Summary
Hans-tag rensing, dialyse og aktivering brukes til å øke utbyttet av løselig, aktiv matrise metalloproteinase-3 katalytisk domene protein uttrykk i bakterier. Proteinfraksjoner analyseres via SDS-PAGE geler.
Abstract
Matrix metalloproteinaser (MLP)-er tilhører familien av metzincinproteaser med sentrale roller i ekstracellulær matrise (ECM) nedbrytning og ombygging, samt interaksjoner med flere vekstfaktorer og cytokiner. Overekspressering av spesifikke MMP-er er ansvarlig i flere sykdommer som kreft, nevrodegenerative sykdommer og kardiovaskulær sykdom. MMP-er har vært sentrum for oppmerksomheten den siste tiden som mål om å utvikle terapeutiske behandlinger som kan behandle sykdommer som er korrelert med MMP-overekspression.
For å studere MMP-mekanismen i løsning, er det nødvendig med mer facile og robuste rekombinante proteinuttrykk og rensemetoder for produksjon av aktive, oppløselige MMP-er. Det katalytiske domenet til de fleste MMP-er kan imidlertid ikke uttrykkes i Escherichia coli (E. coli) i løselig form på grunn av mangel på posttranslasjonsmaskineri, mens pattedyruttrykkssystemer vanligvis er kostbare og har lavere utbytter. MMP-inkluderingsorganer må gjennomgå den kjedelige og arbeidskrevende prosessen med omfattende rensing og omfolding, noe som reduserer utbyttet av MMP-er betydelig i innfødt konformasjon. Dette dokumentet presenterer en protokoll ved hjelp av Rosetta2(DE3)pLysS (heretter referert til som R2DP) celler for å produsere matrise metalloproteinase-3 katalytisk domene (MMP-3cd), som inneholder en N-terminal His-tag etterfulgt av pro-domene (Hisx6-pro-MMP-3cd) for bruk i affinitetsrensing. R2DP-celler forbedrer uttrykket av eukaryote proteiner gjennom en kloramfenikolresistent plasmid som inneholder codons som normalt er sjeldne i bakterielle uttrykkssystemer. Sammenlignet med den tradisjonelle cellelinjen for rekombinant proteinuttrykk, BL21 (DE3), forbedret rensing ved hjelp av denne nye stammen utbyttet av renset Hisx6-pro-MMP-3cd. Ved aktivering og avsalting er pro-domenet spaltet sammen med N-terminalen His-tag, og gir aktiv MMP-3cd for umiddelbar bruk i utallige in vitro-applikasjoner . Denne metoden krever ikke dyrt utstyr eller komplekse fusjonsproteiner og beskriver rask produksjon av rekombinante menneskelige MMP-er i bakterier.
Introduction
De fleste komplekse eukaryote proteiner gjennomgår forseggjorte posttranslasjonelle modifikasjoner etter uttrykk, noe som krever svært assistert proteinfolding og kofaktorer for å være funksjonelle1. Å produsere store mengder løselig humant protein i en bakteriell vert er fortsatt en betydelig utfordring på grunn av høye kostnader og mangel på robuste uttrykks- og rensemetoder, selv for mindre laboratorieforsøk2,3. MLP-er, humane endopeptidaser med stor molekylvekt, uttrykkes vanligvis som uoppløselige inklusjonslegemer når de uttrykkes i E. coli. Utvinning av løselige menneskelige MMP-er fører ofte til en arbeidskrevende, tidkrevende løsnings- og omfoldingsprosess4.
MMP-er har kritiske roller i både fysiologiske og patogene prosesser. Humane MMP-er er en familie på 23 sink endopeptidaser, kategorisert etter struktur og substratspesifisitet, og differensialt uttrykt til tross for et høyt bevart katalytisk domene5,6. MMP-er utskilles som inaktive zymogener, regulert via posttranslasjonell aktivering og deres endogene hemmere, vevshemmere av metalloproteinaser (TIMPs) 7,8,9,10. Selv om de først ble anerkjent for sin rolle i ECM-omsetning, har MMP-er også vært involvert i utvikling, morfogenese, vevsreparasjon og ombygging8. Dysregulering av MMP-er har særlig vært knyttet til kreft sammen med blant annet nevrodegenerative, kardiovaskulære og fibrotiske sykdommer.
Utviklingen av robuste MMP-produksjonsmetoder i stor skala er avgjørende for å sikre suksess for fremtidige studier av MMP-mekanismer gjennom biokjemiske og cellebaserte analyser. Ulike MMP-er har tidligere blitt uttrykt i bakterier11, inkludert Hisx6-taggede MMPer, uten å endre MMP-aktivitet12,13,14,15. Imidlertid inkluderer disse metodene kjedelige, lange trinn som kan være vanskelige å gjenskape.
