십시오.
참고: 침전물이 형성되면, HT 평형 완충액에 펠릿화되고 용해될 수 있다. 그런 다음 섹션 3.1과 3.2.1단계를 반복합니다. 그렇지 않으면 3.2.2단계를 계속 진행하십시오. - 겔 분석을 위해 분획을 따로 놓고 농축 MMP로 라벨링하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다.
- 샘플을 최대 0.5 mg/mL까지 재농축합니다. 400 mL 교반 셀( 표 참조)을 사용하여 샘플을 15 mL로 농축하였다. 거품을 방지하려면 필요한 경우 50mL 재농축 튜브를 사용하여 추가로 농축하십시오.
4. 활성화
- 4- 아미노페닐 수은 아세테이트 (APMA) 활성화
참고: APMA는 독성이 강합니다. 활성화하기 전에 20 mM APMA의 신선한 원액을 만들고 APMA를 사용할 때 항상 흄 후드 아래에서 작업하십시오. APMA 폐기물을 컨테이너에 버리십시오.- MMP (1 mg/mL)의 1 mL 분취량당 50 μL의 20 mM APMA ( 물질 표 참조)를 첨가하여 1 mM의 최종 APMA 농도에 도달한다. 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 침전물이 형성되면, 이를 4°C에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리한다. 상청액을 활성화된 MMP로 표지된 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 보관한다. 침전물을 APMA 폐기물로 표시된 용기에 버리십시오.
- 겔 분석을 위해 분획을 따로 놓고 활성화된 MMP라고 라벨링한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다. 겔 분석을 수행하지 않으면 4.2.1 단계로 진행하십시오. 활성화 후, MMP-3cd의 분자량 및 흡광 계수는 각각 19.40 kDa 및 28.42 M-1 cm-1이다.
- 탈염
- 제조업체의 프로토콜에 따라 2 mL 탈염 컬럼( 재료 표 참조)으로 활성화된 MMP-3cd 샘플에서 APMA를 제거합니다.
- 겔 분석을 위해 분획을 따 로 놓고 탈염 MMP에 라벨을 붙입니다. -80 °C에서 보관하십시오. 겔 분석을 수행하지 않으면 나머지 샘플과 함께 섹션 4.3으로 진행하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 샘플은 -80°C에서 동결되고 나중에 해동될 수 있다.
- SDS-PAGE 젤 실행
- SDS-PAGE 겔에서 모든 단백질 분획을 실행: 비유도 분획, 유도 분획, 용해된 MMP, 초음파 처리된 MMP, 가용화된 MMP, 플로스루 분획, 세척 분획, 용출 분획, 리폴딩된 MMP, 농축된 MMP, 활성화된 MMP 및 탈염된 MMP.
- MMP-3의 장기 저장
- 탈염된 MMP-3cd 샘플에 0.05%(v/v) 비이온성 계면활성제( 표 참조)를 첨가하고 -80°C에 보관한다.
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Representative Results
SDS-PAGE에서 샘플을 실행할 때, 단백질이 불용성 봉입체의 형태로 발현되기 때문에, 용해 및 초음파 처리된 분획은 단백질이 아직 요소에서 재용해되지 않았기 때문에 Hisx6-pro-MMP-3cd 추출물을 거의 또는 전혀 함유하지 않아야 한다. 도 3 은 BL21(DE3) 세포 및 R2DP 세포로부터의 Hisx6-pro-MMP-3cd의 His-태그 정제 용출 분획을 비교한다. 용출 분획은 투석 전에 BL21(DE3) 및 R2DP 세포 둘 다에 대해 개별적으로 풀링되었다. 각 단계로부터의 분획은 단백질이 탈염된 후에 실행되었다(도 4). 모든 Hisx6-pro-MMP-3cd 샘플은 대략 30 kDa에서 밴드를 표시하고, 활성 MMP-3cd는 His-태그 및 프로 도메인의 제거시 대략 20 kDa에서 밴드를 표시한다(도 4 및 보충 도 S1).
