Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحريض التهاب الأمعاء عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR CD4 + إلى الفئران التي تعاني من نقص المناعة

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63293
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج التهاب القولون المنقول بالخلية التائية الخاص بمستضد الأمعاء. يتم عزل الخلايا التائية CD4+ من الفئران المعدلة وراثيا CBir1 TCR. هذه خاصة بمستضد ميكروبات الأمعاء المهيمنة على المناعة CBir1 السوط ، والذي يتم نقله إلى الفئران المتلقية Rag1-/- ، مما يؤدي إلى التهاب الأمعاء.

Abstract

مع زيادة معدل الإصابة ، تفرض أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) ، وهي أمراض مزمنة تؤثر على الجهاز الهضمي ، عبئا صحيا وماليا كبيرا على الأفراد والمجتمع. لذلك ، من الأهمية بمكان التحقيق في الآليات الكامنة وراء التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي وتطوره. هنا ، يتم وصف نموذج التهاب القولون نقل الخلايا التائية الخاص بمستضد الميكروبات المعوية. تم التعرف على السوط CBir1 باعتباره المستضد البكتيري المعوي المناعي في التهاب القولون التجريبي والمرضى الذين يعانون من مرض كرون. CBir1 TCR naϊve CD4+ الخلايا التائية المعدلة وراثيا ، الخاصة ب CBir1 السوط ، يمكن أن تحفز التهاب القولون المزمن بعد النقل بالتبني إلى الفئران Rag1-/- التي تعاني من نقص المناعة. يتم تقييم شدة المرض من قبل علم الأنسجة المرضية. كما يتم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4+ في الصفيحة القولونية. يشبه هذا النموذج إلى حد كبير تطور مرض الأمعاء الالتهابي، الذي يوفر نموذجا مثاليا للفئران للتحقيق في الآليات التي تقود التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.

Introduction

تتميز أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD)، بما في ذلك بشكل رئيسي مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC)، بالتهاب مزمن وانتكاسي في الجهاز الهضمي، مما يؤثر على الملايين في جميع أنحاء العالم1. وقد تورطت عدة عوامل في تطور مرض الأمعاء الالتهابي والتسبب فيه، بما في ذلك القابلية الوراثية، وميكروبات الأمعاء، والاستجابات المناعية، والنظام الغذائي، ونمط الحياة2. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة ل IBD لا تزال غير مفهومة تماما.

أحد الاهتمامات الخاصة هو التفاعل بين ميكروبات الأمعاء والاستجابات المناعية للمضيف في تنظيم التهاب الأمعاء3. توفر ميكروبات الأمعاء سلسلة من الجزيئات والمستضدات المناعية المحفزة للمناعة، والتي يمكن أن تنشط الاستجابات المناعية4. في حين أن التوازن بين الخلايا التائية المستجيبة والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على التوازن المعوي ، فإن استجابة الخلايا التائية المخاطية المعوية CD4 + T المفرطة لمستضدات ميكروبات الأمعاء تساهم في التهاب الأمعاء5،6،7. كمستضد ميكروبات الأمعاء المناعية ، ارتبط السوط CBir1 بالتسبب في CD8,9 البشري. وعلاوة على ذلك، فإن نقل الخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR (Tg) يحفز الالتهاب المعوي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة6، وهو ما يشبه إلى حد كبير مرض الأمعاء الالتهابي البشري، مما يشير إلى أن نموذج نقل الخلايا التائية هذا يساعد في التحقيق في آليات مرض الأمعاء الالتهابي البشري.

يصف هذا العمل البروتوكول التفصيلي للحث على التهاب القولون في الفئران Rag1-/- عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ وتقييم شدة المرض. إلى جانب ذلك ، يتم عرض النتائج المتوقعة ، ومناقشة الخطوات الحاسمة للإجراء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، مما سيساعد الباحثين على التحقيق في آليات التسبب في التهاب الأمعاء واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الفرع الطبي بجامعة تكساس المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها. تم توفير الفئران CBir1 TCR Tg من قبل الدكتور تشارلز إلسون من جامعة ألاباما في برمنغهام. يمكن أن تكون الفئران CBir1 TCR Tg من الإناث أو الذكور ولكن يجب أن تكون في 8-12 أسبوعا. تم الحصول على الفئران Rag1-/- على خلفية C57BL/6 من مختبر جاكسون10. يجب أن تكون الفئران Rag1-/- متطابقة مع الجنس والعمر ، ويمكن استخدام الذكور أو الإناث ولكن يجب أن تكون في 8-12 أسبوعا. يتم تلخيص البروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. إعداد الفئران المتلقية

  1. قم بإعداد الفئران Rag1-/- على خلفية C57BL/6 ، التي يتم تربيتها في نفس المنشأة الحيوانية المحددة الخالية من مسببات الأمراض. احسب عدد الفئران لكل مجموعة حسب تحليل الطاقة11.
    ملاحظة: لا تحتوي الفئران Rag1-/- على خلايا تائية ناضجة وخلايا بائية10.
  2. ضع علامة على الفئران عن طريق لكمة الأذن.
  3. وزن الفئران في نفس اليوم من نقل الخلايا التائية.

