Summary
본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.
Abstract
부각의 증가와 함께, 염증성 장 질환 (IBD), 위 장관에 영향을 미치는 만성 질환은 개인과 사회에 상당한 건강 및 재정적 부담을 부과. 따라서 IBD의 발병 기제 및 개발의 근간을 조사하는 것이 중요합니다. 여기서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 전달 대장염 모델이 기재되어 있다. CBir1 flagellin 실험 대장염및 크론병 환자에서 면역 지배적 인 장 세균 항원으로 인식되었습니다. CBir1 TCR 형질 전환기 naϊve CD4+ T 세포, CBir1 플래그렐린에 특정, 면역 결핍 Rag1/-- 마우스로 입양 전송 후 만성 대장염을 유도할 수 있다. 질병 엄격은 조직 병리학에 의해 평가됩니다. 대장 라미나 프로프리아의 CD4+ T 세포 표현형도 결정된다. 이 모델은 IBD의 발병을 유도하는 메커니즘을 조사하고 IBD 를 치료하기위한 잠재적 인 약물을 테스트하기위한 이상적인 뮤린 모델을 제공하는 IBD의 개발과 유사합니다.
Introduction
크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)을 중심으로 염증성 장질환(IBD)은 위장관의 만성 재발 염증을 특징으로 하며 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치고 있습니다1. 유전 감수성, 창자 미생물, 면역 반응, 규정식 및 생활양식2를 포함하여 IBD의 발달 그리고 병신에 몇몇 요인이 연루되었습니다. 그러나 IBD의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다.
특정 관심사 중 하나는 장 내 염증 조절에 있어 장 내 미생물군유상과 호스트 면역 반응 사이의 상호 작용입니다3. 장내 미생물은 면역 반응을 활성화할 수 있는 일련의 면역 자극 분자 및 항원을 제공합니다4. 이펙터 T 세포와 조절 T 세포 사이의 균형 (Tregs) 장 항상성을 유지에 중요 한 동안, 창 자 microbiota 항 원에 과도 한 장 점막 CD4+ T 세포 응답 장 염증에 기여 5,6,7. 면역 지배적 인 창 자 microbiota 항원으로, CBir1 flagellin 인간 CD8,9의 발병기와 관련 되어 있다. 더욱이, CBir1 TCR 형질전환(Tg) T 세포의 전달은 면역 결핍 마우스6에서 장 염증을 유도하며, 인간 IBD와 밀접하게 닮은 이 T 세포 전달 모델이 인간 IBD의 메커니즘을 조사하는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
이 작품은 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 입양 전송에 의해 Rag1/-마우스에서 대장염을 유도하고 질병 심각도를 평가하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 게다가, 예상된 결과가 표시되고, 절차 및 문제 해결의 중요한 단계는 연구원이 장 염증의 병인의 기계장치를 조사하고 IBD 취급을 위한 잠재적인 약을 시험하는 것을 도울 것입니다 토론됩니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 텍사스 대학 의료 지부의위원회에 따라 수행되었다. CBir1 TCR Tg 마우스는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 찰스 엘슨 박사에 의해 제공되었습니다. CBir1 TCR Tg 마우스는 여성 또는 남성일 수 있지만 8-12 주에 있어야 합니다. C57BL/6 배경에 있는 Rag1/-- 마우스는 잭슨 연구소10으로부터 수득되었다. Rag1/- 마우스는 성별과 연령일치여야 하며, 남성 또는 암컷은 사용할 수 있지만 8-12주에 있어야 합니다. 전체 프로토콜은 그림 1로 요약됩니다.
1. 받는 쥐의 준비
- 동일한 특정 병원균없는 동물 시설에서 자란 C57BL/6 배경에서 Rag1/-- 마우스를 준비하십시오. 전력 분석에 의해 그룹당 마우스 수를 계산11.
참고 : Rag1/- 마우스는 성숙한 T 세포및 B 세포10이 없습니다. - 귀 펀치로 마우스를 표시합니다.
- T 세포 전달의 같은 날에 마우스를 무게.
2. 시약 및 솔루션 준비
참고: 사용되는 시약은 독성 또는 생체 위험이며 취급에는 예방 조치 및 안전 조치가 필요합니다.
