Summary
His-tag rening, dialys och aktivering används för att öka avkastningen av lösliga, aktiva matris metalloproteinase-3 katalytiska domänprotein uttryck i bakterier. Proteinfraktioner analyseras via SDS-PAGE geler.
Abstract
Matris metalloproteinases (MMPs) tillhör familjen av metzincin proteaser med centrala roller i extracellulär matris (ECM) nedbrytning och ombyggnad, liksom interaktioner med flera tillväxtfaktorer och cytokiner. Överuttryck av specifika MMPs är ansvarig i flera sjukdomar som cancer, neurodegenerativa sjukdomar och hjärt-kärlsjukdom. MMPs har varit centrum för uppmärksamhet nyligen som mål för att utveckla terapier som kan behandla sjukdomar korrelerade till MMP överuttryck.
För att studera MMP-mekanismen i lösning behövs mer enkla och robusta rekombinanta proteinuttryck och reningsmetoder för produktion av aktiva, lösliga MMPs. Det katalytiska området för de flesta penningmarknadsfonder kan dock inte uttryckas i Escherichia coli (E. coli) i löslig form på grund av brist på posttranslational maskiner, medan däggdjursuttrycksystem vanligtvis är kostsamma och har lägre avkastning. MMP-inklusionsorgan måste genomgå den tråkiga och mödosamma processen med omfattande rening och omveckning, vilket avsevärt minskar avkastningen av MMPs i inhemsk konformation. Detta dokument presenterar ett protokoll som använder Rosetta2(DE3)pLysS (nedan kallad R2DP) celler för att producera matris metalloproteinase-3 katalytisk domän (MMP-3cd), som innehåller en N-terminal His-tag följt av pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) för användning i affinitet rening. R2DP-celler förbättrar uttrycket av eukaryota proteiner genom en kloramfenicolresistent plasmid som innehåller kodoner som normalt är sällsynta i bakteriella uttryckssystem. Jämfört med den traditionella cellinjen för rekombinant proteinuttryck, BL21 (DE3), förbättrade rening med denna nya stam utbytet av renad Hisx6-pro-MMP-3cd. Vid aktivering och avsaltning klyvs pro-domänen tillsammans med N-terminalen His-tag, vilket ger aktiv MMP-3cd för omedelbar användning i otaliga in vitro-applikationer . Denna metod kräver inte dyr utrustning eller komplexa fusionsproteiner och beskriver snabb produktion av rekombinanta mänskliga MMPs i bakterier.
Introduction
De flesta komplexa eukaryota proteiner genomgår utarbetade posttranslational modifieringar efter uttryck, vilket kräver mycket assisterad proteinveckning och co-faktorer för att vara funktionella1. Att producera stora mängder lösligt humant protein i en bakterievärd är fortfarande en betydande utmaning på grund av höga kostnader och bristen på robusta uttrycks- och reningsmetoder, även för småskaliga laboratorieexperiment2,3. MMPs, mänskliga endopeptidaser med stor molekylvikt, uttrycks vanligtvis som olösliga inklusionsorgan när de uttrycks i E. coli. Extraktion av lösliga mänskliga MMPs leder ofta till en mödosam, tidskrävande solubilisering och omveckningsprocess4.
MMPs har kritiska roller i både fysiologiska och patogena processer. Mänskliga MMPs är en familj av 23 zink endopeptidaser, kategoriserade efter struktur och substrat specificitet, och differentiellt uttryckt trots en mycket bevarad katalytisk domän5,6. MMPs utsöndras som inaktiva zymogener, regleras via posttranslational aktivering och deras endogena hämmare, vävnadshämmare av metalloproteinaser (TIMPs)7,8,9,10. Även om de ursprungligen erkändes för sin roll i ECM omsättning, har MMPs också varit inblandade i utveckling, morfogogenes, vävnad reparation och ombyggnad8. Dysregulation av MMPs har särskilt kopplats till cancer tillsammans med neurodegenerativa, kardiovaskulära och fibrotiska sjukdomar, bland andra sjukdomar5,7.
Utvecklingen av robusta storskaliga MMP-produktionsmetoder är avgörande för att säkerställa framgången för framtida studier av MMP-mekanismer genom biokemiska och cellbaserade analyser. Olika mmps har tidigare uttryckts i bakterier11, inklusive Hisx6-märkta MMPs, utan att ändra MMP-aktivitet12,13,14,15. Dessa metoder innehåller dock tråkiga, långa steg som kan vara svåra att replikera.
