Summary

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

Published: December 16, 2021
doi:

Summary

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/– 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

Abstract

부각의 증가와 함께, 염증성 장 질환 (IBD), 위 장관에 영향을 미치는 만성 질환은 개인과 사회에 상당한 건강 및 재정적 부담을 부과. 따라서 IBD의 발병 기제 및 개발의 근간을 조사하는 것이 중요합니다. 여기서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 전달 대장염 모델이 기재되어 있다. CBir1 flagellin 실험 대장염및 크론병 환자에서 면역 지배적 인 장 세균 항원으로 인식되었습니다. CBir1 TCR 형질 전환기 naϊve CD4+ T 세포, CBir1 플래그렐린에 특정, 면역 결핍 Rag1/– 마우스로 입양 전송 후 만성 대장염을 유도할 수 있다. 질병 엄격은 조직 병리학에 의해 평가됩니다. 대장 라미나 프로프리아의 CD4+ T 세포 표현형도 결정된다. 이 모델은 IBD의 발병을 유도하는 메커니즘을 조사하고 IBD 를 치료하기위한 잠재적 인 약물을 테스트하기위한 이상적인 뮤린 모델을 제공하는 IBD의 개발과 유사합니다.

Introduction

크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)을 중심으로 염증성 장질환(IBD)은 위장관의 만성 재발 염증을 특징으로 하며 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치고 있습니다1. 유전 감수성, 창자 미생물, 면역 반응, 규정식 및 생활양식2를 포함하여 IBD의 발달 그리고 병신에 몇몇 요인이 연루되었습니다. 그러나 IBD의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다.

특정 관심사 중 하나는 장 내 염증 조절에 있어 장 내 미생물군유상과 호스트 면역 반응 사이의 상호 작용입니다3. 장내 미생물은 면역 반응을 활성화할 수 있는 일련의 면역 자극 분자 및 항원을 제공합니다4. 이펙터 T 세포와 조절 T 세포 사이의 균형 (Tregs) 장 항상성을 유지에 중요 한 동안, 창 자 microbiota 항 원에 과도 한 장 점막 CD4+ T 세포 응답 장 염증에 기여 5,6,7. 면역 지배적 인 창 자 microbiota 항원으로, CBir1 flagellin 인간 CD8,9의 발병기와 관련 되어 있다. 더욱이, CBir1 TCR 형질전환(Tg) T 세포의 전달은 면역 결핍 마우스6에서 장 염증을 유도하며, 인간 IBD와 밀접하게 닮은 이 T 세포 전달 모델이 인간 IBD의 메커니즘을 조사하는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.

이 작품은 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 입양 전송에 의해 Rag1/-마우스에서 대장염을 유도하고 질병 심각도를 평가하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 게다가, 예상된 결과가 표시되고, 절차 및 문제 해결의 중요한 단계는 연구원이 장 염증의 병인의 기계장치를 조사하고 IBD 취급을 위한 잠재적인 약을 시험하는 것을 도울 것입니다 토론됩니다.

Protocol

모든 동물 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 텍사스 대학 의료 지부의위원회에 따라 수행되었다. CBir1 TCR Tg 마우스는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 찰스 엘슨 박사에 의해 제공되었습니다. CBir1 TCR Tg 마우스는 여성 또는 남성일 수 있지만 8-12 주에 있어야 합니다. C57BL/6 배경에 있는 Rag1/– 마우스는 잭슨 연구소10으로부터 수득되었다. Rag1/- 마우?…

Representative Results

약 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포는 성인 CBir1 TCR Tg 마우스로부터 분리되었다. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 전송은 수신자 Rag1/– 마우스에서 만성 대장염을 유도. 세포 전달 후, 임상 징후는 체중 감소, 대변 일관성 및 구부러진 자세를 포함하여 장 염증의 진행을 평가하기 위해 모니터링되었습니다. 예상대로, 마우스는 세포 전달 후 약 3 주 동안 무게를 잃기…

Discussion

모든 단계는이 대장염 모델의 재현성에 필수적이지만 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수령인 Rag/- 마우스는 장 염증을 유도하기 위하여 CD4+ T 세포에 적당한 실행 가능한 naϊve 수신해야 합니다. 우리는 MLN 대신 순진한 CD4 + T 세포의 격리를 위해 비장을 사용했습니다. MLN에서 순진한 CD4 + T 세포의 수율은 비장보다 훨씬 낮기 때문입니다. CD62L은 순진한 T 세포…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 보건원 보조금 DK125011, AI150210, DK124132, 텍사스 시스템 STARs 상 (Y.C.), 그리고 갤버스턴 (W.Y.)의 텍사스 대학 의료 지부에서 제임스 W. 맥러플린 펠로우십 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

Materials

0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter MilliporeSigma SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
100-µm strainer BD Biosciences 352360
3-mL Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32 Biolegend 101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 Biolegend 102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 Biolegend 100327
Anti-Mouse CD4 APC Biolegend 100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles BD Biosciences 551539
Anti-Mouse CD4-BV421 Biolegend 100544
Anti-Mouse CD62L-PE Biolegend 104408
Anti-Mouse Foxp3-PE ThermoFisher 12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC Biolegend 505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 Biolegend 506922
Automated Cell Counter Bio-rad TC20
Brefeldin A BD Biosciences 555029
BSA Fisher Bioreagents BP1600-1
C tube Miltenyi 130-093-237
Cell Separation Magnet BD Biosciences 552311
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Dissociator Machine Miltenyi 130-096-427
DNase I Sigma-Aldrich
EDTA Corning 46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0) Corning 46-034-CI
FBS R&D Systems S11550
Flow cytometer BD Biosciences LSD Fortessa
Heat Lamp CoverShield BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit Abcam ab245880
Insulin Syringes BD Biosciences 329412
Ionomycin ThermoFisher I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit ThermoFisher L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers ThermoFisher SHKE6000
NH4Cl Thermo Scientific A687-500
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
RPMI 1640 Medium Cytiva HyClone SH3002702
Sorter BD Biosciences Arial Fusion
Tissue Automatic Processor ThermoFisher STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette Fisher Healthcare 22048142
Tris Base Thermo Scientific BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) Biolegend 424401

References

  1. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
  2. Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
  3. Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
  4. Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. . Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
  5. Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
  6. Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells’ differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
  7. Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
  8. Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
  9. Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn’s disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
  10. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
  13. Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
  14. Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
  15. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  16. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  18. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  19. Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
  20. Yang, W., et al. . Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
  21. Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
  22. Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn’s disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
  23. Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
  24. Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
  25. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  26. Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
  27. Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
  28. Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. . T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
  29. Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).

Play Video

Cite This Article
Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (178), e63293, doi:10.3791/63293 (2021).

View Video