- 세척 버퍼 준비: 100x 페니실린-스트렙토마이신 500mL의 RPMI 1640 배지를 500mL에 추가합니다. 완전히 섞어서 4°C에 보관하십시오.
- 트리스-NH4Cl 리시스 버퍼를 준비합니다.
- 솔루션 파트 A. 2.06 g의 트리스 베이스를 100mL의 이중 증류수(ddH2O)에 용해하고 HCl을 사용하여 pH 값을 7.2로 조정합니다.
- ddH2O의 800mL에서 NH4Cl 7.47 g을 용액 을 준비하십시오.
- A와 B를 완전히 섞는다. pH를 측정하고 그렇지 않은 경우 7.2로 조정합니다.
- 총 볼륨을 1000mL로 조정합니다. 오토클레이브를 한 다음 4°C에 보관합니다.
- 격리 버퍼를 준비합니다.
- BSA 2.5g과 EDTA 500 μL(0.5M, pH 8.0)을 1x PBS 500mL에 추가합니다. 그것을 완전히 섞습니다.
- 0.22 μm 진공 구동 일회용 병 상단 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다(재료 표 참조). 4 °C에 보관하십시오.
- FACS 버퍼를 준비합니다. FBS 1mL과 EDTA 50 μL(0.5M, pH 8.0)을 50mL의 세척 버퍼(2.1단계에서 준비)에 추가합니다. 철저히 섞어서 4°C로 보관하십시오.
- 완전한 중간을 준비합니다. 45mL의 세척 버퍼에 5mL의 FBS를 추가합니다. 철저히 섞어서 4°C로 보관하십시오.
- EDTA-PBS 버퍼를 준비합니다.
- 필요한 EDTA-PBS 버퍼의 볼륨을 계산합니다. 볼륨(mL) = 마우스 번호 x 20.
- PBS에 FBS, EDTA 및 HEPES의 적절한 볼륨을 추가합니다 (FBS의 2 %, EDTA0mM, PBS의 HEPES 10 mM) ( 재료 표 참조).
- 37°C 수조에 철저히 섞어서 미리 데우세요.
- 소화 버퍼를 준비합니다.
- 필요한 소화 버퍼의 볼륨을 계산합니다. 볼륨(mL) = 마우스 번호 x 10.
- 세척 버퍼에 FBS, 콜라게나아제 IV 및 DNase I의 적절한 볼륨을 추가 (FBS의 2 %, 콜라게나아제 IV의 0.5 mg / mL, 및 세척 버퍼에서 DNase I의 10 U / mL) ( 재료의 표 참조).
- 37°C 수조에 철저히 섞어서 미리 데우세요.
- 퍼콜 솔루션을 준비합니다.
- 100% 퍼콜을 준비합니다. 원래 Percoll의 45 mL에 10x PBS의 5mL을 추가합니다 ( 재료 표 참조).
- 세척 버퍼에서 2 % FBS를 준비하십시오. 49mL의 세척 버퍼에 1mL의 FBS를 추가합니다.
- 40% 퍼콜 솔루션과 75% 퍼콜 솔루션의 부피를 보정합니다. 40% 퍼콜 솔루션(mL) = 마우스 번호 x 4의 부피; 75% 퍼콜 솔루션(mL) = 마우스 번호 x 2의 부피.
참고: 2.1-2.5 단계에서 준비된 시약/솔루션은 3-4단계에서 사용되며, 2.6-2.8 단계에서 준비된 시약/솔루션은 9단계에서 사용됩니다. 9단계에서 사용되는 모든 시약/솔루션은 신선하게 준비해야 합니다. 모든 단계에 대해 5% 추가 버퍼를 만드는 것이 좋습니다.
3. 비장 CBir1 TCR Tg CD4+ T 셀의 격리
- CO2 안락사 (30%-70% 가스 공기 변위 율)를 가진 자궁 경부 탈구에 의해 CBir1 TCR Tg 마우스/마우스를 안락사시합니다. 70%의 에탄올로 마우스를 적시다.