대장균 배양액의 mg/L에서 단백질의 총 수율은 BL21(DE3) 및 R2DP 배양물의 정제 및 탈염 후에 결정되었다(표 1). R2DP 세포를 사용하여 실질적으로 더 높은 수준의 MMP 발현을 산출한다. 일반 BL21(DE3) 세포는 배양 리터당 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd 3cd 3.5mg만을 산출한 반면, R2DP 세포는 45mg/L 배양물을 생산했다. 유사하게, 기능성, 탈염된 MMP-3cd의 수율은 각각 BL21(DE3) 및 R2DP 세포에 대해 0.13 mg/L 배양물에서 6.2 mg/L 배양으로 증가하였다. 인간 pro-MMP-3cd는 크기 (약 30 kDa)와 진핵 생물에게만 배타적 인 정교한 번역 후 변형이 필요하기 때문에 표준 BL21 (DE3) 균주의 세포 기계를 압도합니다. 상기 R2DP 균주는 진핵 단백질의 발현을 강화하도록 설계된 BL21(DE3) 유도체이다. R2DP 균주는 AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC 및 CGG에 대한 tRNA를 운반하며, 이는 E.coli에서는 거의 사용되지 않지만 pro-MMP-3cd DNA 서열에는 풍부합니다. 이는 잠재적으로 R2DP 세포에서 관찰되는 단백질 발현의 증가된 수준의 핵심 인자이다.
도 3: BL21(DE3) 및 R2DP 세포에서의 Hisx6-pro-MMP-3cd 발현의 SDS-PAGE 겔 분석. (a) BL21(DE3) 세포에서 Hisx6-pro-MMP-3cd의 처음 8개의 용출 분획. (b) R2DP 세포에서 Hisx6-pro-MMP-3cd의 처음 8개의 용출 분획. 우레아 중의 MMP 봉입체의 추출 및 가용화에 이어서, Hisx6-pro-MMP-3cd 샘플을 배치-중력 흐름을 사용하는 Ni-NTA 크로마토그래피 컬럼을 통해 정제하였다. 겔은 용출 분획만을 보여주기 위해 잘립니다. 처음에는 고농도의 단백질로 인해 분획 1-5는 1 mL입니다. 이후 분획 (6-8)은 각각 5 내지 8 mL 사이이다. Hisx6-pro-MMP-3cd 밴드는 ∼30 kDa에서 관찰된다. 약어: MMP-3cd = 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인; SDS-PAGE = 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; Ni-NTA = 니켈-니트릴로트리아세트산; FT = 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: MMP-3cd의 활성화시 His-tag 및 프로도메인의 단백질 분해 절단. R2DP 세포에서 MMP-3cd의 유도, 재접힘, 농축, 활성화 및 탈염된 분획이 도시되어 있다. 투석 후, Hisx6-pro-MMP-3cd를 농축하고 APMA를 사용하여 활성화시킨다. 활성화시, 활성화된 MMP-3cd 밴드의 분자량은 약 20 kDa이고, 이는 ∼30 kDa로 남아있는 His-태깅된 효소원과 반대된다. 불순물은 활성화 및 탈염 단계에서 제거됩니다. 약어: MMP-3cd = 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인; APMA = 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | BL21 (DE3) 셀 | R2DP 셀 | ||||
| 부피 (mL) | 농도 (mg / mL) | 수율 (mg/L 배양물) | 부피 (mL) | 농도 (mg / mL) | 수율 (mg/L 배양물) | |
| 정화 | 23 | 0.30 | 3.5 | 42 | 2.1 | 45 |
| 탈염 | 1.5 | 0.17 | 0.13 | 72 | 0.17 | 6.2 |
표 1: MMP-3cd 정제의 단계에 걸친 부피 및 농도의 표. Hisx6-pro-MMP-3cd는 BL21(DE3)의 배양물의 2 L 또는 2 L의 R2DP 세포에서 발현되었다. 부피, 농도 및 수율(리터당 mg) 배양물은 BL21(DE3) 및 R2DP 세포에 대해 보고된다. 수율 (배양물의 리터 당 mg)은 배양물의 부피로 수득된 단백질 (mg)의 총 수율을 나눔으로써 수득되었고, 이는 BL21(DE3) 및 R2DP 케이스 둘 다에 대해 2 L이었다. 단백질 양 수율은 두 단계에 대해 보고된다: Hisx6-pro-MMP-3cd 다음의 Hisx6-태그 정제 및 탈염 후 활성 MMP-3cd.