2. إعداد الكواشف والحلول

ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة أو خطرة بيولوجيا وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.

  1. تحضير الغسيل العازل: أضف 5 مل من 100x البنسلين الستربتومايسين إلى 500 مل من RPMI 1640 متوسط. امزجها جيدا وخزنها على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. تحضير المخزن المؤقت لتحلل Tris-NH4Cl.
    1. تحضير المحلول الجزء A. قم بإذابة 2.06 جم من قاعدة Tris في 100 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) واضبط قيمة الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام HCl.
    2. تحضير الحل الجزء B. قم بإذابة 7.47 جم من NH4Cl في 800 مل من ddH2O.
    3. امزج A و B جيدا. قم بقياس الرقم الهيدروجيني واضبطه على 7.2 إن لم يكن كذلك.
    4. اضبط الحجم الإجمالي إلى 1000 مل. الأوتوكلاف ثم تخزينه في 4 درجات مئوية.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للعزل.
    1. أضف 2.5 جم من BSA و 500 ميكرولتر من EDTA (0.5 M ، الرقم الهيدروجيني 8.0) إلى 500 مل من 1x PBS. امزجها جيدا.
    2. قم بتصفية المحلول من خلال فلتر أعلى زجاجة يمكن التخلص منه بسعة 0.22 ميكرومتر يعمل بالتفريغ (انظر جدول المواد). تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. تحضير المخزن المؤقت FACS. أضف 1 مل من FBS و 50 ميكرولتر من EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8.0) إلى 50 مل من مخزن الغسيل المؤقت (تم إعداده في الخطوة 2.1). تخلط جيدا وتخزن في 4 درجات مئوية.
  5. إعداد وسيط كامل. أضف 5 مل من FBS في 45 مل من مخزن الغسيل المؤقت. تخلط جيدا وتخزن في 4 درجات مئوية.
  6. إعداد EDTA-PBS المخزن المؤقت.
    1. حساب حجم المخزن المؤقت EDTA-PBS المطلوب. الحجم (مل) = رقم الماوس × 20.
    2. أضف الحجم المناسب من FBS و EDTA و HEPES في PBS (2٪ من FBS ، 0.5 mM من EDTA ، 10 mM من HEPES في PBS) (انظر جدول المواد).
    3. امزجها جيدا وقم بتسخينها مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  7. تحضير المخزن المؤقت للهضم.
    1. احسب حجم مخزن الهضم المؤقت المطلوب. الحجم (مل) = رقم الماوس × 10.
    2. أضف الحجم المناسب من FBS و Collagenase IV و DNase I في مخزن الغسيل المؤقت (2٪ من FBS و 0.5 مجم / مل من Collagenase IV و 10 U / mL من DNase I في Washing Buffer) (انظر جدول المواد).
    3. امزجها جيدا وقم بتسخينها مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  8. إعداد حل بيركول.
    1. تحضير 100٪ بيركول. أضف 5 مل من 10x PBS في 45 مل من Percoll الأصلي (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد 2٪ FBS في الغسيل المخزن المؤقت. أضف 1 مل من FBS في 49 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
    3. قم بسد حجم 40٪ محلول Percoll و 75٪ محلول Percoll. حجم 40٪ Percoll Solution (mL) = رقم الماوس × 4 ؛ حجم 75٪ Percoll Solution (mL) = رقم الماوس × 2.
      ملاحظة: ستستخدم الكواشف/المحاليل المعدة في الخطوات 2-1-2-5 في الخطوات من 3 إلى 4، وستستخدم الكواشف/المحاليل المعدة في الخطوات 2-6-2-8 في الخطوات 9. يجب إعداد جميع الكواشف / المحاليل المستخدمة في الخطوة 9 طازجة. يوصى بعمل مخزن مؤقت إضافي بنسبة 5٪ لجميع الخطوات.