- ~1cm 좌복부 절개를 수행하고, 복부 근육 조직에서 피부를 당기고, 복부 근육 조직에서 ~3cm 절개를 하고, 멸균 가위와 집게로 비장을 제거합니다. 비장을 미리 차가운 세척 버퍼 5mL가 들어 있는 문화 접시에 놓습니다(2.1단계에서 준비).
- 두 개의 멸균 유리 슬라이드의 거친 표면으로 비장을 갈아. 100 μm 세포 스트레이너를 통과하여 셀 서스펜션을 50mL 원심분리기 튜브로 이송 합니다(재료표 참조). 유리 슬라이드와 문화 접시를 5mL의 사전 냉장 세척 버퍼로 헹굴하고 세척 버퍼를 튜브로 옮춥시다.
- 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 비장 당 미리 따뜻워진 Tris-NH4Cl 리시스 버퍼(2.2단계에서 준비)의 5mL로 세포를 다시 중단합니다. 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 튜브에 10mL의 미리 차가운 세척 버퍼를 추가합니다.
- 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 10mL의 전냉 격리 버퍼로 셀을 다시 중단하십시오(2.3단계에서 준비됨).
- 셀을 계산합니다. 셀 서스펜션 10μL을 트라이팬 블루 10μL와 철저히 섞는다. 혼합물의 10 μL을 슬라이드에 로드하고, 슬라이드를 자동 셀 카운터에 삽입하고( 재료 표 참조) 실행 가능한 셀 번호12를 얻습니다.
참고: 약 1 x 108 세포는 이 단계에서 하나의 기증자 마우스로부터 얻을 수 있다. - 4°C에서 8분 동안 350 x g 에서 3.6 단계에서 나머지 셀 현탁액을 원심분리합니다. 모든 초월제를 폐기합니다.
- 항 마우스 CD4 자기 입자를 철저히 (재료 표 참조) 소용돌이, 직접 107 세포 당 입자의 50 μL을 추가하고 철저하게 세포 펠릿과 혼합. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 다른 상업용 CD4+ T 셀 농축 키트는 여기에서 사용할 수 있습니다. - 세포 입자 현탁액을 멸균 수집 튜브로 옮기십시오. 3.5mL의 사전 냉간 격리 버퍼를 튜브에 넣습니다.
- 튜브를 실온에서 8분 동안 셀 분리 자석( 재료 표 참조)에 놓습니다. 3mL 전송 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 흡입합니다.
- 세포 분리 자석에서 튜브를 제거( 재료 표 참조), 3.5mL 전냉 격리 버퍼로 세포를 다시 중단하고 실온에서 4분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 3mL 전송 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 흡입합니다.
- 3.11 단계를 반복합니다.
- 전감기 FACS 버퍼 1mL로 세포를 다시 중단합니다(2.4단계에서 준비).
4. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 셀의 정화
- 다음 3.6 단계를 따르는 셀을 계산합니다.
- 세포 농도가 >107/mL인 경우, 세포 농도가 107/mL에 ≤ 있는지 확인하기 위해 FACS 버퍼의 부피를 추가합니다.
참고: ~1 × 107 세포는 이 단계에서 하나의 기증자 마우스로부터 얻을 수 있다. - 안티 마우스 CD4-APC의 10 μL, 안티 마우스 CD25-Percp/Cy5.5의 10 μL, 및 안티 마우스 CD62L-PE13,14의 10 μL로 표면 마커를 얼룩지게 합니다(재료표 참조). 부드럽게 섞어서 어둠 속에서 4°C에서 30분간 배양합니다.
- 전감기 FACS 버퍼2mL로 셀을 세척합니다. 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 3mL 전송 파이펫을 사용하여 모든 수퍼넌트.
- 4.4 단계를 반복합니다.
- 전감기 FACS 버퍼에서 세포를 40 x 106/mL 의 농도로 다시 일시 중지합니다.
참고: 선별기가 막히는 것을 방지하려면 70 μm 스트레이너를 통해 셀을 전달합니다. - DAPI의 0.1 μg/mL을 추가합니다.
참고: DAPI는 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다. - 정렬된 세포를 수집하기 위한 완전한 매체(2.5단계에서 제조)의 4mL를 포함하는 15mL 원심분리기 튜브를 준비한다.