Däggdjursceller kan också användas för att uttrycka många olika mänskliga proteiner samtidigt som rätt posttranslational modifieringar säkerställs16. Även om däggdjursuttrycksystemet är ett idealiskt val för att producera rekombinanta humanproteiner med korrekta post-translationella modifieringar, är de största nackdelarna med denna metod initiala låga utbyten, kostsamma tillväxtmedier och reagenser, långa tidslinjer för att nå stabila uttryckslinjer och risk för kontaminering med andra arter som svampar eller bakterier2,11 . Dessutom ger MMP-produktion i däggdjurs cellinjer föroreningar från associerade cellulära proteiner som TIMPs eller fibronectins11. Till skillnad från den långsamma celltillväxt som observerats i däggdjursceller erbjuder bakterieuttryckssystemet storskalig proteinproduktion på kort tid tillsammans med enklare medie- och tillväxtkrav. På grund av bristen på andra associerade cellulära proteiner (dvs. TIMPs) i bakteriella uttryckssystem, utsätts dock aktiva MMPs vid högre koncentrationer för nedbrytning genom autoproteolys, vilket resulterar i dålig MMP-avkastning17.
Detta dokument beskriver en detaljerad metod för bakteriell uttryck, rening och aktivering av rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd med E. coli som uttryck värd på grund av dess överkomliga, enkelhet och framgång i att producera högre avkastning av MMPs2,3,18. Eftersom E. coli saknar de proteinvikningsmaskiner och posttranslational bearbetning som krävs för rekombinanta MMPs och andra komplexa proteiner, har många E. coli-stammar konstruerats för att övervinna dessa begränsningar, vilket gör E. coli till en mer lämplig värd för uttryck av rekombinant mänsklig MMP-3cd,19,20 . Till exempel förbättrar den R2DP-stam som används i denna studie eukaryota uttryck genom att leverera en kloramfenicolresistent plasmid som innehåller kodoner som sällan används i E. coli.
Som beskrivs i detta protokoll, efter överuttryck av relativt rena inklusion organ från pET-3a vektorn (figur 1) i R2DP celler, Hisx6-pro-MMP-3 katalytiska domän (MMP-3cd) proteiner extraheras och denatureras4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 renades med hjälp av affinitet tagg kromatografi. Vid refolding och dialys aktiverades pro-MMP-3cd (zymogen) av 4-aminofenylmercuric acetat (APMA), och SDS-PAGE analys används för att utvärdera avkastningar och behovet av ytterligare rening5,21. Detta protokoll beskriver uttryck, rening och aktivering av lösliga MMP-3cd som ett exempel. Det kan dock också användas som vägledning för uttryck av andra penningmarknadsfonder och mänskliga proteaser med liknande uttryck och aktiveringsmekanismer (figur 2). För andra proteiner än MMP-3cd rekommenderas läsaren att bestämma optimala buffertkompositioner och metoder för deras målprotein innan man försöker detta protokoll.
Bild 1: Plasmid karta över pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. PET-3a vektorn innehåller en ampicillin resistensgen. En N-terminal Hisx6-taggsekvens klonas till den pET-3a-baserade vektorn, inklusive pro-MMP-3cd, för att ge pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruktionen under kontroll av T7-promotorn mellan BamHI och NdeI-begränsningsplatser. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Bakteriell uttryck av pro-MMP-3cd, rening, omveckning och aktivering. 1,2: Pro-MMP-3cd protein uttryck inducerades med hjälp av IPTG. 1.3: Kemisk lys och ultraljudsbehandling används för att extrahera Hisx6-pro-MMP-3cd proteiner som huvudsakligen är olösliga och finns i inklusionskropparna. Urea användes för att denaturera och solubilisera protein från inklusionskroppar. 2.1. Denatured Hisx6-pro-MMP-3cd protein renades via affinitet kromatografi rening. 3. Den eluted Hisx6-pro-MMP-3cd var långsamt refolded under dialys genom gradvis avlägsnande av urea från bufferten. 4. Slutligen aktiverades omveckat MMP-3cd protein med APMA genom att ta bort N-terminal pro-peptid domänen. APMA avlägsnas senare från lösningen genom avsaltning. Siffrorna motsvarar protokollavsnitt som beskriver dessa steg. Förkortningar: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domän; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MMP-uttryck
- Kloning och omvandling av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd till R2DP-celler
- Smält pET-3a-plasmiden (se tabellen över material) med NdeI- och BamHI-restriktionsenzymer i Digest Buffer (se Materialtabellen). Tillsätt 4 μL digestbuffert, 33 μL 100 ng/μL plasmid och 1,5 μL av varje restriktionsenzym i en total reaktionsvolym, 33 μL 100 ng/μL plasmid och 1,5 μL av varje restriktionsenzym och låt reaktionen fortsätta i ~2 timmar tills den är klar vid 37 °C.
- Utför en PCR-reaktion på MMP-3cd-sekvensen för att sätta in en N-terminal His-tag. Använd 25 μL PCR Mix (se materialtabellen), 2,5 μL 10 μM-primers (kompletterande figur S1) och 1,25 μL i 100 ng/μL-skärsekvensen. Tillsätt sterilt vatten till en slutlig reaktionsvolym på 50 μL.
- Kör PCR-produkten och smält vektor på en 1% agarose gel. Rena gelbanden med hjälp av ett Gel Recovery Kit (se materialtabellen) enligt tillverkarens protokoll.