Pattedyrceller kan også brukes til å uttrykke mange forskjellige menneskelige proteiner samtidig som de sikrer riktige posttranslasjonelle modifikasjoner16. Selv om pattedyruttrykkssystemet er et ideelt valg for å produsere rekombinante menneskelige proteiner med riktige postoversettelsesendringer, er de viktigste ulempene ved denne metoden innledende lave utbytter, kostbare vekstmedier og reagenser, lange tidslinjer for å nå stabile uttrykkslinjer og risiko for forurensning med andre arter som sopp eller bakterier2,11 . Videre gir MMP-produksjon i pattedyrcellelinjer urenheter fra tilknyttede cellulære proteiner som TIMPer eller fibronectins11. I motsetning til den langsomme celleveksten som observeres i pattedyrceller, tilbyr bakterieuttrykkssystemet storskala proteinproduksjon på kort tid sammen med enklere medier og vekstkrav. På grunn av mangel på andre assosierte cellulære proteiner (dvs. TIMPer) i bakterielle uttrykkssystemer, er aktive MMP-er ved høyere konsentrasjoner utsatt for nedbrytning gjennom autoproteolyse, noe som resulterer i dårlig MMP-utbytte17.
Dette dokumentet beskriver en detaljert metode for bakteriell uttrykk, rensing og aktivering av rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd ved hjelp av E. coli som uttrykksvert på grunn av sin overkommelige pris, enkelhet og suksess med å produsere høyere utbytter av MMPs2,3,18. Siden E. coli mangler protein folding maskiner og posttranslational behandling som kreves for rekombinante MMP og andre komplekse proteiner, mange E. coli stammer har blitt konstruert for å overvinne disse begrensningene, noe som gjør E. coli en mer egnet vert for uttrykk for rekombinant menneskelig MMP-3cd, 19,20 . For eksempel forbedrer R2DP-stammen som brukes i denne studien eukaryotisk uttrykk ved å levere en kloramfenikolresistent plasmid som inneholder codons som sjelden brukes i E. coli.
Som beskrevet i denne protokollen, etter overekspressering av relativt rene inklusjonslegemer fra pET-3a-vektoren (figur 1) i R2DP-celler, blir Hisx6-pro-MMP-3 katalytiske domene (MMP-3cd) proteiner ekstrahert og denaturert4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 ble renset ved hjelp av affinitetsmerkekromatografi. Ved omfolding og dialyse ble pro-MMP-3cd (zymogen) aktivert av 4-aminofenylmercuric acetat (APMA), og SDS-PAGE analyse brukes til å evaluere utbytter og behovet for ytterligere rensing5,21. Denne protokollen beskriver uttrykk, rensing og aktivering av løselig MMP-3cd som et eksempel. Det kan imidlertid også brukes som en veiledning for uttrykk for andre MMP-er og menneskelige proteaser med lignende uttrykk, og aktiveringsmekanismer (figur 2). For andre proteiner enn MMP-3cd anbefales leseren å bestemme optimale buffersammensetninger og metoder for deres målprotein før du prøver denne protokollen.
Figur 1: Plasmidkart over pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. PET-3a-vektoren inneholder et ampicillinresistensgen. En N-terminal Hisx6-tag-sekvens klones inn i den pET-3a-baserte vektoren, inkludert pro-MMP-3cd, for å gi pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruksjonen under kontroll av T7-promotoren mellom BamHI og NdeI-begrensningssteder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bakteriell uttrykk for pro-MMP-3cd, rensing, bretting og aktivering. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid ble forvandlet til BL21(DE3) eller R2DP Cells. 1.2: Pro-MMP-3cd proteinuttrykk ble indusert ved hjelp av IPTG. 1.3: Kjemisk lysis og sonikering brukes til å trekke ut Hisx6-pro-MMP-3cd proteiner som hovedsakelig er uoppløselige og finnes i inklusjonslegemene. Urea ble brukt til å denaturere og løse protein fra inklusjonslegemer. 2.1. Denaturert Hisx6-pro-MMP-3cd protein ble renset via affinitet kromatografi rensing. 3. Den eluted Hisx6-pro-MMP-3cd ble sakte omdelt under dialyse gjennom gradvis fjerning av urea fra bufferen. 4. Til slutt ble refoldet MMP-3cd protein aktivert ved hjelp av APMA ved å fjerne N-terminal pro-peptiddomenet. APMA fjernes senere fra løsningen gjennom avsalting. Tallene tilsvarer protokolldelene som beskriver disse trinnene. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domene; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MMP-uttrykk
- Kloning og transformasjon av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd til R2DP-celler
- Fordøye pET-3a plasmid (se materialtabellen) med NdeI- og BamHI-begrensningsenzymer i fordøyelsesbufferen (se materialtabellen). I et totalt reaksjonsvolum på 40 μL, tilsett 4 μL fordøyelsesbuffer, 33 μL 100 ng/μL plasmid og 1,5 μL av hvert begrensningsenzym og la reaksjonen fortsette i ~ 2 timer til ferdigstillelse ved 37 °C.
- Utfør en PCR-reaksjon på MMP-3cd-sekvensen for å sette inn en N-terminal His-tag. Bruk 25 μL PCR Mix (se materialtabellen), 2,5 μL 10 μM primere (tilleggsfigur S1) og 1,25 μL av 100 ng/μL innsatssekvens. Tilsett sterilt vann til et endelig reaksjonsvolum på 50 μL.