- 셀을 선별기위에 로드합니다. 순도 모드에서 단일 실행 가능한 naϊve CD4+ T 셀(DAPI-CD4+ CD25- CD62L+ 셀)을 순도 모드(노즐 크기: 70 μm; 압력: 70 PSI; 이벤트 요금: 8000-12000 이벤트/s; 효율성: 90% 이상 (그림 2).
참고: Naϊve CD4+ T 셀은 CD62L의 높은 발현을 발현하고 활성화 마커 CD2513,14가 부족합니다. - 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 3mL 전송 파이펫을 사용하여 모든 슈퍼 네티츠를 흡입합니다.
- 1x PBS의 500 μL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 3.6 단계 다음 셀 카운트
참고: ~5 × 106 세포는 이 단계에서 하나의 기증자 마우스로부터 얻을 수 있다.
5. 받는 마우스로 세포 전송
- 1x PBS를 추가하여 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 셀을 5 x 106/mL 농도로 재차판합니다.
- 열램프 아래에서 래그/-마우스를 4분 동안 데우고 마우스 제지기를 사용하여 마우스를 억제합니다.
- 1mL 인슐린 주사기(27G)를 이용하여 래그/-마우스 의 꼬리 정맥으로 세포 현탁액의 200 μL을 정맥으로 이체하였다( 재료표 참조).
참고: 한 기증자 마우스의 세포는 약 5명의 수신자 마우스로 전송하기에 충분합니다.
6. 대장염 진행 중 임상 징후 모니터링
- 매주 마우스의 무게를 측정하고 마우스가 원래 무게의 >5 %를 잃기 시작하면 일주일에 두 번 관찰을 증가시다.
- 부드럽게 자극할 때 마우스 반응/움직임을 관찰합니다.
- 다른 임상 이상을 관찰하십시오. 즉, 자세와 대변 일관성.
7. 결장 수집 및 조직 병리학 점수
- 체중 감소의 시점에서 CO2 로 자궁 경부 탈구에 의해 받는 마우스를 희생>원래 체중또는 6 주 후 세포 전달의 20%. 70%의 에탄올로 마우스를 적시다.
- ~1cm 복부 중선 피부 절개를 수행하고, 복부 근육 조직에서 피부를 당기고, 복부 근육 조직에서 ~3cm 절개를 하고, cecum을 식별하고, 멸균 가위와 집게로 결장 전체를 제거합니다. 문화 접시에 미리 차가운 PBS로 결장 젖습니다.
- 결장을 길게 절제하고 감기 전 PBS로 헹구습니다. 콜론의 1/3을 세로로 잘라냅니다.
- 결장 스트립을 종이 타월에 놓고 밝은 면을 위쪽으로 향합니다. 이쑤시개15를 사용하여 스위스 롤링을 수행합니다.
- 콜론 스위스를 카세트에 넣고 카세트를 24 h16에 10% 버퍼링한 포르말린에 넣고 자동 프로세서( 재료 표 참조)와 파라핀 포함을 사용하여 탈수합니다.
- 마이크로토메에 5μm 조직 섹션을 자르고 슬라이드에 장착하고 Hematoxylin 및 eosin (H&E) 얼룩17 을 수행합니다 ( 재료표 참조).
- 최대 12에 대한 6개의 매개 변수 각각에 대한 점수를 결합하여 조직 병리학 점수를 결정합니다. 라미나 프로프리아 염증 (정상, 0; 온화한, 1; 중간, 2; 심한, 3); 잔 세포 손실 (정상, 0; 온화한, 1; 중간, 2; 심한, 3); 비정상적인 토굴 (정상, 0; 초플라스틱, 1; 해체, 2; 토굴 손실, 3); 토굴 농양 (결석, 0; 현재, 1); 점막 침식 및 궤양 (정상, 0; 온화한, 1; 중간, 2; 심한, 3); 및 부막 변화 (없음, 0; 서브mucosa, 1; 교간, 2)18.
8. 장 라미나 프로프리아 세포의 격리 및 염색
- 7.3 단계 후, 0.5-1cm 조각으로 결장의 또 다른 2/3을 잘라 사전 차가운 PBS로 씻어.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 콜론 세그먼트를 20mL 사전 따뜻하게 된 EDTA-PBS 버퍼로 이송합니다. 37°C에서 30분 동안 250rpm 흔들리면 배양합니다.