- Klona den förstärkta PCR-produkten i den smälta vektorn mellan NdeI- och BamHI-begränsningsplatserna med hjälp av DNA Assembly Mix (se tabellen över material). Använd onlineverktyg för att bestämma den önskade volymen av skär- och skärvektorn för en total reaktionsvolym på 15 μL.
- Tina upp en 50 μL alikvot med högomvandlingseffektivitetsceller (se materialtabellen) på is tills den tinas upp. Förkrigstidens SOC Growth Medium (se materialtabellen) till 37 °C och LB-ampicillinplattor (LB Amp) (se materialtabellen).
- Tillsätt 1-2 μL av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-monteringsreaktionen på 50 μL alikvoten. Inkubera på is i 30 min.
- Värmechocka cellerna genom inkubation vid 42 °C i 30 s. Inkubera på is i 2 min.
- Tillsätt 950 μL SOC-tillväxtmedium till varje transformantblandning. Skaka i 1 h vid 250 varv/min och 37 °C.
- Platta 100 μL av transformanterna på LB Amp-plattor och inkubera över natten vid 37 °C.
- Inokulera varje isolerad koloni i 10 ml LB Amp medium. Skaka över natten vid 250 varv/min och 37 °C.
- Extrahera plasmid-DNA enligt tillverkarens protokoll för miniprep-satsen (se tabellen över material). Bekräfta konstruktionssekvensen med T7 framåt- och bakåtprimrar (kompletterande figur S1).
OBS: PET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd konstruktion DNA kan lagras vid -20 °C. När du är klar fortsätter du med omvandlingen till R2DP-celler. - Tina en 20 μL alikvot R2DP-celler (se materialtabellen) på is i 2-5 minuter. Förkrigstidens SOC-tillväxtmedium till rumstemperatur och LB Amp CamR-plattor till 37 °C (se materialtabellen).
- Tillsätt 1 μL 100 ng/μL sekvensbekräftat pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd till 50 μL alikvot. Rör försiktigt för att blanda och återför röret till is.
- Inkubera röret på is i 5 min.
- Värmechocka cellerna genom att inkubera vid 42 °C i exakt 30 s. Skaka inte.
- Placera cellerna på is i 2 min.
- Tillsätt 80 μL SOC-medium i rumstemperatur till transformantblandningen. Skaka i 1 h vid 250 varv/min och 37 °C.
- Plätera transformanterna på LB Amp CamR-plattorna och inkubera över natten vid 37 °C.
- Tillväxt och induktion
- Inokulera en enda, isolerad koloni av R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd transformant från en LB Amp CamR-platta i 10 ml LB Amp CamR-media vid 37 °C. Skaka vid 250 varv/min över natten (~16 h). Spara alikvoter från varje kultur och förbered 40% (v/v) glycerol (se tabellen över material) lager om så önskas.
- Per nattkultur, inokulera en 1 L-kolv som innehåller 500 ml LB Amp CamR-medium till en optisk densitet vid 600 nm (OD600) på 0,05-0,1.
OBS: Detta bör återföra cellerna till logaritmisk tillväxt. - Mät OD600 vid flera tidpunkter, vanligtvis i 3-4 timmar, tills den faller mellan 0,4 och 0,6.
- Före induktion, aliquot en bråkdel av kulturen i ett 1,5 mL mikrofuge rör (se tabellen av material) och märka det Un-inducerad Fraktion. Förvara den vid -80 °C för gelanalys. Om du inte kör en SDS-PAGE-gel hoppar du över det här steget och fortsätter till steg 1.2.5.
- Inducera kulturerna till en slutlig koncentration av 1 mM med hjälp av 1 M isopropyl-ß-D-tiogalactopyranoside (IPTG) lager (se tabellen över material). Fortsätt att inkubera i 37 °C shaker i ytterligare 3-4 h.
OBS: Under uttrycket bör läsaren bestämma den optimala OD600 vid tidpunkten för induktion och IPTG-koncentrationen. Om avkastningen sjunker avsevärt efter rening kan imidazolkoncentrationen i reningsbuffertar kräva justering, eller cellpelleten kan behöva soniceras ytterligare. - Innan du centrifugerar kulturerna, aliquot en bråkdel av kulturen i en andra 1,5 mL microfuge rör och märka det inducerad fraktion. Förvara den vid -80 °C för gelanalys. Om du inte kör en SDS-PAGE-gel hoppar du över det här steget och fortsätter till steg 1.2.7.
- Centrifugera cellkulturen i koniska flaskor på 250 ml (se materialtabellen) med maximal hastighet och 4 °C i 10 minuter.
- Upprepa steg 1.2.7 tills kulturerna är helt pelleterade.
OBS: PAUS: Cellpellets kan frysas vid -80 °C och tinas senare för vidare bearbetning. Annars hoppar du över det här steget och fortsätter till steg 1.3.1.