보충도 S1: 활성화 전후의 T7 프라이머 및 MMP-3cd 단백질의 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
가용성, 인간, 재조합 MMP의 대규모 생산은 여전히 어려운 과제입니다. 포유동물 세포는 높은 비용과 긴 대기 시간으로 기능적 MMP를 발현할 수 있는 반면, 대장균은 정제되고 재접혀져야 하는 다량의 MMP 봉입체를 빠르게 생산한다11,16. R2DP 세포는 MMP 봉입체의 수율을 상당히 증가시켜, 보다 비용 효율적이고 생산적인 MMP 리폴딩 공정을 가능하게 한다. 그러나 대장균은 MMP를 접는 데 필요한 번역 후 기계가 부족하며, 조작된 균주가 크게 향상된 발현 수준을 보여 주지만, 변성제 제거시 일부 중간체 만 적절하게 접힙니다4. 결과적으로, MMPs의 가끔 침전은 리폴딩 및 활성화 동안 여전히 예상된다. 이들 결과는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd 수율의 상당 부분이 재폴딩, 활성화 및 탈염 후에 손실된다는 것을 보여준다.
이러한 단계는 MMP-3cd 및 APMA의 테스트 농도와 함께 더 많은 투석 단계를 추가하여 더욱 최적화 할 수 있습니다. 그러나, 배양의 리터 당, 기능적 MMP-3cd의 수율은 BL21(DE3) 세포보다 R2DP 세포에서 49배 더 높다. 추가적으로, 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd로부터 회수된 기능성, 탈염된 MMP-3cd의 비율은 BL21(DE3) 세포의 경우 3.7%에서 R2DP 세포의 경우 14%로 상승하였다. 따라서, R2DP 세포는 포유동물 세포에서의 발현과 같은 현재의 MMP 생산 옵션에 대한 실행 가능한 대안을 제공하며, 배양 리터당 보다 경쟁력 있는 수율을 제공한다.
이 프로토콜은 MMP-3cd의 활성화 및 재폴딩과 함께 R2DP 대장균 세포에서 Hisx6-pro-MMP-3cd를 발현 및 정제하는 상세한 방법을 기술한다. 프로토콜이 완료되기까지 며칠이 걸리기 때문에 여러 동결-해동 주기로 인한 기능적 MMP의 손실을 최소화하기 위해서는 신중한 계획이 중요합니다. R2DP 세포가이 방법의 주요 개선이기 때문에 재접힘 및 활성화를 통해 대량이 손실 될 수 있으므로 발현 수율을 최적화하는 것이 가장 중요합니다. 발현 동안, 조작자는 유도 전에 최적의 OD600 및 IPTG 농도를 결정해야 한다. His-tag 정제 후 수율이 크게 떨어지면 수지를 재생하거나 교체해야 할 수도 있고 세포 펠렛을 더 초음파 처리해야 할 수도 있습니다.
투석 중에 상당한 침전이 발생하는 경우, 더 많은 단계를 추가하여 단계적 투석에서 단계 간의 요소 농도의 변화를 감소시킨다 (예를 들어, 5 M 단계를 건너 뛰는 대신 6 M에서 5M으로, 그 다음 5 M 내지 4 M). 일단 재접히면, 특히 활성화 후에, MMPs는 실질적으로 자가단백질 분해를 통한 침전 또는 분해에 더 취약하다17. 모든 완충액의 pH 및 염 농도가 최적화되고 원하는 테스트가 수행 된 후에는 투석 후 모든 단계를 긴급하게 완료해야합니다.