- 튜브를 소용돌이시키고, 멸균 체(직경: 0.01 인치)를 통과시킴으로써 초월제를 버리고, 50mL 튜브에서 20mL의 전감기 PBS로 결장 세그먼트를 재연한다.
- 8.3 단계를 두 번 반복합니다.
- 콜론 세그먼트를 10mL의 미리 데운 소화 버퍼가 들어 있는 C 튜브( 재료 표 참조)에 놓습니다.
- 튜브를 소시아토르 기계에 놓고( 재료 표 참조) 25분 동안 "37C_m_LPDK_1" 프로그램에 따라 배양합니다.
참고: "37C_m_LPDK_1"은 샘플을 교반하고 37°C에서 유지하는 데 사용되는 해리시어터 기계의 표준 사전 설정 프로그램입니다. - 조직이 완전히 소화되었는지 확인하여 소화 완충제에 조직이 없는 지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 "37C_m_LPDK_1"의 프로그램을 반복합니다.
- 금속 체와 100 μL 스트레이너를 통과하여 상체를 수집합니다. 10mL의 사전 감기 PBS로 헹구는 다.
- 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 모든 슈퍼네이넌트에 흡인.
- 40% Percoll 용액의 4mL에서 세포를 다시 중단하고 철저히 혼합합니다(2.8단계에서 준비).
- 15mL 원심분리기 튜브에서 75% 퍼콜 용액의 2mL로 재중단 된 세포를 전송합니다.
- 20°C에서 20분 동안 850 x g 에서 세포 현탁액원심(가속 램프: 0; 브레이크 램프 : 0).
- 3mL 이송 피펫을 사용하여 상단 층의 지방을 조심스럽게 제거하고 50mL 튜브에서 20mL의 세척 버퍼로 셀 층을 옮기십시오.
- 4°C에서 8분 동안 350 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 모든 수퍼넌트는 폐기하고 완료 된 매체의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 다음 3.6 단계를 따르는 셀을 계산합니다.
- 24웰 플레이트에 세포를 시드하고, 2시간 동안 50 ng/mL의 Phorbol-12-myristate 13-아세테이트 및 750 ng/mL의 이오노마이신을 활성화하고, 브레펠딘 A의 5 μg/mL을 3시간 동안 배양합니다( 재료표 참조).
참고: 사용되는 시약은 독성이 있으며 취급에는 예방 조치및 안전 조치가 필요합니다. - 세포를 FACS 튜브로 옮기고, FACS 버퍼 2mL를 추가하고, 세포를 4°C에서 8분 동안 350 x g 로 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 12.5 μg/mL의 항마우스 CD16/3219 로 세포를 배양하여( 재료표 참조) FACS 버퍼를 사용하여 실온에서 5분 동안 Fc 수용체를 차단합니다.
- 라이브/데드 및 표면 마커용 얼룩.
- FACS 버퍼2mL로 세포를 세척하고 원심분리기는 4°C에서 8분 동안 350 x g 로 세척합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 상염색및표면마커(즉, 항마우스 CD3 및 항마우스 CD4 항체)20 ( 재료표 참조)을 가진 세포를 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 최적화된 농도로 염색한다.
참고: 사용되는 시약은 독성이 있으며 취급에는 예방 조치및 안전 조치가 필요합니다.
- 세포 및 핵 염색을 수행합니다.
- FACS 버퍼 2mL을 추가하고 세포 현탁액을 350 x g 에서 4 °C에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 전사 계수 수정 작업 용액의 200 μL으로 세포를 재연하여 세포를 40 분 동안 충혈하고 수정합니다.
- 파름 버퍼 2mL을 추가하고 4 °C에서 8 분 동안 350 x g 에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 세포 및 핵 마커(즉, 항마우스 IFNγ, 항마우스 IL-17A 및 항 마우스 Foxp3 항체)로 세포를 실내 온도에서 30 분-1 h에 대한 파마 버퍼( 재료 표 참조)로 배양합니다.