- Inklusion kropps extraktion och solubilization
OBS: Förbered färsk 10 M urea, helst inte tidigare än en dag i förväg, rör om ordentligt tills den är helt upplöst. Värm eller autoklava urea; förvara den i rumstemperatur.- Återanvänd pelleten (från steg 1.2.8) i lysbuffert (se materialförteckningen). Per gram pellet, tillsätt 3 ml lysbuffert och återanvänds genom virvel eller pipettering. Skaka över natten vid 4 °C.
- Tillsätt 1,25 ml 10 % (w/v) natriumdeoxikolat (se materialtabellen) per 1 L kultur. Skaka vid rumstemperatur i 30 min vid 150 varv/min.
- Tillsätt 10 μL DNase I (se materialtabellen) per 1 L kultur. Skaka vid rumstemperatur i 30 min vid 150 varv/min.
- Centrifug i 10 min vid 13 000 × g och 4 °C.
- Avsätt en bråkdel av Lysed MMP för gelanalys. Förvara den vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 1.3.6.
OBS: Efter centrifugering kan pelleten vara sträng och inte kompakt packad, vilket gör det riskabelt att kassera supernatanten. Om så är fallet hoppar du över steg 1.3.6 och fortsätter till steg 1.3.7. - Kassera supernatanten från de centrifugerade proverna.
OBS: Protokollet kan pausas vid denna punkt och cellpelletsen frysas vid -80 °C och tinas senare. Annars hoppar du över det här steget och fortsätter till steg 1.3.7. - Återanvänd pelleten i 100 mL/L-kulturen av Inclusion Body Buffer (se materialtabellen) genom pipettering upp och ner.
- Under ultraljudsbehandling, håll proverna på is för att förhindra överhettning. Sonikera varje prov i 6 cykler av 15 s, utgång 5 och 50% puls. Tillåt 15 s viloperioder för kylning mellan cykler.
OBS: Överför vid behov proverna till koniska rör på 50 ml för ytterligare centrifugering (se materialförteckningen). Centrifug i 10 min vid 13 000 × g och 4 °C. - Avsätt en bråkdel av Sonicated MMP för gelanalys. Förvara den vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 1.3.11.
- Kolla pelleten. Upprepa steg 1.3.8-1.3.10 om det är strängt. Om pelleten är kompakt, kassera supernatanten och fortsätt till steg 1.3.12.
OBS: Ultraljudsbehandling i inklusion kroppsbuffert kan upprepas för att återvinna mer protein från lysade cell skräp. För mycket ultraljudsbehandling kan dock orsaka skjuvning, vilket skadar MMP avkastning. Protokollet kan pausas i detta skede, och cellpelletsen kan frysas vid -80 °C och tinas senare. - Återanvänd varje pellet från en 1 L-kultur i 5 ml solubiliseringsbuffert (se materialtabellen) genom pipettering. Inkubera i minst 30 minuter på is så att proteinerna kan solubiliseras.
- Avsätt en bråkdel av Solubilized MMP för gelanalys. Förvara den vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 1.3.14.
- Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 13 000 × g och 4 °C. KASSERA INTE SUPERNATANTEN.
- Om en pellet bildas/förblir efter centrifugering, häll supernatanten i ett separat koniskt rör på 50 ml. Återanvänd pelleten i ytterligare 5 ml solubiliseringsbuffert (per 1 L kultur) genom att pipettera upp och ner.
- Centrifug i 10 min vid 13 000 × g och 4 °C. KASSERA INTE SUPERNATANTEN.
- Upprepa steg 1.3.13 och 1.3.14 tills lite eller ingen pellet bildas efter centrifugering eller endast grå fällning återstår. Slå ihop supernatanterna. Kassera eller förvara pelleten vid -80 °C för ytterligare ultraljudsbehandling.
2. MMP rening och omveckning
- His-tag (HT) affinitetsrening
- Fyll en gravitationsflödeskolonn (se materialtabellen) med välblandat Ni-NTA-harts (se materialtabellen) enligt tillverkarens protokoll. Låt hartset sätta sig och separeras från lagringsbufferten så att en distinkt linje bildas mellan de två skikten.
OBS: Låt aldrig hartset torka, eftersom luft tränger in i hartset och skadar proteinutbytet. Mellan användningarna, utför den hartsregenereringsprocedur som beskrivs i avsnitt 2.2. - Låt lagringsbufferten tömmas. Fyll kolonnen med två hartsbäddsvolymer HT-jämviktsbuffert.
- Töm HT-jämviktsbufferten och kassera den. När kolonnen dräneras, centrifugera proteinextraktet vid 13 000 × g i 1 min och filtersterilisera med ett 0,22 μm-filter (se materialtabellen).
- Byt avfallsbehållaren mot ett koniskt rör på 50 ml märkt HT Flowthrough. Tillsätt det beredda proteinextraktet i kolonnen.
- Applicera flödesgenomring för att maximera bindningen igen.
- Avsätt en bråkdel av Flowthrough Fraction för gelanalys. Förvara den vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 2.1.7.
- Tvätta omedelbart hartset med 15 ml HT-tvättbuffert (se materialtabellen). Samla genomströmningen i koniska rör på 15 mL (se materialregistret) märkt HT Wash.