- Kjør PCR-produktet og fordøyd vektor på en 1% agarose gel. Rens gelbåndene ved hjelp av et Gel Recovery Kit (se materialtabellen) i henhold til produsentens protokoll.
- Klone det forsterkede PCR-produktet inn i den fordøyde vektoren mellom NdeI- og BamHI-begrensningsstedene ved hjelp av DNA Assembly Mix (se materialtabellen). Bruk nettbaserte verktøy for å bestemme det nødvendige volumet av innsatsen og kutte vektoren for et totalt reaksjonsvolum på 15 μL.
- Tin en 50 μL aliquot av høytransformasjonseffektivitetsceller (se materialtabellen) på is til den er tint. Prewarm SOC Growth Medium (se materialtabellen) til 37 °C og LB-ampicillin (LB Amp)-plater (se materialtabellen).
- Tilsett 1-2 μL av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd monteringsreaksjonen på 50 μL aliquot. Inkuber på is i 30 min.
- Varmsjokk cellene ved å inkubere ved 42 °C i 30 s. Inkuber på is i 2 min.
- Tilsett 950 μL SOC vekstmedium til hver transformantblanding. Rist i 1 time ved 250 o/min og 37 °C.
- Plate 100 μL av transformantene på LB Amp-plater og inkuber over natten ved 37 °C.
- Inokuler hver isolerte koloni i 10 ml LB Amp medium. Rist over natten ved 250 o/min og 37 °C.
- Trekk ut plasmid-DNA i henhold til produsentens protokoll for miniprepsettet (se materialtabellen). Bekreft konstruksjonens rekkefølge ved hjelp av T7 forover og bakoverprimere (tilleggsfigur S1).
MERK: PET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd konstruksjons-DNA kan lagres ved -20 °C. Når du er klar, fortsett med transformasjon til R2DP-celler. - Tin en 20 μL aliquot av R2DP-celler (se materialtabellen) på is i 2-5 min. Prewarm SOC vekst middels til romtemperatur og LB Amp CamR plater til 37 °C (se materialtabellen).
- Tilsett 1 μL 100 ng/μL sekvensbekreftet pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd til 50 μL aliquot. Rør forsiktig for å blande og returnere røret til is.
- Inkuber røret på is i 5 min.
- Varmsjokk cellene ved å inkubere ved 42 °C i nøyaktig 30 s. Ikke rist.
- Plasser cellene på is i 2 min.
- Tilsett 80 μL romtemperatur SOC-medium til transformantblandingen. Rist i 1 time ved 250 o/min og 37 °C.
- Plate transformantene på LB Amp CamR plater og inkuber over natten ved 37 °C.
- Vekst og induksjon
- Inokuler en enkelt, isolert koloni av R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd transformant fra en LB Amp CamR-plate i 10 ml LB Amp CamR-medier ved 37 °C. Rist ved 250 o/min over natten (~16 h). Lagre aliquots fra hver kultur og forberede 40% (v / v) glyserol (se tabellen over materialer) aksjer om ønskelig.
- Per nattkultur inokulerer du en 1 L kolbe som inneholder 500 ml LB Amp CamR medium til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) på 0,05-0,1.
MERK: Dette skal returnere cellene til logaritmisk vekst. - Mål OD600 på flere tidspunkter, vanligvis i 3-4 timer, til den faller mellom 0,4 og 0,6.
- Før induksjon, aliquot en brøkdel av kulturen inn i en 1,5 ml mikrofuge rør (se tabellen over materialer) og merke den Un-indusert fraksjon. Oppbevar den ved -80 °C for gelanalyse. Hvis du ikke kjører en SDS-PAGE gel, hopper du over dette trinnet og går videre til trinn 1.2.5.
- Induser kulturene til en endelig konsentrasjon på 1 mM ved hjelp av 1 M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) lager (se materialtabellen). Fortsett å inkubere i 37 °C shaker i ytterligere 3-4 timer.
MERK: Under uttrykket skal leseren bestemme den optimale OD600 på tidspunktet for induksjon og IPTG-konsentrasjonen. Hvis utbyttet faller betydelig etter rensing, kan imidazolkonsentrasjonen i rensebuffere kreve justering, eller cellepelleten må kanskje sonikeres ytterligere. - Før du sentrifugerer kulturene, aliquot en brøkdel av kulturen inn i en andre 1,5 ml mikrofuge rør og merke den indusert fraksjon. Oppbevar den ved -80 °C for gelanalyse. Hvis du ikke kjører en SDS-PAGE gel, hopper du over dette trinnet og går videre til trinn 1.2.7.
- Sentrifuger cellekulturen i 250 ml koniske flasker (se materialtabellen) ved maksimal hastighet og 4 °C i 10 minutter.
- Gjenta trinn 1.2.7 til kulturene er fullstendig pelleted.
MERK: PAUSE: Cellepellets kan fryses ved -80 °C og tines senere for videre behandling. Ellers hopper du over dette trinnet og går videre til trinn 1.3.1.