- 파름 버퍼 2mL을 추가하고 4 °C에서 8 분 동안 350 x g 에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- FACS 버퍼 1mL을 추가하고 세포 현탁액을 350 x g에서 4 °C에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- FACS 버퍼200μL로 셀을 다시 중단하고 유동 사이토미터에서 샘플을 실행 합니다(재료 표 참조).
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Representative Results
약 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포는 성인 CBir1 TCR Tg 마우스로부터 분리되었다. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 전송은 수신자 Rag1/-- 마우스에서 만성 대장염을 유도. 세포 전달 후, 임상 징후는 체중 감소, 대변 일관성 및 구부러진 자세를 포함하여 장 염증의 진행을 평가하기 위해 모니터링되었습니다. 예상대로, 마우스는 세포 전달 후 약 3 주 동안 무게를 잃기 시작했고, 체중은 원래 체중 6 주 후 세포 전달의 약 80 %-85 %에 도달했습니다 (그림 3). 추가적으로, 마우스는 약 3-4 주 세포 전송 을 보여주고 가혹한 대장염을 개발할 때 구부러진 자세를 보여주었습니다. 결장의 총 형태가 표시되었고, 대장염 심각도는 마우스가 희생되었을 때 조직병리학 점수에 의해 평가되었다. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포를 수신하는 마우스는 짧은 결장 길이를 보였다 6 주 후 세포 전송 (도 4A). 수취인 마우스는 장 내 라미나 프로프리아 4주 후 세포 전달(도 4C), 잔잔 세포 손실 및 장 상피 세포 증식 5주 후 세포 전달(도 4D), 점막 침식 및 염증성 세포 침투에서 더 많은 세포 침투를 입증하였다(도 4F 이송). 동시에, RAG1/--마우스만으로는 PBS를 받는 염증이 없었다(도 4B). 게다가, 소장에 염증이 없습니다, 그러나 cecum는 염증이 있습니다. 또한, 대장라미나 프로프리아내 CD4+ T 세포 표현형은 혈류 세포측정에 의해 결정되었다. 게이팅 전략이 표시됩니다(그림 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포는 IFNγ+ Th1 세포, IL-17A+ Th17 세포, IFNγ+ IL-17+ CD4+ T 세포(그림 5F), 및 Foxp3+ Treg 세포Rag1/-받는 사람의 장 라미나 프로프리아(그림 5G)로 개발되었다.
그림 1: 유도 대장염의 절차와 질병 심각도의 평가. 비장 CD4+ T 세포는 자기 구슬을 사용하여 CBir1 TCR 형질 생성 마우스로부터 분리된 다음, naϊve T 세포는 정렬에 의해 정제되었다. CBir1 TCR 형질 전환기 naϊve T 세포는 그 때 수신자 Rag1/- 마우스로 정맥으로 옮겨졌습니다. 마우스가 세포 전후 약 6주 동안 희생되었을 때, 대장염 심각도는 조직병리학점수에 의해 평가되었다. 대장 라미나 프로프리아의 CD4+ T 세포 표현형은 혈류 세포측정에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CBir1 TCR 형질 전환 naϊve T 셀을 정렬하기위한 게이팅 전략. 실행 가능한 단일 CBir1 TCR 트랜스제닉 naϊve T 세포는 이물질(A), 비단세포(B-C), 죽은 세포(D), 및 활성화된 세포(E-F)를 배제함으로써 정제되었다. 하위 인구는 (G)에 표시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: Rag1/- 마우스 포스트 T 세포 전달의 중량 변화. 1 x 106 CBir1 TCR 형질전환 naϊve T 세포는 Rag1/-- 마우스로 옮겨졌고, PBS를 수신하는 Rag1/- 마우스를 대조군으로 사용하였다. 마우스 가중치는 매주 기록되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되었습니다. 학생의 t-테스트; p<0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: CBir1 TCR 트랜스제닉 naϊve T 세포를 받는 Rag1/-- 마우스로부터 콜론의 중형태 및 헤마톡시린 및 에신 염색. (A) 수신자 마우스는 세포 전후 6주 후 희생되었고, 결장의 총 형태가 나타났다. (B-E) 수신자 마우스는 서로 다른 시점에서 희생되었고, Rag1-/-- 마우스는 대조군으로 PBS를 수신하였다. 결장은 헤마톡시린과 에진 염색을 위해 처리되었다. 헤마톡시린과 결장의 에진 염색의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm. (F) 조직 병리학 점수가 결정되었다. 데이터는 SD에 ± 평균으로 표시되었습니다 .