3. عزل الخلايا التائية CBir1 TCR Tg CD4+ الطحالية

  1. القتل الرحيم CBir1 TCR Tg الفأر / الفئران عن طريق خلع عنق الرحم مع القتل الرحيم CO2 (30٪ -70٪ معدل إزاحة الغاز والهواء). رطب الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. قم بإجراء شق في البطن الأيسر ~ 1 سم ، واسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية البطنية ، وقم بعمل شق ~ 3 سم في أنسجة عضلات البطن ، وقم بإزالة الطحال بمقص وملقط معقم. ضع الطحال في طبق استزراع يحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل البرودة (يتم إعداده في الخطوة 2.1).
  3. طحن الطحال مع السطح الخشن لاثنين من الشرائح الزجاجية المعقمة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد). اشطف الشرائح الزجاجية وطبق الثقافة ب 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل التبريد وانقل المخزن المؤقت للغسيل إلى الأنبوب.
  4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 5 مل من مخزن Tris-NH4Cl Lysis Buffer المخزن المؤقت للتحلل (المحضر في الخطوة 2.2) لكل طحال. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل التبريد إلى الأنبوب.
  5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 مل من مخزن العزل العازل قبل البرودة (المعد في الخطوة 2.3).
  6. عد الخلايا. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من التربان الأزرق جيدا. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة ، وأدخل الشريحة في عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد) واحصل على رقم الخلية القابل للتطبيق 12.
    ملاحظة: يمكن الحصول على ما يقرب من 1 × 108 خلايا من ماوس مانح واحد في هذه الخطوة.
  7. الطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي من الخطوة 3.6 عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من جميع السوبرناتونات.
  8. دوامة الجسيمات المغناطيسية CD4 المضادة للفأر جيدا (انظر جدول المواد) ، إضافة مباشرة 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 107 خلية وتخلط مع كريات الخلايا جيدا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مجموعة إثراء أخرى للخلايا التائية CD4+ تجارية هنا.
  9. انقل تعليق الجسيمات الخلوية إلى أنبوب تجميع معقم. أضف 3.5 مل من المخزن المؤقت للعزل قبل التبريد إلى الأنبوب.
  10. ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  11. قم بإزالة الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا (انظر جدول المواد) ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 3.5 مل من العزل العازل قبل البرد ، وضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  12. كرر الخطوة 3.11.
  13. أعد تعليق الخلايا مع 1 مل من مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد (تم إعداده في الخطوة 2.4).

4. تنقية CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + الخلايا التائية

  1. حساب الخلايا التالية للخطوة 3.6.
  2. إذا كان تركيز الخلية >107/mL، أضف حجما من المخزن المؤقت FACS للتأكد من أن تركيز الخلية ≤ 107/mL.
    ملاحظة: يمكن الحصول على 1 × 107 خلية من فأر مانح واحد في هذه الخطوة.
  3. قم بتلطيخ علامات السطح ب 10 ميكرولتر من CD4-APC المضاد للماوس ، و 10 ميكرولتر من CD25-Percp / Cy5.5 المضاد للماوس ، و 10 ميكرولتر من CD62L-PE13,14 المضاد للماوس (انظر جدول المواد). تخلط بلطف وتحضن لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  4. اغسل الخلايا ب 2 مل من مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط جميع supernatants باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  5. كرر الخطوة 4.4.
  6. أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 40 × 106/مل في مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد.
    ملاحظة: لمنع الفارز من الانسداد، مرر الخلايا عبر مصفاة 70 ميكرومتر.
  7. أضف 0.1 ميكروغرام/مل من DAPI.
    ملاحظة: يستخدم DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة.
  8. قم بإعداد أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على 4 مل من الوسط الكامل (أعدت في الخطوة 2.5) لجمع الخلايا المفروزة.
  9. قم بتحميل الخلايا على جهاز الفرز. فرز خلايا naϊve CD4+ T واحدة قابلة للحياة (DAPI- CD4 + CD25- خلايا CD62L +) في وضع النقاء (حجم الفوهة: 70 ميكرومتر; الضغط: 70 رطل لكل بوصة مربعة. معدل الحدث: 8000-12000 الأحداث / الأحداث. الكفاءة: أعلى من 90٪ (الشكل 2).
    ملاحظة: تعبر الخلايا التائية Naϊve CD4+ عن التعبير العالي عن CD62L وتفتقر إلى علامة التنشيط CD2513,14.
  10. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط جميع المواد الخارقة باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  11. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  12. حساب عدد الخلايا بعد الخطوة 3.6
    ملاحظة: يمكن الحصول على حوالي 5 × 106 خلية من فأر مانح واحد في هذه الخطوة.