- Inkludering av kroppsekstraksjon og solubilisering
MERK: Forbered fersk 10 M urea, helst ikke tidligere enn en dag i forveien, rør grundig til den er helt oppløst. Ikke varm opp eller autoklaver urea; oppbevar den ved romtemperatur.- Bruk pelletsen på nytt (fra trinn 1.2.8) i lysisbufferen (se materialtabellen). Per gram pellet, tilsett 3 ml lysisbuffer og resuspend ved virveling eller pipettering. Rist over natten ved 4 °C.
- Tilsett 1,25 ml 10 % (m/v) natriumdeoksykolat (se materialtabellen) per 1 liter kultur. Rist ved romtemperatur i 30 min ved 150 o/min.
- Tilsett 10 μL DNase I (se materialtabellen) per 1 liter kultur. Rist ved romtemperatur i 30 min ved 150 o/min.
- Sentrifuge i 10 min ved 13.000 × g og 4 °C.
- Sett av en brøkdel av Lysed MMP for gelanalyse. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 1.3.6.
MERK: Etter sentrifugering kan pelletsen være streng og ikke kompakt pakket, noe som gjør det risikabelt å kaste supernatanten. Hvis dette er tilfellet, hopper du over trinn 1.3.6 og går videre til trinn 1.3.7. - Kast supernatanten fra de sentrifugede prøvene.
MERK: Protokollen kan settes på pause på dette punktet, og cellepellets frosset ved -80 °C og tines senere. Ellers hopper du over dette trinnet og går videre til trinn 1.3.7. - Resuspend pellet i 100 ml / l kultur av inkludering body buffer (se tabellen over materialer) ved pipettering opp og ned.
- Hold prøvene på is under sonikering for å forhindre overoppheting. Soniker hver prøve i 6 sykluser på 15 s, utgang 5 og 50% puls. La det være 15 hvileperioder for kjøling mellom sykluser.
MERK: Overfør om nødvendig prøvene til 50 ml koniske rør for ytterligere sentrifugering (se materialtabellen). Sentrifuge i 10 min ved 13.000 × g og 4 °C. - Sett til side en brøkdel av Sonicated MMP for gelanalyse. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 1.3.11.
- Sjekk pelletsen. Hvis den er streng, gjentar du trinn 1.3.8-1.3.10. Hvis pelletsen er kompakt, kast supernatanten og fortsett til trinn 1.3.12.
MERK: Sonikering i inklusjonstekstbufferen kan gjentas for å gjenopprette mer protein fra det lysede celleavfallet. For mye sonikering kan imidlertid forårsake skjæring, noe som skader MMP-utbyttet. Protokollen kan settes på pause på dette stadiet, og cellepellets kan fryses ved -80 °C og tines senere. - Resuspend hver pellets fra en 1 L kultur i 5 ml Solubilization Buffer (se materialtabellen) ved pipettering. Inkuber i minst 30 min på is for å la proteinene løse seg.
- Sett av en brøkdel av Solubilized MMP for gelanalyse. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 1.3.14.
- Sentrifuger cellene i 10 min ved 13 000 × g og 4 °C. IKKE KAST SUPERNATANTEN.
- Hvis en pellet dannes/forblir etter sentrifugering, hell supernatanten i et separat 50 ml kjeglerør. Resuspend pellet i en annen 5 ml Solubilization Buffer (per 1 L kultur) ved pipettering opp og ned.
- Sentrifuge i 10 min ved 13 000 × g og 4 °C. IKKE KAST SUPERNATANTEN.
- Gjenta trinn 1.3.13 og 1.3.14 til litt eller ingen pelletsformer etter sentrifugering eller bare grått bunnfall gjenstår. Samle supernatantene. Kast eller oppbevar pelletsen ved -80 °C for ytterligere sonikering.
2. MMP-rensing og omfolding
- Hans-tag (HT) affinitet rensing
- I henhold til produsentens protokoll fyller du en gravitasjonsstrømningskolonne (se materialtabellen) med godt blandet Ni-NTA-harpiks (se materialtabellen). La harpiksen slå seg ned og skille seg fra lagringsbufferen slik at en distinkt linje dannes mellom de to lagene.
MERK: La aldri harpiksen tørke, da luft vil trenge inn i harpiksen og skade proteinutbyttet. Mellom bruk, utfør harpiksregenereringsprosedyren som er beskrevet i pkt. 2.2. - La lagringsbufferen tømmes. Fyll kolonnen med to harpiks-seng volumer av HT Likevekt Buffer.
- Tøm HT-likevektsbufferen og kast den. Når kolonnen drenerer, sentrifugerer du proteinekstraktet ved 13 000 × g i 1 min og filtrerer steriliseres ved hjelp av et 0,22 μm filter (se materialtabellen).
- Bytt avfallsbeholderen mot et konisk rør på 50 ml merket HT Flowthrough. Tilsett det tilberedte proteinekstraktet i kolonnen.
- Bruk gjennomstrømningen på nytt for å maksimere bindingen.
- Sett til side en brøkdel av Flowthrough Fraction for gelanalyse. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 2.1.7.
- Vask straks harpiksen med 15 ml HT-vaskebuffer (se materialtabellen). Samle gjennomstrømningen i 15 ml koniske rør (se materialtabellen) merket HT Wash.