OBS: Absorbansvärden vid 280 nm (A280) erhölls via spektrofotometri och användes tillsammans med molekylvikts- och utrotningskoefficienten, ε, för att uppskatta proteinkoncentrationerna. För denaturerad Hisx6-pro-MMP-3cd är molekylvikten 29,86 kDa och ε är 34,38 M-1 cm-1. - Blanking mot HT Wash Buffer, mät och registrera A280. Upprepa steg 2.1.7 och 2.1.8 med ytterligare tvättfraktioner. När A280 närmar sig baslinjen och föroreningarna har minimerats, fortsätt till steg 2.1.9.
- Avsätt en bråkdel av Wash Fraction för gelanalys. Upprepa för flera tvättfraktioner. Förvara fraktionerna vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 2.1.10.
- Elute omedelbart His-taggade proteiner genom att tillsätta 5 ml HT Elution Buffer (se tabellen över material). Samla genomströmningen som 0,5-1 ml-fraktioner i mikrofugerör märkta HT Elution.
- Avsätt en bråkdel av Elution Fraction för gelanalys. Upprepa för flera elutionsfraktioner. Förvara fraktionerna vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 2.1.12.
- Om A280 är >0,3 mg/ml, späd fraktionen med HT-jämviktsbuffert (se materialförteckningen).
OBS: Den eliserade fraktionen måste spädas ut till en A280 på 0,3 mg/ml eller mindre för att förhindra utfällning under dialys. Protokollet kan pausas här och de poolade fraktionerna frysas vid -80 °C och tinas senare. Annars hoppar du över det här steget och fortsätter till steg 2.2.1.
- Fyll en gravitationsflödeskolonn (se materialtabellen) med välblandat Ni-NTA-harts (se materialtabellen) enligt tillverkarens protokoll. Låt hartset sätta sig och separeras från lagringsbufferten så att en distinkt linje bildas mellan de två skikten.
- Regenerering av harts
- Tvätta hartset med tio hartsbäddsvolymer HT Regeneration Buffer (se materialregistret) och tio hartsbäddsvolymer sterilt vatten.
- Förvara hartset som en 50% slam i 20% (v/v) etanol i vatten.
3. Protein omveckning
OBS: För mindre volymer kan dialyskassetter användas med lägre risk för provförlust. Dialysslangar krävs om större volymer används (se materialtabellen).
- Dialys
OBS: Den optimala proteinkoncentrationen för dialys är ~0,3 mg/ml. Om betydande nederbörd uppstår under dialys, minska ureakoncentrationsgradienten mellan varje dialys med hjälp av en stegvis dialysmetod och lägg till fler mellanliggande steg (t.ex. från 6 M till 5 M och sedan 5 M till 4 M, i stället för att hoppa över 5 M-stadiet). Eftersom frys-tina cykler skadar cellulära och protein struktur, det är viktigt att minimera pauser i protokollet.- Enligt tillverkarens protokoll, använd lämplig mängd dialysrör enligt volymen elutionfraktionsprover .
- Dränk de eluterade MMP-fraktionerna i dialysrör i 1 L dialysbuffert 1 (se materialtabellen). Rör om slangen och dess innehåll på en magnetomrörare i minst 8 timmar vid 4 °C.
- Överföring till 1 L dialysbuffert 2 (se materialförteckningen). Rör om slangen och dess innehåll på en magnetomrörare i minst 8 timmar vid 4 °C.
- Överföring till 1 L dialysbuffert 3 (se materialtabellen). Rör om slangen och dess innehåll på en magnetomrörare i minst 8 timmar vid 4 °C.
- Överför provet till nya koniska rör på 50 ml och märka dem som Dialyzed MMP.
- Undersök röret för eventuell fällning. Om fällning har bildats, centrifugera provet i 1 min vid 13 000 × g och 4 °C.
- Överför supernatanten till nya 15 ml koniska rör och märka dem som Refolded MMP.
- Avsätt en fraktion för gelanalys och märk den som Refolded MMP. Förvara den vid -80 °C. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 3.1.9.
OBS: Om avkastningen är låg kan fällningen lösas upp i HT-jämviktsbufferten och stegen i avsnitt 3.1 upprepas med dialysrör. Om gelanalys inte ska utföras eller om protokollet måste pausas här, frys proverna vid -80 °C och tina upp dem senare. Om avkastningen ligger i önskat intervall, fortsätt till steg 3.2.1.
- Rekognosering
OBS: Utrotningskoefficienterna för omveckade och denaturerade Hisx6-pro-MMP-3cd förväntas vara desamma; Därför påverkas inte A280-beräkningarna.- Rekomplera provet upp till 0,5 mg/ml. Använd en 400 ml omrörd cell (se tabellen över material) för att koncentrera provet till 15 ml. För att förhindra skumning, använd ett 50 ml rekognoreringsrör för att koncentrera dig ytterligare om det behövs.