5. نقل الخلايا إلى الفئران المتلقية

  1. أعد تعليق خلايا CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T إلى تركيز 5 × 106/مل بإضافة 1x PBS.
  2. قم بتسخين الفئران Rag-/- تحت مصباح حراري (انظر جدول المواد) لمدة 4 دقائق ، وكبح جماح الفئران باستخدام مانع الماوس.
  3. نقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية عن طريق الوريد عن طريق الوريد الخلفي لفئران Rag-/- باستخدام حقنة أنسولين 1 مل (27 جم) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الخلايا من فأر مانح واحد كافية للانتقال إلى حوالي خمسة فئران متلقية.

6. مراقبة العلامات السريرية أثناء تطور التهاب القولون

  1. وزن الفئران كل أسبوع وزيادة الملاحظة إلى مرتين في الأسبوع بمجرد أن تبدأ الفئران في فقدان >5٪ من الأوزان الأصلية.
  2. راقب استجابة / تحرك الفئران عند تحفيزها بلطف.
  3. مراقبة التشوهات السريرية الأخرى. أي الموقف واتساق البراز.

7. جمع القولون والنتيجة النسيجية المرضية

  1. التضحية بالفئران المتلقية عن طريق خلع عنق الرحم مع CO2 في نقطة زمنية من فقدان الوزن >20 ٪ من الوزن الأصلي أو 6 أسابيع بعد نقل الخلايا. رطب الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. قم بإجراء شق جلدي بطني في خط الوسط ~ 1 سم ، واسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية البطنية ، وقم بعمل شق ~ 3 سم في أنسجة عضلات البطن ، وحدد الأعور ، وأزل القولون بأكمله بمقص وملقط معقم. بلل القولون ب PBS قبل البرودة في طبق ثقافي.
  3. شق القولون بالطول وشطفه باستخدام PBS قبل البرودة. قطع 1/3 من القولون طوليا.
  4. ضع شريط القولون في منشفة ورقية مع توجيه الجانب المضيء لأعلى. قم بإجراء التدحرج السويسري باستخدام مسواك15.
  5. ضع القولون السويسري في كاسيت وضع الكاسيت في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لمدة 24 h16 ، يليه الجفاف باستخدام معالج آلي (انظر جدول المواد) وتضمين البارافين.
  6. قم بقص 5 ميكرومتر من مقاطع الأنسجة على ميكروتوم ، مثبتة على شرائح ، وقم بإجراء صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) 17 (انظر جدول المواد).
  7. حدد الدرجات النسيجية المرضية من خلال الجمع بين الدرجات لكل معلمة من المعلمات الستة بحد أقصى 12. التهاب الصفيحة بروبريا (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ فقدان الخلايا الكأسية (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ سرداب غير طبيعي (عادي ، 0 ؛ فرط البلاستيك ، 1 ؛ عدم التنظيم ، 2 ؛ فقدان السرداب ، 3) ؛ خراجات سرداب (غائبة ، 0 ؛ حاضرة ، 1) ؛ تآكل الغشاء المخاطي وتقرحه (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ والتغيير تحت المخاطي (لا شيء ، 0 ؛ تحت الغشاء المخاطي ، 1 ؛ عبر الجدارية ، 2)18.