MERK: Absorbansverdier ved 280 nm (A280) ble oppnådd via spektrofotometri og brukt sammen med molekylvekt og utryddelseskoeffisient, ε, for å estimere proteinkonsentrasjoner. For denaturert Hisx6-pro-MMP-3cd er molekylvekten 29,86 kDa, og ε er 34,38 M-1 cm-1. - Blanking mot HT Wash Buffer, mål og registrer A280. Gjenta trinn 2.1.7 og 2.1.8 med ekstra vaskefraksjoner. Når A280 nærmer seg baseline og urenheter er minimert, går du videre til trinn 2.1.9.
- Sett til side en brøkdel av Wash Fraction for gelanalyse. Gjenta for flere vaskefraksjoner. Oppbevar brøkene ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 2.1.10.
- Eliuter umiddelbart hismerkede proteiner ved å tilsette 5 ml HT Elution Buffer (se materialtabellen). Samle gjennomstrømningen som 0,5-1 ml fraksjoner i mikrofunksjonsrør merket HT Elution.
- Sett til side en brøkdel av Elution Fraction for gelanalyse. Gjenta for flere elutionfraksjoner. Oppbevar brøkene ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 2.1.12.
- Hvis A280 er >0,3 mg/ml, fortynn fraksjonen med HT-likevektsbuffer (se materialtabellen).
MERK: Den eluterte fraksjonen må fortynnes til en A280 på 0,3 mg/ml eller mindre for å forhindre nedbør under dialyse. Protokollen kan settes på pause her og de samlede fraksjonene frosset ved -80 °C og tines senere. Ellers hopper du over dette trinnet og går videre til trinn 2.2.1.
- I henhold til produsentens protokoll fyller du en gravitasjonsstrømningskolonne (se materialtabellen) med godt blandet Ni-NTA-harpiks (se materialtabellen). La harpiksen slå seg ned og skille seg fra lagringsbufferen slik at en distinkt linje dannes mellom de to lagene.
- Resin regenerering
- Vask harpiksen med ti harpiks-seng volumer av HT Regenerering Buffer (se materialbordet) og ti harpiks-seng volumer av sterilt vann.
- Oppbevar harpiksen som en 50% slurry i 20% (v / v) etanol i vann.
3. Proteinfolding
MERK: For mindre volumer kan dialysekassetter brukes med lavere risiko for prøvetap. Dialyseslange er nødvendig hvis større volumer brukes (se materialtabellen).
- Dialyse
MERK: Den optimale proteinkonsentrasjonen for dialyse er ~ 0,3 mg / ml. Hvis det oppstår betydelig nedbør under dialyse, reduser ureakonsentrasjonsgradienten mellom hver dialyse ved hjelp av en trinnvis dialysemetode og legg til flere mellomtrinn (f.eks. fra 6 M til 5 M, og deretter 5 M til 4 M, i stedet for å hoppe over 5 M-fasen). Ettersom fryse-tine sykluser skader den cellulære og proteinstrukturen, er det viktig å minimere pauser i protokollen.- I henhold til produsentens protokoll, bruk riktig mengde dialyseslange i henhold til volumet av Elution Fraction-prøver .
- Senk de eluterte MMP-fraksjonene ned i dialyserør i 1 L dialysebuffer 1 (se materialtabellen). Rør slangen og innholdet på en magnetisk omrører i ikke mindre enn 8 timer ved 4 °C.
- Overfør til 1 L dialysebuffer 2 (se materialtabellen). Rør slangen og innholdet på en magnetisk omrører i ikke mindre enn 8 timer ved 4 °C.
- Overfør til 1 L dialysebuffer 3 (se materialtabellen). Rør slangen og innholdet på en magnetisk omrører i ikke mindre enn 8 timer ved 4 °C.
- Overfør prøven til nye koniske rør på 50 ml og merk dem som Dialyzed MMP.
- Undersøk røret for eventuelle bunnfall. Hvis det har dannet seg bunnfall, sentrifugerer du prøven i 1 min ved 13 000 × g og 4 °C.
- Overfør supernatanten til nye koniske rør på 15 ml og merk dem som Refolded MMP.
- Sett til side en brøkdel for gelanalyse og merk den som Refolded MMP. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, fortsett til trinn 3.1.9.
MERK: Hvis utbyttet er lavt, kan bunnfallet oppløses i HT-likevektsbufferen og trinn i pkt. 3.1 som gjentas med dialyserør. Hvis gelanalyse ikke skal utføres, eller hvis protokollen må settes på pause her, fryser du prøvene ved -80 °C og tiner dem senere. Hvis avkastningen er i ønsket område, går du videre til trinn 3.2.1.
- Rekonsentrasjon
MERK: Utryddelseskoeffisientene for refolded og denaturert Hisx6-pro-MMP-3cd forventes å være de samme; A280-beregningene påvirkes derfor ikke.- Rekonsentrer prøven opp til 0,5 mg/ml. Bruk en 400 ml rørt celle (se materialtabellen) for å konsentrere prøven til 15 ml. For å forhindre skumming, bruk et 50 ml rekonsentrasjonsrør for å konsentrere deg videre om nødvendig.