OBS: Om en fällning bildas kan den pelleteras och lösas upp i HT-jämviktsbuffert. Upprepa sedan avsnitten 3.1 och steg 3.2.1. Fortsätt i annat fall att stega 3.2.2. - Avsätt en fraktion för gelanalys och märk den som Koncentrerad MMP.
OBS: Protokollet kan pausas här och proverna frysas vid -80 °C och tinas senare.
- Rekomplera provet upp till 0,5 mg/ml. Använd en 400 ml omrörd cell (se tabellen över material) för att koncentrera provet till 15 ml. För att förhindra skumning, använd ett 50 ml rekognoreringsrör för att koncentrera dig ytterligare om det behövs.
4. Aktivering
- Aktivering av 4-aminofenylmerkursyraacetat (APMA)
OBS: APMA är mycket giftigt. Gör en ny lagerlösning på 20 mM APMA före aktivering och arbeta alltid under en rökhuv när du använder APMA. Kasta APMA-avfallet i behållaren.- Tillsätt 50 μL 20 mM APMA (se tabellen) för att uppnå en slutlig APMA-koncentration på 1 mM per 1 mL alikvot (1 mg/ml). Inkubera över natten vid 37 °C.
- Om en fällning bildas, centrifugera den med maximal hastighet i 10 min vid 4 °C. Förvara supernatanten i ett 1,5 mL mikrobränslerör märkt Activated MMP. Kassera fällningen i en behållare märkt för APMA-avfall.
- Avsätt en fraktion för gelanalys och märk den aktiverad MMP.
OBS: Protokollet kan pausas här och proverna frysas vid -80 °C och tinas senare. Om du inte utför gelanalys, fortsätt till steg 4.2.1. Efter aktivering är molekylvikten och utrotningskoefficienten för MMP-3cd 19,40 kDa respektive 28,42 M-1 cm-1.
- Avsaltning
- Ta bort APMA från det aktiverade MMP-3cd-provet med en 2 ml avsaltningskolonn (se tabellen över material) enligt tillverkarens protokoll.
- Avsätt en fraktion för gelanalys och märk den Avsaltad MMP. Förvara den vid -80 °C. Om gelanalysen inte utförs, fortsätt till avsnitt 4.3 med de återstående proverna.
OBS: Protokollet kan pausas här och proverna frysas vid -80 °C och tinas senare.
- Köra SDS-PAGE-gelerna
- Kör alla proteinfraktioner på SDS-PAGE geler: Un-inducerad fraktion, inducerad fraktion, lyserad MMP, Sonicated MMP, Solubilized MMP, Flowthrough Fraction, Wash Fraction, Elution Fraction, Refolded MMP, Concentrated MMP, Activated MMP och Desalted MMP.
- Långtidslagring av MMP-3
- Tillsätt 0,05% (v/v) nonioniskt tensid (se tabellen över material) till de avsaltade MMP-3cd-proverna och förvara dem vid -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När prover körs på SDS-PAGE, eftersom proteinet uttrycks i form av olösliga inklusionskroppar, bör de lyserade och sonicated fraktionerna innehålla lite eller ingen Hisx6-pro-MMP-3cd extrakt, eftersom proteinet ännu inte har resolubilized i urea. Figur 3 jämför his-tag reningsaljonerna av Hisx6-pro-MMP-3cd från BL21(DE3) celler och R2DP-celler. Elution fraktioner poolades separat för både BL21(DE3) och R2DP celler före dialys. Fraktioner från varje steg kördes efter att proteinerna avsaltats (figur 4). Alla Hisx6-pro-MMP-3cd-prover visar ett band på cirka 30 kDa, och aktiva MMP-3cd visar ett band på cirka 20 kDa när his-tag och pro-domän tas bort (figur 4 och kompletterande figur S1).
Det totala utbytet av protein i mg/L av E. coli-odlingen fastställdes efter rening och avsaltning av BL21(DE3) och R2DP-kulturer (tabell 1). Användning av R2DP-celler ger betydligt högre nivåer av MMP-uttryck. Medan vanliga BL21(DE3) celler gav endast 3,5 mg renad Hisx6-pro-MMP-3cd per liter kultur, producerade R2DP-celler 45 mg /L kultur. På samma sätt ökade avkastningen av funktionella, avsaltade MMP-3cd från 0, 13 mg/L-odling till 6,2 mg/L-odling för BL21(DE3) respektive R2DP-celler. Mänsklig pro-MMP-3cd överväldigar cellulära maskiner i standard BL21 (DE3) stam på grund av dess storlek (cirka 30 kDa) och de utarbetade posttranslational modifieringar som krävs som är exklusiva för eukaryoter. R2DP-stammarna är BL21(DE3) derivat, utformade för att förbättra uttrycket av eukaryota proteiner. R2DP-stammen bär tRNAs för AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC och CGG, som sällan används i E.coli men rikligt i pro-MMP-3cd DNA-sekvensen. Detta är potentiellt en nyckelfaktor i de ökade nivåerna av proteinuttryck som observerats i R2DP-celler.