그림 5: CBir1 TCR 형질 naϊve T 세포를 수신하는 래그/-마우스 의 대장 라미나 프로피아내의 CD4+ T 세포 표현형. 수령인 마우스가 세포 전달 후 6주 후 희생되었을 때, 대장 라미나 프로프리아 세포는 CD4+ T 세포 표현형을 염색하기 위해 격리되었다. (A-E) T 세포 표현형의 분석을 위한 게이팅 전략. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T 세포, IFNγ+ CD4+ T 세포, IL-17+ IFNγ+ CD4+ T 세포, 및 (G) Foxp3+ Tregs는 유동 세포측정에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
모든 단계는이 대장염 모델의 재현성에 필수적이지만 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수령인 Rag/- 마우스는 장 염증을 유도하기 위하여 CD4+ T 세포에 적당한 실행 가능한 naϊve 수신해야 합니다. 우리는 MLN 대신 순진한 CD4 + T 세포의 격리를 위해 비장을 사용했습니다. MLN에서 순진한 CD4 + T 세포의 수율은 비장보다 훨씬 낮기 때문입니다. CD62L은 순진한 T 세포에서 높게 발현되고, CD44 및 CD25는 T cells13,14의 활성화 마커이다. 이 연구에서는 CD4+ T 세포를 비장으로부터 격리하기 위해 먼저 안티 CD4 자기 구슬을 사용했습니다. 그런 다음 우리는 순진한 CD4+ T 세포의 절연을 위해 안티 CD4, 안티 CD62L 및 안티 CD25 항체의 조합을 사용했다13,14. 연구원은 순진한 CD4+ T 세포를 분류하기 위한 그밖 마커를 사용할 수 있었습니다. CD45RBhi는 또한 순진한 T 세포의 마커입니다. CD45RBhi CD25-CD4+ T 세포는 일반적으로 야생형 비TCR 형질형 T cells23의 순진한 T 세포로 사용된다. 따라서, 세포를 선별하고 T 세포를 수신자 마우스로 정맥 주사하는 기술이 필수적이다. 게이팅 프로토콜을 템플릿으로 설정하면 오류가 적어 실험 속도를 높이는 데 도움이 됩니다. 세포 사멸을 피하기 위해 세포는 항상 얼음 위에 보관해야합니다. 게다가, DAPI를 가진 염색 세포는 DAPI가 그대로 세포 막을 통해 통과할 수 없기 때문에 죽은 세포를 제외하기 위해 높게 추천됩니다, 우수한 죽은 세포 프로브24 만들기. 꼬리 정맥의 팽창을 자극하기 위해 마우스를 따뜻하게하면 정맥 주사에 대한 더 나은 정맥 가시성을 제공합니다. 모든 절차는 숙련 된 연구원에 의해 수행 하는 것이 좋습니다.