MERK: Hvis det dannes et bunnfall, kan det pelleteres og oppløses i HT-likevektsbufferen. Deretter gjentar du avsnittene 3.1 og trinn 3.2.1. Ellers fortsetter du til trinn 3.2.2. - Sett av en brøkdel for gelanalyse og merk den som Konsentrert MMP.
MERK: Protokollen kan settes på pause her og prøvene fryses ved -80 °C og tines senere.
- Rekonsentrer prøven opp til 0,5 mg/ml. Bruk en 400 ml rørt celle (se materialtabellen) for å konsentrere prøven til 15 ml. For å forhindre skumming, bruk et 50 ml rekonsentrasjonsrør for å konsentrere deg videre om nødvendig.
4. Aktivering
- Aktivering av 4-aminofenylmercuric acetat (APMA)
MERK: APMA er svært giftig. Lag en fersk lagerløsning på 20 mM APMA før aktivering, og arbeid alltid under en avtrekkshette når du bruker APMA. Kast APMA-avfallet i beholderen.- Per 1 ml aliquot av MMP (1 mg/ml), tilsett 50 μL 20 mM APMA (se materialtabellen) for å nå en endelig APMA-konsentrasjon på 1 mM. Inkuber over natten ved 37 °C.
- Hvis det dannes et bunnfall, sentrifugerer du det med maksimal hastighet i 10 minutter ved 4 °C. Oppbevar supernatanten i et 1,5 ml mikrofunksjonsrør merket Aktivert MMP. Kast bunnfallet i en beholder merket for APMA-avfall.
- Sett av en brøkdel for gelanalyse og merk den Aktivert MMP.
MERK: Protokollen kan settes på pause her og prøvene fryses ved -80 °C og tines senere. Hvis du ikke utfører gelanalyse, går du videre til trinn 4.2.1. Etter aktivering er molekylvekten og utryddelseskoeffisienten til MMP-3cd henholdsvis 19,40 kDa og 28,42 M-1 cm-1.
- Avsalting
- Fjern APMA fra den aktiverte MMP-3cd-prøven med en 2 ml avsaltingskolonne (se materialtabellen), etter produsentens protokoll.
- Sett av en brøkdel for gelanalyse og merk den Desalted MMP. Oppbevar den ved -80 °C. Hvis du ikke utfører gelanalyse, fortsett til pkt. 4.3 med de resterende prøvene.
MERK: Protokollen kan settes på pause her og prøvene fryses ved -80 °C og tines senere.
- Kjøre SDS-PAGE geler
- Kjør alle proteinfraksjoner på SDS-PAGE geler: Ikke-indusert brøkdel, indusert brøkdel, lysed MMP, sonikert MMP, solubilisert MMP, flowthrough-brøkdel, vaskefraksjon, elutionfraksjon, omdelt MMP, konsentrert MMP, aktivert MMP og avsaltet MMP.
- Langsiktig lagring av MMP-3
- Tilsett 0,05 % (v/v) ikke-ionisk overflateaktivt middel (se materialtabellen) i de avsaltede MMP-3cd-prøvene og oppbevar dem ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du kjører prøver på SDS-PAGE, fordi proteinet uttrykkes i form av uoppløselige inklusjonslegemer, bør de lysede og sonikerte fraksjonene inneholde lite eller ingen Hisx6-pro-MMP-3cd ekstrakt, da proteinet ennå ikke er resolubilisert i urea. Figur 3 sammenligner His-tag-renselsesfraksjonene til Hisx6-pro-MMP-3cd fra BL21(DE3)-celler og R2DP-celler. Elution brøker ble samlet separat for både BL21 (DE3) og R2DP celler før dialyse. Fraksjoner fra hvert trinn ble kjørt etter at proteinene ble avsaltet (figur 4). Alle Hisx6-pro-MMP-3cd-prøver viser et bånd på omtrent 30 kDa, og aktive MMP-3cd viser et bånd på omtrent 20 kDa ved fjerning av His-tag og pro-domain (figur 4 og supplerende figur S1).
Det totale utbyttet av protein i mg/L av E. coli-kulturen ble bestemt etter rensing og avsalting av BL21(DE3) og R2DP-kulturer (tabell 1). Bruk av R2DP-celler gir vesentlig høyere nivåer av MMP-uttrykk. Mens vanlige BL21(DE3)-celler bare ga 3,5 mg renset Hisx6-pro-MMP-3cd per liter kultur, produserte R2DP-celler 45 mg / L kultur. Tilsvarende økte utbyttet av funksjonell, avsaltet MMP-3cd fra henholdsvis 0,13 mg/L-kultur til 6,2 mg/l kultur for henholdsvis BL21(DE3) og R2DP-celler. Human pro-MMP-3cd overvelder det cellulære maskineriet til standard BL21 (DE3) belastning på grunn av sin størrelse (ca. 30 kDa) og de forseggjorte posttranslasjonelle modifikasjonene som kreves som er eksklusive for eukaryoter. R2DP-stammene er BL21 (DE3) derivater, designet for å forbedre uttrykket av eukaryote proteiner. R2DP-stammen bærer tRNAer for AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC og CGG, som sjelden brukes i E.coli , men rikelig i pro-MMP-3cd DNA-sekvensen. Dette er potensielt en nøkkelfaktor i de økte nivåene av proteinuttrykk observert i R2DP-celler.