Figur 3: SDS-PAGE gel analys av Hisx6-pro-MMP-3cd uttryck i BL21(DE3) och R2DP celler. (A) De första åtta elutionsfraktionerna av Hisx6-pro-MMP-3cd i BL21(DE3) celler. (B) De första åtta elutionsfraktionerna av Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP-celler. Efter extraktion och solubilization av MMP införande organ i urea, Hisx6-pro-MMP-3cd prover renades genom Ni-NTA kromatografi kolonn med hjälp av batch-gravitation flöde. Geler trunkeras för att bara visa elutionsfraktionerna. Inledningsvis, på grund av höga koncentrationer av protein, är fraktioner 1-5 1 ml. Senare fraktioner (6-8) är mellan 5 och 8 ml vardera. Hisx6-pro-MMP-3cd bandet observeras vid ~30 kDa. Förkortningar: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domän; SDS-PAGE = natrium dodekylsulfat polyakrylamid gel elektrofores; Ni-NTA = nickel-nitrilotriacetic syra; FT = genomströmning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Proteolytisk klyvning av His-tag och pro-domän vid aktivering av MMP-3cd. De inducerade, ombyggda, koncentrerade, aktiverade och avsaltade fraktionerna av MMP-3cd i R2DP-celler visas. Efter dialys koncentreras Hisx6-pro-MMP-3cd och aktiveras med APMA. Vid aktivering är molekylvikten för det aktiverade MMP-3cd-bandet cirka 20 kDa, i motsats till den his-märkta zymogenen, som förblir vid ~ 30 kDa. Föroreningar avlägsnas i aktiverings- och avsaltningsstadierna. Förkortningar: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domän; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Stadier | BL21(DE3) celler | R2DP-celler | ||||
| Volym (mL) | Koncentration (mg/ml) | Avkastning (mg/L-kultur) | Volym (mL) | Koncentration (mg/ml) | Avkastning (mg/L-kultur) | |
| Rening | 23 | 0.30 | 3.5 | 42 | 2.1 | 45 |
| Avsaltning | 1.5 | 0.17 | 0.13 | 72 | 0.17 | 6.2 |
Tabell 1: Tabell över volymer och koncentrationer över stadier av MMP-3cd-rening. Hisx6-pro-MMP-3cd uttrycktes antingen i 2 L av en kultur av BL21 (DE3) eller i 2 L av R2DP celler. Volym, koncentration och utbyte (mg per liter) odling rapporteras för BL21(DE3) och R2DP celler. Avkastning (mg per liter kultur) erhölls genom att dividera det totala utbytet av protein (mg) som erhållits efter volym av odling, vilket var 2 L för både BL21(DE3) och R2DP fall. Proteinmängder avkastning rapporteras för två steg: Hisx6-pro-MMP-3cd efter Hisx6-tagg rening och aktiv MMP-3cd efter avsaltning.
Kompletterande figur S1: Sekvenser av T7-primers och MMP-3cd-protein före och efter aktivering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den storskaliga produktionen av lösliga, mänskliga, rekombinanta MMPs är fortfarande en utmanande uppgift. Däggdjursceller kan uttrycka funktionella MMPs till höga kostnader och långa väntetider, medan E. coli snabbt producerar stora mängder MMP-inneslutningsorgan som måste renas och omveckas11,16. R2DP-celler ökar avsevärt utbytet av MMP-inklusionsorgan, vilket möjliggör en mer kostnadseffektiv och produktiv MMP-omveckningsprocess. E. coli saknar dock de posttranslational maskiner som behövs för att vika MMPs, och även om konstruerade stammar visar kraftigt förbättrade uttrycksnivåer, är endast vissa intermediärer korrekt vikta på denaturant borttagning4. Följaktligen förväntas tillfällig nederbörd av penningmarknadsfonder fortfarande under omveckning och aktivering. Dessa resultat visar att en betydande del av renad Hisx6-pro-MMP-3cd avkastning går förlorad efter omveckning, aktivering och avsaltning.
Dessa steg kan optimeras ytterligare genom att lägga till fler dialysstadier tillsammans med testkoncentrationer av MMP-3cd och APMA. Men per liter kultur är utbytet av funktionella MMP-3cd 49-faldigt högre i R2DP-celler än BL21(DE3) celler. Dessutom ökade andelen funktionella, avsaltade MMP-3cd som återvunnits från renade Hisx6- pro-MMP-3cd från 3,7% för BL21(DE3) celler till 14% för R2DP-celler. Därför erbjuder R2DP-celler ett livskraftigt alternativ till nuvarande MMP-produktionsalternativ, såsom uttryck i däggdjursceller, som erbjuder mer konkurrenskraftiga utbyten per liter kultur.
Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för att uttrycka och rena Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP E. coli celler, tillsammans med aktivering och omveckning av MMP-3cd. Eftersom protokollet tar flera dagar att slutföra är noggrann planering avgörande för att minimera förlusten av funktionella MMPs på grund av flera frys-tina cykler. Eftersom R2DP-celler är den viktigaste förbättringen i den här metoden är det av största vikt att optimera uttrycksutbytet, eftersom stora mängder kan gå förlorade genom omveckning och aktivering. Under uttrycket bör operatören bestämma den optimala OD600 - och IPTG-koncentrationen före induktion. Efter his-tag rening, om avkastningen sjunker avsevärt, då harts kan behöva regenereras eller ersättas, eller cellpelleten kan behöva sonicated ytterligare.
Om betydande nederbörd uppstår under dialys, minska förändringarna i ureakoncentrationen mellan stadierna i stegvis dialys genom att lägga till fler steg (t.ex. från 6 M till 5M och sedan 5 M till 4 M, snarare än att hoppa över 5 M-stadiet). När de har omveckats, och särskilt efter aktivering, är MMPs betydligt mer benägna att nederbörd eller nedbrytning genom autoproteolys17. Efter att pH- och saltkoncentrationerna av alla buffertar har optimerats och önskade tester har utförts, bör alla steg efter dialys slutföras skyndsamt.
Ökad uppmärksamhet mot MMPs som potentiella mål för terapeutiska har uppfyllts med snabba innovationer inom proteinteknik för att förbättra bindning, hämning och selektivitet av MMP therapeutics9. Följaktligen blir en gång ambitiösa framtidsutsikter inom området MMP-terapier ständigt mer uppnåeliga6. Behovet av snabba, tillförlitliga metoder för att återställa lösliga, aktiva mmps kommer utan tvekan att bli mer nödvändigt med tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr. Evette Radisky och Alexandra Hockla vid Mayo Clinic i Jacksonville, Florida, för att tillhandahålla pET-3a-pro-MMP-3cd plasmid som mallen för kloning av Hisx6pro-MMP-3cd genen, och deras kommentarer, tillsammans med Dr. Paul Hartley från Nevada Genomics Center vid University of Nevada, Reno, för DNA-sekvensering. Författarna vill också tacka Cassandra Hergenrader för att hon hjälpte till med en del av proteinuttrycket. M.R.-S. Vill tacka NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience-stipendiet och UNR R&D mICRO SEED Grant Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging |
| 1 L Erlenmeyer flasks | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
| 1 L glass bottles | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
| 1.5 mL microfuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
| 18 G, 1-in. beveled needle | Amazon | B07S7VBHM2 | Used in combination with the dialysis casette |
| 2 mL desalting column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Removes APMA following activation |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
| 250 mL conical bottle cushions | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation |
| 250 mL conical bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
| 400 mL stirred cell | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit |
| 4-aminophenylmercuric acetate (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Activates MMP-3 by cleaving the propeptide |
| 5 mL syringe | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Used in combination with the dialysis casette |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Used for storage in many purification steps |
| 50 mL re-concentration tube | Sigma Aldrich | UFC901024D | Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media |
| BamHI | NEB | R3136S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Calcium chloride (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | The calcium ion stabilizes MMP structure |
| Cell spreaders | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Can be used to spread cells across a petri dish after transformation |
| Chloramphenicol | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media |
| Dialysis Buffer 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea. |
| Dialysis Buffer 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea. |
| Dialysis Buffer 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2. |
| Dialysis clips | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Used in combination with snakeskin dialysis tubing |
| Dialysis tubing | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss |
| Digest buffer | NEB | B7204S | Buffer used in digesting the pET3a vector |
| Disposable cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds |
| DNA assembly mix | NEB | E2621S | Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector |
| DNase I | NEB | M0303S | Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds |
| Gel recovery kit | Promega | A9281 | Isolates and purifies DNA from agarose gels |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C |
| Gravity flow column | BioRad | 7321010 | Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins |
| High-transformation efficiency cells | NEB | C2987 | High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct |
| HT Elution Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| HT Equilibration Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4 |
| HT Regeneration Buffer | n/a | n/a | 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0 |
| HT Wash Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Used to pH buffers |
| Imidazole | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein |
| Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C |
| LB Amp CamR media | n/a | n/a | To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Amp CamR plates | n/a | n/a | To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride |
| Lysis Buffer | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0 |
| Lysozyme | MP Biomedicals | 195303 | Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls |
| Miniprep kit | Promega | A1330 | If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants |
| NdeI | NEB | R0111S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Ni-NTA resin | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole |
| Nonionic surfactant | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity. |
| PCR mix | NEB | M0492S | A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector |
| pET plasmid | Addgene | n/a | The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | Used for plating transformants on LB agar media |
| R2DP cells | Novagen | 714033 | BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli |
| SOC growth media | NEB | B9020S | Non-selective growth media for rapid growth during transformation |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Used in buffers and helps with protein stability |
| Sodium deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls |
| Solubilization Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Detergent used for cell lysis |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure |
| Zinc chloride (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3 |
References
- Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).
- Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).
- Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).
- Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).
- Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313 (2020).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
- Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
- Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
- Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
- Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
- Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
- Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
- Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).
- McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
- Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).
- Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).
- Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).