8. عزل وتلطيخ خلايا الصفيحة المعوية بروبريا

  1. بعد الخطوة 7.3 ، قطع 2/3 آخر من القولون إلى قطع 0.5-1 سم واغسلها باستخدام PBS قبل البرودة.
  2. انقل أجزاء القولون إلى مخزن مؤقت EDTA-PBS مدفأ مسبقا بسعة 20 مل في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  3. دوامة الأنبوب ، والتخلص من supernatants عن طريق تمريره من خلال غربال معقم (قطر: 0.01 بوصة) ، وإعادة تعليق شرائح القولون في 20 مل من PBS قبل البرد في أنبوب 50 مل.
  4. كرر الخطوة 8.3 مرتين.
  5. ضع أجزاء القولون في أنبوب C (انظر جدول المواد) يحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت للهضم المسخن مسبقا.
  6. ضع الأنبوب على آلة التفكك (انظر جدول المواد) واحتضنه في إطار برنامج "37C_m_LPDK_1" لمدة 25 دقيقة.
    ملاحظة: "37C_m_LPDK_1" هو برنامج قياسي معد مسبقا في آلة التفكك المستخدمة لتحريك العينات وإبقائها عند 37 درجة مئوية.
  7. تحقق مما إذا كان يتم هضم الأنسجة بالكامل ، مما يعني أنه لا توجد قطعة من الأنسجة في مخزن الهضم. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر برنامج "37C_m_LPDK_1".
  8. جمع supernatant عن طريق المرور من خلال غربال معدني ومصفاة 100 ميكرولتر. شطف مع 10 مل من PBS قبل الباردة.
  9. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط جميع supernatants.
  10. أعد تعليق الخلايا في 4 مل من محلول Percoll بنسبة 40٪ واخلطها جيدا (أعدت في الخطوة 2.8).
  11. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى 2 مل من محلول Percoll بنسبة 75٪ في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
  12. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 850 × g لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية (منحدر التسارع: 0; منحدر الفرامل: 0).
  13. قم بإزالة الدهون بعناية من الطبقة العليا باستخدام ماصة نقل 3 مل ونقل طبقة الخلية إلى 20 مل من الغسيل العازل في أنبوب 50 مل.
  14. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من جميع المواد الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط المكتمل.
  15. حساب الخلايا التالية للخطوة 3.6.
  16. زرع الخلايا في صفيحة من 24 بئرا ، وتنشيطها مع 50 نانوغرام / مل من Phorbol-12-myristate 13-acetate و 750 نانوغرام / مل من الأيونومايسين لمدة 2 ساعة ، تليها حضانة مع 5 ميكروغرام / مل من Brefeldin A لمدة 3 ساعات (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة، وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.
  17. انقل الخلايا إلى أنبوب FACS ، وأضف 2 مل من FACS Buffer ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  18. احتضان الخلايا مع 12.5 ميكروغرام / مل من CD16/3219 المضادة للفأر في (انظر جدول المواد) FACS المخزن المؤقت لمنع مستقبلات Fc لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  19. وصمة عار للحية / الميتة وعلامة السطح.
    1. اغسل الخلايا ب 2 مل من FACS Buffer وقم بطردها مركزيا عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    2. قم بتلطيخ الخلايا بالصبغة الحية وعلامات السطح (أي الأجسام المضادة المضادة CD3 المضادة للفأر والأجسام المضادة CD4 المضادة للفأر)20 (انظر جدول المواد) في FACS Buffer بتركيز محسن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة، وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.
  20. أداء تلطيخ الخلوية والنووية.
    1. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    2. تخلل الخلايا وإصلاحها عن طريق تعليق الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من حل عمل Transcription Factor Fix (انظر جدول المواد) لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 2 مل من المخزن المؤقت Perm وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    4. احتضان الخلايا بعلامات خلوية ونووية (أي الأجسام المضادة للفأر IFNγ والأجسام المضادة المضادة للفأر IL-17A والأجسام المضادة المضادة للفأر Foxp3)20 في مخزن بيرم المؤقت (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    5. أضف 2 مل من المخزن المؤقت Perm وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  21. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم عزل ما يقرب من 5 × 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T الخلايا لكل طحال من ماوس CBir1 TCR Tg البالغ. نقل CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + الخلايا التائية المستحثة التهاب القولون المزمن في الفئران المتلقية Rag1-/- . بعد نقل الخلايا ، تمت مراقبة العلامات السريرية لتقييم تطور التهاب الأمعاء ، بما في ذلك فقدان الوزن ، واتساق البراز ، والموقف المنحني. كما هو متوقع ، بدأت الفئران في إنقاص الوزن بعد حوالي ثلاثة أسابيع من نقل الخلايا ، ووصل الوزن إلى حوالي 80٪ -85٪ من الوزن الأصلي بعد ستة أسابيع من نقل الخلايا (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الفئران الإسهال حوالي 3-4 أسابيع بعد نقل الخلايا وأظهرت وضعية منحنية عندما أصيبت بالتهاب القولون الحاد. تم عرض التشكل الإجمالي للقولون ، وتم تقييم شدة التهاب القولون من خلال النتيجة النسيجية المرضية عندما تم التضحية بالفئران. أظهرت الفئران التي تتلقى CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T خلايا قصيرة طول القولون بعد 6 أسابيع من نقل الخلايا (الشكل 4A). أظهرت الفئران المتلقية المزيد من تسلل الخلايا في الصفيحة المعوية بروبريا بعد 4 أسابيع من نقل الخلايا (الشكل 4C) ، وفقدان الخلايا الكأسية وتضخم الخلايا الظهارية المعوية بعد 5 أسابيع من نقل الخلايا (الشكل 4D) ، وتآكل الغشاء المخاطي وتسلل الخلايا الالتهابية في تحت المخاطية للقولون 6 أسابيع بعد نقل الخلية (الشكل 4F). في الوقت نفسه ، لم يكن هناك التهاب في الفئران Rag1-/- التي تتلقى PBS وحدها (الشكل 4B). الى جانب ذلك ، لا يوجد التهاب في الأمعاء الدقيقة ، ولكن الأعور لديه التهاب. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4 + في الصفيحة الاستعمارية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وتظهر استراتيجية البوابات (الشكل 5 ألف إلى هاء). تطورت خلايا CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T إلى خلايا IFNγ+ Th1 ، وخلايا IL-17A + Th17 ، و IFNγ + IL-17 + CD4 + خلايا T (الشكل 5F) ، وخلايا Foxp3 + Treg في الصفيحة المعوية propria من مستلمي Rag1-/- (الشكل 5G).