Figur 3: SDS-PAGE gelanalyse av Hisx6-pro-MMP-3cd-uttrykk i BL21(DE3) og R2DP-celler. (A) De første åtte elutionfraksjonene av Hisx6-pro-MMP-3cd i BL21(DE3)-celler. (B) De første åtte elutionfraksjonene av Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP-celler. Etter ekstraksjon og solubilisering av MMP-inklusjonsorganer i urea ble Hisx6-pro-MMP-3cd-prøver renset gjennom Ni-NTA-kromatografikolonnen ved hjelp av batch-tyngdekraftsstrøm. Geler avkortes for å vise bare elutionfraksjonene. I utgangspunktet, på grunn av høye konsentrasjoner av protein, er fraksjoner 1-5 1 ml. Senere brøker (6-8) er mellom 5 og 8 ml hver. Hisx6-pro-MMP-3cd-båndet observeres ved ~30 kDa. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domene; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese; Ni-NTA = nikkel-nitrilotriacetisk syre; FT = gjennomstrømning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Proteolytisk spalting av His-tag og pro-domain ved aktivering av MMP-3cd. De induserte, omfoldede, konsentrerte, aktiverte og avsaltede fraksjonene av MMP-3cd i R2DP-celler vises. Etter dialyse konsentreres Hisx6-pro-MMP-3cd og aktiveres ved hjelp av APMA. Ved aktivering er molekylvekten til det aktiverte MMP-3cd-båndet ca. 20 kDa, i motsetning til det hismerkede zymogenet, som forblir på ~ 30 kDa. Urenheter fjernes i aktiverings- og avsaltingsstadiene. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domene; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Stadier | BL21(DE3)-celler | R2DP-celler | ||||
| Volum (ml) | Konsentrasjon (mg/ml) | Utbytte (mg/L-kultur) | Volum (ml) | Konsentrasjon (mg/ml) | Utbytte (mg/L-kultur) | |
| Rensing | 23 | 0.30 | 3.5 | 42 | 2.1 | 45 |
| Avsalting | 1.5 | 0.17 | 0.13 | 72 | 0.17 | 6.2 |
Tabell 1: Tabell over volumer og konsentrasjoner på tvers av stadier av MMP-3cd rensing. Hisx6-pro-MMP-3cd ble uttrykt enten i 2 L av en kultur av BL21 (DE3) eller i 2 L R2DP-celler. Volum-, konsentrasjons- og utbyttekultur (mg per liter) rapporteres for BL21(DE3) og R2DP-celler. Utbytte (mg per liter kultur) ble oppnådd ved å dele det totale utbyttet av protein (mg) oppnådd ved volum av kultur, som var 2 L for både BL21 (DE3) og R2DP tilfeller. Proteinmengder er rapportert for to stadier: Hisx6-pro-MMP-3cd etter Hisx6-tag rensing og aktiv MMP-3cd etter avsalting.
Supplerende figur S1: Sekvenser av T7 primere og MMP-3cd protein før og etter aktivering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den store produksjonen av løselige, menneskelige, rekombinante MMP-er er fortsatt en utfordrende oppgave. Pattedyrceller kan uttrykke funksjonelle MPS til høye kostnader og lange ventetider, mens E. coli raskt produserer høye mengder MMP-inkluderingsorganer som må renses og brettes på nytt11,16. R2DP-celler øker utbyttet av MMP-inkluderingsorganer betydelig, noe som muliggjør en mer kostnadseffektiv og produktiv MMP-omfoldingsprosess. Imidlertid mangler E. coli posttranslasjonsmaskineriet som trengs for å brette MMP-er, og selv om konstruerte stammer viser sterkt forbedrede uttrykksnivåer, er bare noen mellomprodukter riktig brettet ved fjerning av denaturant4. Følgelig forventes det fortsatt sporadisk nedbør av MMP-er under omforming og aktivering. Disse resultatene viser at en betydelig del av renset Hisx6-pro-MMP-3cd utbytte går tapt etter om bretting, aktivering og avsalting.
Disse stadiene kan optimaliseres ytterligere ved å legge til flere dialysestadier sammen med testkonsentrasjoner av MMP-3cd og APMA. Men per liter kultur er utbyttet av funksjonell MMP-3cd 49 ganger høyere i R2DP-celler enn BL21 (DE3) celler. I tillegg økte andelen funksjonelle, avsaltede MMP-3cd fra rensede Hisx6-pro-MMP-3cd fra 3,7% for BL21 (DE3) celler til 14% for R2DP-celler. Derfor tilbyr R2DP-celler et levedyktig alternativ til nåværende MMP-produksjonsalternativer, for eksempel uttrykk i pattedyrceller, og tilbyr mer konkurransedyktige utbytter per liter kultur.