많은 요인이 대장염 모델의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다., 주의를 기울여야 하는. 첫째, 수령인 Rag1/- 마우스는 나이와 성별 일치해야 합니다. CD45RBhi T 세포 전달 모델에서는, 남성과 여성 기증자의 T 세포는 남성 Rag-/-- 수령인에게 전송될 수 있고, 여성 기증자만 여성 수령인23를 사용할 때 사용될 수 있다. 그러나, 우리는 남성과 여성 받는 사람 사이 중요 한 차이 볼 수 없습니다. 수령마우스는 여성 또는 남성일 수 있고, 남성 기증자에게서 T 세포는 또한 여성 수신자에 있는 대장염을 유도할 수 있습니다. 체중 변화는 대장염 진행의 귀중한 지표이기 때문에, 8-12 주 사이에 받는 마우스를 사용하여 안정적인 체중 선을 제시하는 것이 좋습니다. 이러한 수령마우스는 대장염 발달 조절에 미생물이 중요하기 때문에 동물 시설의 동일한 방에서 사육되고 보관되어야 합니다25. 대장염을 개발하는 시간은 CBir1 TCR Tg 순진한 CD4 T 세포의 다른 숫자를 전송할 때 변화합니다. 예상대로, 더 적은 세포는 대장염의 유도를 위해 더 긴 시간을 필요로 하고, 세포의 더 높은 수는 대장염의 유도를 위한 더 짧은 시간을 요구합니다. 수령마우스당 1 x 106세포를 사용하는 것이 권장되는 것은 수취인 마우스가 대장염의 임상 징후를 입증하기 때문에 ~2-3주 후 세포 전달후 세포 전달및 상대적으로 심한 대장염 ~6주 후 세포 전달을 개발하기 때문에 권장된다. 또한, 복막 주사와 비교하여, 꼬리 정맥내 세포의 정맥 내 주사는 보다 일관된 대장염을 유도한다. 대장 라미나 프로프리아 세포의 격리를 위해 결장 조직이 건조해서는 안됩니다. 그렇지 않으면 세포의 수율과 생존력을 감소시겠습니다. 특정 관심사 중 하나는 수취인 마우스가 유전자 변형 CBir1 TCR Tg T 세포로 전송되거나 약물로 치료되는 경우 대장염의 지속 시간이 변경될 것이라는 것입니다26. 또한, CBir1 TCR Tg T 세포는 또한 T 세포가 부족한 TCRβ/δ/-- 마우스와 같은 다른 면역 결핍 마우스에서 장 염증을 유도한다.
축적 된 증거는 IBD의 병원체에서 장 세균 항원 특이적 반응성 T 세포의 중요한 역할을 나타내기 때문에, 정의된 장 세균 항원을 위해 특정 한 T 세포를 사용하면 장내 세균 항원항이 대장염을 유도하기 위해 T 세포 반응을 유도하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 장 내 미생물균증 항원 CBir1 플래그렐린은 IBD8,9의 발병기와 관련된 위장관에 풍부하다. 이 대장염 모형은 설사, 체중 감소, 조직 병리학 사실 인정 및 이상한 장 면역 반응을 포함하여 IBD의 몇몇 중요한 특성을 유사합니다. 따라서, 본 대장염 모델은 인간 IBD의 메커니즘을 연구하는 데 유용하며 IBD에 대한 치료법을 평가하는 도구를 제공한다. 흥미롭게도, 최근 치아라난트 등의 연구에 따르면 미생물CBir 1 항원만으로는 T 세포 특이성이 T 세포 활성화 및 대장염을 유도하기에 충분하지 않을 수 있음을 지적했다. 이것은 야생 형 CBir1 TCR Tg Tg T 세포가 래그 / - 받는 사람에서 대장염을 유도한 반면, 래그 / - CBir1 T 세포는 동물 시설에서 대장염을 유발하지 않은 반면, 특정 세균 항원에 반응하는 장 T 세포는 다른 상호 관련된 교만박테리아를 요구할 수 있음을 시사합니다(예: 헬릭로박터 spp) 및 ajut8로 기능하기 . 이 모형의 흥미진진한 양상은 다른 T 세포 서브셋, 즉 Th1, Th17 및 Treg 세포가 대장균 수령인 마우스의 라미나 프로프리아에 존재한다는 것입니다, 이는 대장균29의 병인에 있는 효과자 T 세포 뿐 아니라 Tregs의 역할을 조사하기 위한 유일한 기회를 제공합니다299.
그러나, 이 대장염 모형이 창자 microbiota 특정 T 세포에 의해 매개되기 때문에, 이 대장염 모형에 대한 1개의 제한은 대장염의 유도기간이 창자 microbiota에 따라서 다른 동물 시설에서 변화할 수 있다는 것입니다.
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Disclosures
어떤 저자도 재정적, 직업적 또는 개인적인 이해관계가 상충하는 저자가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 보조금 DK125011, AI150210, DK124132, 텍사스 시스템 STARs 상 (Y.C.), 그리고 갤버스턴 (W.Y.)의 텍사스 대학 의료 지부에서 제임스 W. 맥러플린 펠로우십 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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