Figure 1
الشكل 1: إجراء التهاب القولون التحريضي وتقييم شدة المرض. تم عزل الخلايا التائية CD4+ الطحالية من الفئران المعدلة وراثيا CBir1 TCR باستخدام الخرز المغناطيسي ، ثم تم تنقية الخلايا التائية naϊve عن طريق الفرز. ثم تم نقل خلايا naϊve T المعدلة وراثيا CBir1 TCR عن طريق الوريد إلى الفئران المتلقية Rag1-/-. عندما تم التضحية بالفئران بعد حوالي ستة أسابيع من نقل الخلايا ، تم تقييم شدة التهاب القولون من خلال الدرجات النسيجية المرضية. تم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4+ في الصفيحة القولونية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية البوابة لفرز الخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR. تم تنقية الخلايا التائية الأحادية CBir1 TCR المعدلة وراثيا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الحطام (A) والخلايا غير المفردة (B-C) والخلايا الميتة (D) والخلايا المنشطة (E-F). وقد ظهر السكان الفرعيون في (G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تم نقل تغيرات وزن الفئران Rag1-/- بعد نقل الخلايا التائية. 1 × 106 CBir1 TCR الخلايا التائية المعدلة وراثيا naϊve T إلى Rag1-/- الفئران ، وتم استخدام الفئران Rag1-/- التي تتلقى PBS كضوابط. تم تسجيل أوزان الماوس كل أسبوع. وقدمت البيانات بمتوسط ± SD؛ اختبار t للطالب ؛ ص<0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: المورفولوجيا الإجمالية وتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للقولون من Rag1-/- الفئران التي تتلقى CBir1 TCR الخلايا المعدلة وراثيا naϊve T. (أ) تم التضحية بالفئران المتلقية بعد ستة أسابيع من نقل الخلية ، وتم عرض المورفولوجيا الإجمالية للقولون. (ب-هاء) تم التضحية بالفئران المتلقية في نقاط زمنية مختلفة ، وتلقت الفئران Rag1-/- PBS كضوابط. تمت معالجة القولون لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين. يتم عرض صور تمثيلية للهيماتوكسيلين وبقع الإيوسين للقولون. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (F) تم تحديد الدرجات النسيجية المرضية. تم تقديم البيانات بمتوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4+ في الصفيحة القولونية من الفئران Rag-/- التي تتلقى CBir1 TCR الخلايا التائية المعدلة وراثيا. عندما تم التضحية بالفئران المتلقية بعد 6 أسابيع من نقل الخلايا ، تم عزل خلايا الصفيحة القولونية لتلطيخ الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4 +. (أ-هاء) استراتيجية البوابة لتحليل الأنماط الظاهرية للخلايا التائية. (F-G) (F) تم تحديد الخلايا التائية IL-17A + CD4 + ، والخلايا التائية IFNγ + CD4 + ، والخلايا التائية IL-17 + IFNγ + CD4 + ، و (G) Foxp3 + Tregs بواسطة قياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن كل خطوة ضرورية لتكرار نموذج التهاب القولون هذا ، إلا أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة. يجب أن تتلقى الفئران Rag-/- المتلقية خلايا naϊve CD4 + T كافية قابلة للحياة للحث على التهاب الأمعاء. استخدمنا الطحال لعزل الخلايا التائية CD4+ الساذجة بدلا من MLNs. لأن غلة خلايا CD4+ T الساذجة في MLNs أقل بكثير من الطحال. يتم التعبير عن CD62L بشكل كبير في الخلايا التائية الساذجة ، و CD44 و CD25 هي علامات تنشيط الخلايا التائية13,14. في هذه الدراسة ، استخدمنا لأول مرة الخرز المغناطيسي المضاد ل CD4 لعزل خلايا CD4 + T عن الطحال. ثم استخدمنا مزيجا من الأجسام المضادة المضادة ل CD4 و Anti-CD62L و Anti-CD25 لعزل الخلايا التائية الساذجة CD4 + 13,14. يمكن للباحثين استخدام علامات أخرى لفرز الخلايا التائية CD4 + الساذجة. CD45RBhi هو أيضا علامة على الخلايا التائية الساذجة. تستخدم الخلايا التائية CD45RBhi CD25- CD4+ بشكل شائع كخلايا تائية ساذجة من الخلايا التائية المعدلة وراثيا غير TCR من النوع البري23. لذلك ، فإن تقنيات فرز الخلايا والحقن الوريدي للخلايا التائية في الفئران المتلقية ضرورية. يعد إعداد بروتوكول البوابة كقالب مفيدا لتسريع التجارب بأخطاء أقل. لتجنب موت الخلايا ، يجب دائما إبقاء الخلايا على الجليد. إلى جانب ذلك ، يوصى بشدة بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة لأن DAPI لا يمكنه العبور عبر أغشية الخلايا السليمة ، مما يجعله مسبارا ممتازا للخلايا الميتة24. يوفر تسخين الفئران لتحفيز تمدد عروق الذيل رؤية أفضل للأوردة للحقن في الوريد. يوصى بتنفيذ جميع الإجراءات من قبل باحثين مدربين.