Denne protokollen beskriver en detaljert metode for å uttrykke og rense Hisx6-pro-MMP-3cd i R2DP E. coli-celler , sammen med aktivering og bretting av MMP-3cd. Ettersom protokollen tar flere dager å fullføre, er nøye planlegging avgjørende for å minimere tap av funksjonelle MMP-er på grunn av flere fryse-tine sykluser. Siden R2DP-celler er den viktigste forbedringen i denne metoden, er det viktig å optimalisere uttrykksutbyttet, da store mengder kan gå tapt gjennom omforming og aktivering. Under uttrykk bør operatøren bestemme den optimale OD600 - og IPTG-konsentrasjonen før induksjon. Etter his-tag rensing, hvis utbyttet faller betydelig, kan det hende at harpiksen må regenereres eller erstattes, eller cellepelleten må kanskje sonikeres videre.
Hvis det oppstår betydelig nedbør under dialyse, reduser endringene i ureakonsentrasjon mellom stadier i trinnvis dialyse ved å legge til flere stadier (f.eks. fra 6 M til 5M, og deretter 5 M til 4 M, i stedet for å hoppe over 5 M-fasen). Når de er omdelt, og spesielt etter aktivering, er MMP-er betydelig mer utsatt for nedbør eller nedbrytning gjennom autoproteolyse17. Etter at pH- og saltkonsentrasjoner av alle buffere er optimalisert og ønskede tester er utført, bør alle trinnene etter dialysen fullføres med haster.
Økende oppmerksomhet mot MMP-er som potensielle mål for terapeutiske behandlinger har blitt møtt med raske innovasjoner innen proteinteknikk for å forbedre binding, hemming og selektivitet av MMP-terapeutiske behandlinger9. Følgelig blir en gang ambisiøse prospekter innen MMP-terapi stadig mer oppnåelige6. Behovet for raske, pålitelige metoder for å gjenopprette løselige, aktive MMP-er vil utvilsomt bli mer avgjørende med tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Dr. Evette Radisky og Alexandra Hockla ved Mayo Clinic i Jacksonville, Florida, for å ha gitt pET-3a-pro-MMP-3cd plasmid som mal for kloning av Hisx6pro-MMP-3cd-genet, og deres kommentarer, sammen med Dr. Paul Hartley fra Nevada Genomics Center ved University of Nevada, Reno, for DNA-sekvensering. Forfatterne vil også takke Cassandra Hergenrader for å ha hjulpet til med en del av proteinuttrykket. M.R.-S. vil takke NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience grant og UNR R&D mICRO SEED Grant Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging |
| 1 L Erlenmeyer flasks | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
| 1 L glass bottles | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
| 1.5 mL microfuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
| 18 G, 1-in. beveled needle | Amazon | B07S7VBHM2 | Used in combination with the dialysis casette |
| 2 mL desalting column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Removes APMA following activation |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
| 250 mL conical bottle cushions | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation |
| 250 mL conical bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
| 400 mL stirred cell | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit |
| 4-aminophenylmercuric acetate (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Activates MMP-3 by cleaving the propeptide |
| 5 mL syringe | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Used in combination with the dialysis casette |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Used for storage in many purification steps |
| 50 mL re-concentration tube | Sigma Aldrich | UFC901024D | Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media |
| BamHI | NEB | R3136S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Calcium chloride (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | The calcium ion stabilizes MMP structure |
| Cell spreaders | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Can be used to spread cells across a petri dish after transformation |
| Chloramphenicol | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media |
| Dialysis Buffer 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea. |
| Dialysis Buffer 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea. |
| Dialysis Buffer 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2. |
| Dialysis clips | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Used in combination with snakeskin dialysis tubing |
| Dialysis tubing | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss |
| Digest buffer | NEB | B7204S | Buffer used in digesting the pET3a vector |
| Disposable cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds |
| DNA assembly mix | NEB | E2621S | Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector |
| DNase I | NEB | M0303S | Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds |
| Gel recovery kit | Promega | A9281 | Isolates and purifies DNA from agarose gels |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C |
| Gravity flow column | BioRad | 7321010 | Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins |
| High-transformation efficiency cells | NEB | C2987 | High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct |
| HT Elution Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| HT Equilibration Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4 |
| HT Regeneration Buffer | n/a | n/a | 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0 |
| HT Wash Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Used to pH buffers |
| Imidazole | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein |
| Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C |
| LB Amp CamR media | n/a | n/a | To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Amp CamR plates | n/a | n/a | To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride |
| Lysis Buffer | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0 |
| Lysozyme | MP Biomedicals | 195303 | Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls |
| Miniprep kit | Promega | A1330 | If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants |
| NdeI | NEB | R0111S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
| Ni-NTA resin | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole |
| Nonionic surfactant | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity. |
| PCR mix | NEB | M0492S | A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector |
| pET plasmid | Addgene | n/a | The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | Used for plating transformants on LB agar media |
| R2DP cells | Novagen | 714033 | BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli |
| SOC growth media | NEB | B9020S | Non-selective growth media for rapid growth during transformation |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Used in buffers and helps with protein stability |
| Sodium deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls |
| Solubilization Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
| Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Detergent used for cell lysis |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure |
| Zinc chloride (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3 |
References
- Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).
- Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).
- Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).
- Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).
- Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313 (2020).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
- Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
- Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
- Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
- Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
- Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
- Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
- Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).
- McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
- Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).
- Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).
- Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).