치료제의 잠재적 표적으로서 MMP에 대한 관심이 높아지면서 MMP 치료제의 결합, 억제 및 선택성을 개선하기 위한 단백질 공학의 급속한 혁신이 충족되었다9. 결과적으로, MMP 치료제 분야에서 한때 야심찬 전망은 꾸준히 달성 가능해지고 있습니다6. 용해성, 활성 MMP를 복구하기위한 빠르고 신뢰할 수있는 방법에 대한 필요성은 의심 할 여지없이 시간이 지남에 따라 더욱 중요해질 것입니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자들은 플로리다 주 잭슨빌의 메이요 클리닉에서 에베트 라디스키 박사와 알렉산드라 호클라 박사가 Hisx6pro-MMP-3cd 유전자를 복제하기 위한 주형으로 pET-3a-pro-MMP-3cd 플라스미드를 제공한 것에 대해 인정하고 싶고, 그들의 의견은 리노의 네바다 대학의 네바다 유전체학 센터의 폴 하틀리 박사와 함께 DNA 시퀀싱을 위해 제시하고 싶다. 저자는 또한 단백질 발현의 일부를 도와 준 카산드라 헤르겐라더에게 감사하고 싶습니다. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE 통합 신경 과학 보조금과 UNR R & D mICRO SEED Grant Award에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging |
| 1 L Erlenmeyer flasks | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
| 1 L glass bottles | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
| 1.5 mL microfuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
| 18 G, 1-in. beveled needle | Amazon | B07S7VBHM2 | Used in combination with the dialysis casette |
| 2 mL desalting column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Removes APMA following activation |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
| 250 mL conical bottle cushions | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation |
| 250 mL conical bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
| 400 mL stirred cell | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit |
| 4-aminophenylmercuric acetate (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Activates MMP-3 by cleaving the propeptide |
| 5 mL syringe | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Used in combination with the dialysis casette |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Used for storage in many purification steps |
| 50 mL re-concentration tube | Sigma Aldrich | UFC901024D | Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media |
| BamHI | NEB | R3136S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Calcium chloride (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | The calcium ion stabilizes MMP structure |
| Cell spreaders | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Can be used to spread cells across a petri dish after transformation |
| Chloramphenicol | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media |
| Dialysis Buffer 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea. |
| Dialysis Buffer 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea. |
| Dialysis Buffer 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2. |
| Dialysis clips | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Used in combination with snakeskin dialysis tubing |
| Dialysis tubing | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss |
| Digest buffer | NEB | B7204S | Buffer used in digesting the pET3a vector |
| Disposable cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds |
| DNA assembly mix | NEB | E2621S | Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector |
| DNase I | NEB | M0303S | Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds |
| Gel recovery kit | Promega | A9281 | Isolates and purifies DNA from agarose gels |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C |
| Gravity flow column | BioRad | 7321010 | Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins |
| High-transformation efficiency cells | NEB | C2987 | High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct |
| HT Elution Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| HT Equilibration Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4 |
| HT Regeneration Buffer | n/a | n/a | 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0 |
| HT Wash Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Used to pH buffers |
| Imidazole | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein |
| Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C |
| LB Amp CamR media | n/a | n/a | To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Amp CamR plates | n/a | n/a | To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride |
| Lysis Buffer | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0 |
| Lysozyme | MP Biomedicals | 195303 | Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls |
| Miniprep kit | Promega | A1330 | If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants |
| NdeI | NEB | R0111S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Ni-NTA resin | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole |
| Nonionic surfactant | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity. |
| PCR mix | NEB | M0492S | A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector |
| pET plasmid | Addgene | n/a | The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | Used for plating transformants on LB agar media |
| R2DP cells | Novagen | 714033 | BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli |
| SOC growth media | NEB | B9020S | Non-selective growth media for rapid growth during transformation |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Used in buffers and helps with protein stability |
| Sodium deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls |
| Solubilization Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Detergent used for cell lysis |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure |
| Zinc chloride (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3 |
References
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