قد تؤثر العديد من العوامل على نتائج نماذج التهاب القولون ، والتي تحتاج إلى الاهتمام. أولا ، يجب أن تكون الفئران المتلقية Rag1-/- متطابقة مع العمر والجنس. في نموذج نقل الخلايا التائية CD45RBhi ، يمكن نقل الخلايا التائية من المتبرعين الذكور والإناث إلى متلقي Rag-/- الذكور ، في حين يمكن استخدام المتبرعات الإناث فقط عند استخدام المتلقين الإناث 23. ومع ذلك ، فإننا لا نرى فرقا كبيرا بين المتلقين الذكور والإناث. يمكن أن تكون الفئران المتلقية إما إناثا أو ذكورا ، ويمكن للخلايا التائية من المتبرعين الذكور أيضا أن تحفز التهاب القولون لدى المتلقين الإناث. نظرا لأن تغيير الوزن هو مؤشر قيم على تطور التهاب القولون ، فمن المستحسن استخدام الفئران المتلقية بين 8-12 أسبوعا لتقديم خط وزن مستقر. يجب تربية هذه الفئران المتلقية والاحتفاظ بها في نفس الغرفة من المنشأة الحيوانية لأن الميكروبات ضرورية في تنظيم تطور التهاب القولون25. يختلف وقت الإصابة بالتهاب القولون عند نقل أعداد مختلفة من خلايا CD4 T الساذجة CBir1 TCR Tg. كما هو متوقع ، يتطلب عدد أقل من الخلايا وقتا أطول لتحريض التهاب القولون ، ويتطلب عدد أكبر من الخلايا وقتا أقصر لتحريض التهاب القولون. يوصى باستخدام 1 × 106 خلية لكل فأر متلقي لأن الفئران المتلقية تظهر علامات سريرية لالتهاب القولون ~ 2-3 أسابيع بعد نقل الخلية وتطور التهاب القولون الشديد نسبيا ~ 6 أسابيع بعد نقل الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الحقن داخل الصفاق ، فإن الحقن الوريدي للخلايا في الوريد الذيل يحفز التهاب القولون أكثر اتساقا. لعزل خلايا الصفيحة القولونية ، يجب ألا تجف أنسجة القولون ؛ خلاف ذلك ، فإنه من شأنه أن يقلل من غلة الخلايا وقابليتها للحياة. أحد المخاوف الخاصة هو أن مدة التهاب القولون ستتغير إذا تم نقل الفئران المتلقية بخلايا CBir1 TCR Tg T المعدلة وراثيا أو عولجت بالعقاقير26. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز خلايا CBir1 TCR Tg T أيضا التهابا معويا في الفئران الأخرى التي تعاني من نقص المناعة ، مثل TCRβ / δ-/- الفئران ، التي تفتقر إلى الخلايا التائية27.

نظرا لأن الأدلة المتراكمة تشير إلى دور حاسم للخلايا التائية التفاعلية الخاصة بمستضد الأمعاء البكتيري في التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي ، فإن استخدام الخلايا التائية المحددة لمستضد بكتيري محدد في الأمعاء سيوفر رؤى حول كيفية تحفيز مستضد الأمعاء البكتيري لاستجابات الخلايا التائية للحث على التهاب القولون. مستضد ميكروبات الأمعاء CBir1 السوط وفيرة في الجهاز الهضمي ، والذي يرتبط بالتسبب في IBD8,9. يشبه نموذج التهاب القولون هذا العديد من الخصائص الحرجة لمرض الأمعاء الالتهابي ، بما في ذلك الإسهال وفقدان الوزن والنتائج النسيجية المرضية والاستجابات المناعية المعوية غير الطبيعية. لذلك ، فإن نموذج التهاب القولون هذا مفيد لدراسة آليات مرض الأمعاء الالتهابي البشري ويوفر أداة لتقييم علاجات مرض الأمعاء الالتهابي. ومن المثير للاهتمام أن العمل الأخير الذي قام به Chiaranunt et al. أشار إلى أن خصوصية الخلايا التائية لمستضد الميكروبات CBir 1 وحدها قد لا تكون كافية للحث على تنشيط الخلايا التائية والتهاب القولون. ويتضح ذلك من خلال الخلايا التائية CBir1 TCR Tg T المستحثة من النوع البري في متلقي Rag-/- ، في حين أن خلايا Rag-/- CBir1 T لم تحفز التهاب القولون في منشأتها الحيوانية ، مما يشير إلى أن خلايا الأمعاء التائية التي تستجيب لمستضد بكتيري معين في الأمعاء قد تتطلب بكتيريا أخرى مترابطة ، على سبيل المثال ، Helicobacter spp ، للعمل كمساعد 28 . أحد الجوانب المثيرة لهذا النموذج هو أن مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية ، وهي خلايا Th1 و Th17 و Treg ، موجودة في الصفيحة البروبريا من الفئران المتلقية للقولون ، مما يوفر فرصة فريدة للتحقيق في أدوار ليس فقط الخلايا التائية المستجيبة ولكن أيضا Tregs في التسبب في التهاب القولون 29.

ومع ذلك ، نظرا لأن نموذج التهاب القولون هذا يتم بوساطة الخلايا التائية الخاصة بميكروبات الأمعاء ، فإن أحد القيود على نموذج التهاب القولون هذا هو أن مدة تحريض التهاب القولون قد تختلف في مرافق حيوانية مختلفة اعتمادا على ميكروبات الأمعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد مؤلفون لديهم مصالح مالية أو مهنية أو شخصية متضاربة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK125011 و AI150210 و DK124132 ، وجائزة جامعة تكساس System STARs (Y.C.) ، وصندوق زمالة James W. McLaughlin من الفرع الطبي لجامعة تكساس في Galveston (W.Y). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter MilliporeSigma SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
100-µm strainer BD Biosciences 352360
3-mL Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32 Biolegend 101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 Biolegend 102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 Biolegend 100327
Anti-Mouse CD4 APC Biolegend 100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles BD Biosciences 551539
Anti-Mouse CD4-BV421 Biolegend 100544
Anti-Mouse CD62L-PE Biolegend 104408
Anti-Mouse Foxp3-PE ThermoFisher 12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC Biolegend 505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 Biolegend 506922
Automated Cell Counter Bio-rad TC20
Brefeldin A BD Biosciences 555029
BSA Fisher Bioreagents BP1600-1
C tube Miltenyi 130-093-237
Cell Separation Magnet BD Biosciences 552311
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Dissociator Machine Miltenyi 130-096-427
DNase I Sigma-Aldrich
EDTA Corning 46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0) Corning 46-034-CI
FBS R&D Systems S11550
Flow cytometer BD Biosciences LSD Fortessa
Heat Lamp CoverShield BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit Abcam ab245880
Insulin Syringes BD Biosciences 329412
Ionomycin ThermoFisher I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit ThermoFisher L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers ThermoFisher SHKE6000
NH4Cl Thermo Scientific A687-500
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
RPMI 1640 Medium Cytiva HyClone SH3002702
Sorter BD Biosciences Arial Fusion
Tissue Automatic Processor ThermoFisher STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette Fisher Healthcare 22048142
Tris Base Thermo Scientific BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) Biolegend 424401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
  2. Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
  3. Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
  4. Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
  5. Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
  6. Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
  7. Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
  8. Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
  9. Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
  10. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
  13. Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
  14. Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
  15. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  16. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  18. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  19. Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
  20. Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
  21. Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
  22. Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
  23. Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
  24. Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
  25. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  26. Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
  27. Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
  28. Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
  29. Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).

Tags

الطب، العدد 178،
تحريض التهاب الأمعاء عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR CD4 <sup>+</sup> إلى الفئران التي تعاني من نقص المناعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction … More

Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (178), e63293, doi:10.3791/63293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter