Summary
In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.
Abstract
Con l'aumento dell'incidenza, le malattie infiammatorie intestinali (IBD), che sono malattie croniche che colpiscono il tratto gastrointestinale, impongono un notevole onere sanitario e finanziario agli individui e alla società. Pertanto, è fondamentale studiare i meccanismi alla base della patogenesi e dello sviluppo dell'IBD. Qui, viene descritto un modello di colite da trasferimento delle cellule T antigene-antigene specifico del microbiota intestinale. La flagellina CBir1 è stata riconosciuta come l'antigene batterico intestinale immunodominante nella colite sperimentale e nei pazienti con malattia di Crohn. Le cellule T CBir1 TCR transgeniche naϊve CD4+ , specifiche per la flagellina CBir1, possono indurre la colite cronica dopo il trasferimento adottivo in topi Rag1-/- immunodeficienti. La gravità della malattia è valutata dall'istopatologia. Vengono anche determinati i fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon. Questo modello assomiglia molto allo sviluppo dell'IBD, che fornisce un modello murino ideale per studiare i meccanismi che guidano la patogenesi dell'IBD e testare i potenziali farmaci per il trattamento dell'IBD.
Introduction
Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), tra cui principalmente il morbo di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC), sono caratterizzate da infiammazione cronica, recidivante-remittente del tratto gastrointestinale, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. Diversi fattori sono stati implicati nello sviluppo e nella patogenesi dell'IBD, tra cui la suscettibilità genetica, il microbiota intestinale, le risposte immunitarie, la dieta e lo stile di vita2. Tuttavia, l'esatto meccanismo di IBD non è ancora completamente compreso.
Uno degli interessi particolari è l'interazione tra il microbiota intestinale e le risposte immunitarie dell'ospite nella regolazione dell'infiammazione intestinale3. Il microbiota intestinale fornisce una serie di molecole e antigeni immunostimolatori, che possono attivare le risposte immunitarie4. Mentre l'equilibrio tra cellule T effettrici e cellule T regolatorie (Tregs) è fondamentale per mantenere l'omeostasi intestinale, l'eccessiva risposta delle cellule T CD4+ della mucosa intestinale agli antigeni del microbiota intestinale contribuisce all'infiammazione intestinale5,6,7. Come antigene immunodominante del microbiota intestinale, la flagellina CBir1 è stata correlata alla patogenesi della CD8,9 umana. Inoltre, il trasferimento di cellule T transgeniche CBir1 TCR (Tg) induce infiammazione intestinale in topi immunodeficienti6, molto simile all'IBD umano, indicando che questo modello di trasferimento delle cellule T aiuta a studiare i meccanismi dell'IBD umano.
Questo lavoro descrive il protocollo dettagliato di indurre la colite nei topi Rag1-/- mediante trasferimento adottivo di cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ e valutare la gravità della malattia. Inoltre, vengono mostrati i risultati attesi e vengono discussi i passaggi critici della procedura e la risoluzione dei problemi, che aiuteranno i ricercatori a studiare i meccanismi di patogenesi dell'infiammazione intestinale e testare i potenziali farmaci per il trattamento dell'IBD.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo il Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Texas Medical Branch. I topi CBir1 TCR Tg sono stati forniti dal Dr. Charles Elson dell'Università dell'Alabama a Birmingham. I topi CBir1 TCR Tg possono essere femmine o maschi, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. I topi Rag1-/- sullo sfondo C57BL/6 sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory10. I topi Rag1-/- devono essere abbinati al sesso e all'età, e possono essere usati maschi o femmine, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.
1. Preparazione dei topi riceventi
- Preparare topi Rag1-/- sullo sfondo C57BL/6, allevati nella stessa specifica struttura animale priva di agenti patogeni. Calcolare il numero di topi per gruppo mediante l'analisi di potenza11.
NOTA: i topi Rag1-/- non hanno cellule T mature e cellule B10. - Segna i topi con un pugno all'orecchio.
- Pesare i topi lo stesso giorno del trasferimento delle cellule T.
2. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni
NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici o a rischio biologico e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza.
- Preparare il tampone di lavaggio: aggiungere 5 ml di penicillina-streptomicina 100x in 500 ml di rpmI 1640 medio. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
- Preparare il tampone di lisi Tris-NH4Cl.
- Preparare la soluzione Parte A. Sciogliere 2,06 g di base di Tris in 100 mL di acqua a doppia distillazione (ddH2O) e regolare il valore del pH a 7,2 con HCl.
- Preparare la soluzione Parte B. Sciogliere 7,47 g di NH4Cl in 800 mL di ddH2O.
- Mescolare accuratamente A e B. Misurare il pH e regolarlo a 7,2 in caso contrario.
- Regolare il volume totale a 1000 ml. Autoclave e poi conservare a 4 °C.
- Preparare il buffer di isolamento.
- Aggiungere 2,5 g di BSA e 500 μL di EDTA (0,5 M, pH 8,0) in 500 mL di 1x PBS. Mescolare accuratamente.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro monouso per bottiglie da 0,22 μm sottovuoto (vedere Tabella dei materiali). Conservare a 4 °C.
- Preparare il buffer FACS. Aggiungere 1 mL di FBS e 50 μL di EDTA (0,5 M, pH 8,0) in 50 mL di tampone di lavaggio (preparato al punto 2.1). Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
- Preparare il mezzo completo. Aggiungere 5 ml di FBS in 45 ml di tampone di lavaggio. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
- Preparare il buffer EDTA-PBS.
- Calcolare il volume del buffer EDTA-PBS necessario. Volume (mL) = numero del mouse x 20.
- Aggiungere il volume appropriato di FBS, EDTA e HEPES nel PBS (2% di FBS, 0,5 mM di EDTA, 10 mM di HEPES in PBS) (vedere Tabella dei materiali).
- Mescolare accuratamente e preriscaldare a bagnomaria a 37 °C.
- Preparare il buffer di digestione.
- Calcolare il volume del buffer di digestione necessario. Volume (mL) = numero del mouse x 10.
- Aggiungere il volume appropriato di FBS, collagenasi IV e DNasi I nel tampone di lavaggio (2% di FBS, 0,5 mg / mL di collagenasi IV e 10 U / mL di DNasi I nel tampone di lavaggio) (vedere Tabella dei materiali).
- Mescolare accuratamente e preriscaldare a bagnomaria a 37 °C.
- Preparare la soluzione Percoll.
- Prepara 100% Percoll. Aggiungere 5 ml di PBS 10x in 45 mL di Percoll originale (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare il 2% di FBS nel tampone di lavaggio. Aggiungere 1 mL di FBS in 49 mL di tampone di lavaggio.
- Caulculare il volume del 40 % della soluzione di Percoll e del 75 % della soluzione di Percoll. Volume della soluzione di Percoll al 40% (mL) = numero del mouse x 4; Volume della soluzione di Percoll al 75% (mL) = numero del mouse x 2.
NOTA: i reagenti/soluzioni preparati nei passaggi 2.1-2.5 saranno utilizzati nei passaggi 3-4 e quelli preparati nei passaggi 2.6-2.8 saranno utilizzati nel passaggio 9. Tutti i reagenti/soluzioni utilizzati nella fase 9 devono essere preparati al momento. Si consiglia di aggiungere il 5% di buffer in più per tutti i passaggi.
3. Isolamento delle cellule T spleniche CBir1 TCR Tg CD4+
- Eutanasia CBir1 TCR Tg topo/topi da una lussazione cervicale con eutanasia CO2 (tasso di spostamento gas-aria del 30%-70%). Bagnare i topi con il 70% di etanolo.
- Eseguire un'incisione dell'addome sinistro di ~ 1 cm, allontanare la pelle dal tessuto muscolare addominale, praticare un'incisione di ~ 3 cm nel tessuto muscolare addominale e rimuovere la milza con forbici e pinze sterili. Introdurre la milza in un piatto di coltura contenente 5 ml di tampone di lavaggio pre-freddo (preparato al punto 2.1).
- Macinare la milza con la superficie ruvida di due vetrini sterili. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 50 mL passando attraverso un filtro cellulare da 100 μm (vedere Tabella dei materiali). Risciacquare i vetrini e il piatto di coltura con 5 ml di tampone di lavaggio pre-freddo e trasferire il tampone di lavaggio nel tubo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare le cellule con 5 mL di tampone di lisi Tris-NH4Cl preriscaldato (preparato nel passaggio 2.2) per milza. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio pre-freddo al tubo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospese le cellule con 10 mL di tampone di isolamento pre-freddo (preparato nella fase 2.3).
- Contare le celle. Mescolare accuratamente 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di tripano blu. Caricare 10 μL della miscela su un vetrino, inserire il vetrino nel contatore automatico di celle (vedere Tabella dei materiali) e ottenere il numero di cella vitale12.
NOTA: Circa 1 x 108 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio. - Centrifugare la restante sospensione cellulare dal punto 3.6 a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare tutti i supernatanti.
- Ruotare accuratamente le particelle magnetiche CD4 anti-mouse (vedere Tabella dei materiali), aggiungere direttamente 50 μL delle particelle per 107 celle e mescolare accuratamente con i pellet di cellule. Incubare per 30 minuti a 4 °C.
NOTA: qualsiasi altro kit commerciale di arricchimento delle cellule T CD4 + può essere utilizzato qui. - Trasferire la sospensione di particelle cellulari in un tubo di raccolta sterile. Aggiungere 3,5 mL di tampone di isolamento pre-freddo nel tubo.
- Posizionare il tubo sul magnete di separazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) per 8 minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
- Rimuovere il tubo dal magnete di separazione cellulare (vedere Tabella dei materiali), risospesare le celle con un tampone di isolamento pre-freddo da 3,5 mL e posizionare il tubo sul magnete per 4 minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
- Ripetere il passaggio 3.11.
- Risospendare le celle con 1 mL di tampone FACS pre-freddo (preparato nel passaggio 2.4).
4. Purificazione delle cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T
- Contare le celle dopo il passaggio 3.6.
- Se la concentrazione cellulare è >107/mL, aggiungere un volume di tampone FACS per assicurarsi che la concentrazione cellulare sia ≤ 107/mL.
NOTA: ~1 × 107 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio. - Macchiare i marcatori superficiali con 10 μL di CD4-APC anti-mouse, 10 μL di CD25-Percp/Cy5.5 anti-mouse e 10 μL di CD62L-PE13,14 anti-mouse (vedere Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
- Lavare le celle con 2 ml di tampone FACS pre-freddo. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
- Ripetere il passaggio 4.4.
- Risospesere le cellule alla concentrazione di 40 x 106/mL nel tampone FACS pre-freddo.
NOTA: per evitare che la selezionatrice si intasi, far passare le cellule attraverso un filtro da 70 μm. - Aggiungere 0,1 μg/mL di DAPI.
NOTA: DAPI viene utilizzato per escludere le cellule morte. - Preparare tubi centrifughi da 15 mL contenenti 4 mL di Complete Medium (preparati al punto 2.5) per la raccolta delle celle selezionate.
- Caricare le celle sullo smistatore. Ordinare le singole celle T NAΪve CD4+ (cellule DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ) in modalità purezza (Dimensione ugello: 70 μm; Pressione: 70 PSI; Frequenza eventi: 8000-12000 eventi/s; Efficienza: superiore al 90%) (Figura 2).
NOTA: Le cellule T Naϊve CD4+ esprimono un'alta espressione di CD62L e mancano del marcatore di attivazione CD2513,14. - Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
- Risospese le cellule in 500 μL di 1x PBS.
- Contare le celle dopo il passaggio 3.6
NOTA: ~5 × 106 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio.
5. Trasferimento cellulare nei topi riceventi
- Risospesso le cellule T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ alla concentrazione 5 x 106/mL aggiungendo 1x PBS.
- Riscaldare i topi Rag-/- sotto una lampada di calore (vedi Tabella dei materiali) per 4 minuti e trattenere i topi usando un dispositivo di ritenuta per mouse.
- Trasferire per via endovenosa 200 μL della sospensione cellulare nella vena della coda dei topi Rag-/- utilizzando una siringa da insulina da 1 mL (27 G) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: le cellule di un topo donatore sono sufficienti per trasferirsi a circa cinque topi riceventi.
6. Monitoraggio dei segni clinici durante la progressione della colite
- Pesare i topi ogni settimana e aumentare l'osservazione a due volte a settimana una volta che i topi iniziano a perdere >5% dei pesi originali.
- Osservare la risposta / movimento dei topi quando stimolati delicatamente.
- Osservare altre anomalie cliniche. cioè, postura e consistenza delle feci.
7. Raccolta del colon e punteggio istopatologico
- Sacrificare i topi riceventi da una lussazione cervicale con CO2 in un punto temporale della perdita di peso >20% del peso originale o 6 settimane dopo il trasferimento cellulare. Bagnare i topi con il 70% di etanolo.
- Eseguire un'incisione cutanea ventrale della linea mediana di ~ 1 cm, allontanare la pelle dal tessuto muscolare addominale, praticare un'incisione di ~ 3 cm nel tessuto muscolare addominale, identificare il cieco e rimuovere l'intero colon con forbici e pinze sterili. Bagnare il colon con PBS pre-freddo in un piatto di coltura.
- Incidere il colon longitudinalmente e risciacquarlo con PBS pre-freddo. Tagliare 1/3 del colon longitudinalmente.
- Posizionare la striscia del colon in un tovagliolo di carta con il lato luminale rivolto verso l'alto. Eseguire la laminazione svizzera con uno stuzzicadenti15.
- Posizionare il colon svizzero in una cassetta e mettere la cassetta in formalina tamponata al 10% per 24 ore 16, seguita da disidratazione utilizzando un processore automatizzato (vedi Tabella dei materiali) e incorporamento di paraffina.
- Tagliare sezioni di tessuto da 5 μm su un microtomo, montate su vetrini, ed eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (H &E)17 (vedere Tabella dei materiali).
- Determinare i punteggi istopatologici combinando i punteggi per ciascuno dei sei parametri per un massimo di 12. Infiammazione della lamina propria (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); perdita di cellule caliciformi (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); cripta anormale (normale, 0; iperplastica, 1; disorganizzazione, 2; perdita di cripta, 3); ascessi della cripta (assente, 0; presente, 1); erosione della mucosa e ulcerazione (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); e cambiamento sottomucoso (nessuno, 0; sottomucosa, 1; transmurale, 2)18.
8. Isolamento e colorazione delle cellule della lamina propria intestinale
- Dopo il passaggio 7.3, tagliare altri 2/3 del colon in pezzi di 0,5-1 cm e lavarlo con PBS pre-freddo.
- Trasferire i segmenti del colon in un tampone EDTA-PBS preriscaldato da 20 mL in un tubo centrifugo da 50 mL. Incubare a 37 °C con 250 giri/min scuotendo per 30 min.
- Ruotare il tubo, scartare i supernatanti facendolo passare attraverso un setaccio sterile (diametro: 0,01 pollici) e risospescere i segmenti del colon in 20 ml di PBS pre-freddo nel tubo da 50 ml.
- Ripetere due volte il passaggio 8.3.
- Posizionare i segmenti del colon in un tubo C (vedere Tabella dei materiali) contenente 10 ml di tampone di digestione preriscaldato.
- Posizionare il tubo su una macchina dissociatore (vedi Tabella dei materiali) e incubare secondo il programma di "37C_m_LPDK_1" per 25 min.
NOTA: "37C_m_LPDK_1" è un programma preimpostato standard nella macchina Dissociatore utilizzata per agitare i campioni e mantenerli a 37 °C. - Controllare se il tessuto viene digerito completamente, il che significa che nessun pezzo di tessuto è nel tampone di digestione. In caso contrario, ripetere il programma di "37C_m_LPDK_1".
- Raccogliere il surnatante passando attraverso un setaccio metallico e un filtro da 100 μL. Risciacquare con 10 ml di PBS pre-freddo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti.
- Risospenare le cellule in 4 mL di soluzione di Percoll al 40% e mescolarle accuratamente (preparate al punto 2.8).
- Trasferire le celle risospese in 2 mL di soluzione di Percoll al 75% in un tubo centrifugo da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 850 x g per 20 min a 20 °C (Rampa di accelerazione: 0; Rampa freno: 0).
- Rimuovere con cura il grasso sullo strato superiore utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml e trasferire lo strato cellulare a 20 ml di tampone di lavaggio in un tubo da 50 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare tutti i supernatanti e le cellule risospese in 1 mL di Medium Completato.
- Contare le celle dopo il passaggio 3.6.
- Seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti, attivarle con 50 ng/mL di Phorbol-12-myristate 13-acetato e 750 ng/mL di ionomicina per 2 ore, seguite da incubazione con 5 μg/mL di Brefeldin A per 3 ore (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza. - Trasferire le celle in un tubo FACS, aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare le celle a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Incubare le cellule con 12,5 μg/mL di anti-topo CD16/3219 in (vedi Tabella dei Materiali) tampone FACS per bloccare i recettori Fc per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Macchia per marcatore vivo/morto e di superficie.
- Lavare le celle con 2 mL di tampone FACS e centrifugarle a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Macchiare le cellule con coloranti vivi e marcatori di superficie (cioè anticorpi CD3 anti-topo e cd4 anti-topo)20 (vedi Tabella dei materiali) in FACS Buffer alla concentrazione ottimizzata per 30 minuti a 4 °C al buio.
NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza.
- Eseguire la colorazione cellulare e nucleare.
- Aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Permeabilizzare e fissare le cellule risospendendo le celle con 200 μL di soluzione di lavoro Transcription Factor Fix (vedi Tabella dei materiali) per 40 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2 mL di tampone di Perm e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Incubare le cellule con marcatori cellulari e nucleari (cioè anti-topo IFNγ, anti-topo IL-17A e anticorpi anti-topo Foxp3)20 nel tampone di Perm (vedi Tabella dei materiali) per 30 min-1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2 mL di tampone di Perm e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Risospese le cellule con 200 μL di tampone FACS ed eseguire i campioni su un citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali).
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Representative Results
Circa 5 x 106 cellule TG CBir1 TCR naϊve CD4+ per milza sono state isolate da un topo adulto CBir1 TCR Tg. Il trasferimento di cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ ha indotto la colite cronica nei topi Rag1-/- riceventi. Dopo il trasferimento cellulare, i segni clinici sono stati monitorati per valutare la progressione dell'infiammazione intestinale, compresa la perdita di peso, la consistenza delle feci e la postura curva. Come previsto, i topi hanno iniziato a perdere peso circa tre settimane dopo il trasferimento cellulare e il peso ha raggiunto circa l'80% -85% del peso originale sei settimane dopo il trasferimento cellulare (Figura 3). Inoltre, i topi hanno mostrato diarrea circa 3-4 settimane dopo il trasferimento cellulare e hanno dimostrato una postura curva quando hanno sviluppato una colite grave. È stata mostrata la morfologia grossolana del colon e la gravità della colite è stata valutata dal punteggio istopatologico quando i topi sono stati sacrificati. I topi che hanno ricevuto CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T cells hanno mostrato una breve lunghezza del colon 6 settimane dopo il trasferimento cellulare (Figura 4A). I topi riceventi hanno dimostrato una maggiore infiltrazione cellulare nella lamina propria intestinale 4 settimane dopo il trasferimento cellulare (Figura 4C), perdita di cellule caliciformi e iperplasia delle cellule epiteliali intestinali 5 settimane dopo il trasferimento cellulare (Figura 4D), erosione della mucosa e infiltrazione di cellule infiammatorie nella sottomucosa del colon 6 settimane dopo il trasferimento cellulare (Figura 4F). Allo stesso tempo, non c'è stata infiammazione nei topi Rag1-/- che ricevevano pbS da solo (Figura 4B). Inoltre, non c'è infiammazione nell'intestino tenue, ma il cieco ha un'infiammazione. Inoltre, i fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon sono stati determinati mediante citometria a flusso. Viene mostrata la strategia di gating (Figura 5A-E). Le cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ si sono sviluppate in cellule IFNγ+ Th1, cellule IL-17A+ Th17, cellule T IFNγ+ IL-17+ CD4+ (Figura 5F) e cellule Foxp3+ Treg nella lamina propria intestinale dei destinatari Rag1-/- (Figura 5G).
Figura 1: La procedura di colite di induzione e la valutazione della gravità della malattia. Le cellule T SPLENIC CD4+ sono state isolate da topi transgenici CBir1 TCR usando perline magnetiche, e quindi le cellule T naϊve sono state purificate mediante selezione. Le cellule T naϊve transgeniche CBir1 TCR sono state poi trasferite per via endovenosa nei topi Rag1-/- riceventi. Quando i topi sono stati sacrificati circa sei settimane dopo il trasferimento cellulare, la gravità della colite è stata valutata in base ai punteggi istopatologici. I fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon sono stati determinati mediante citometria a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La strategia di gating per l'ordinamento delle cellule T naϊve transgeniche CBir1 TCR. Le singole cellule T naϊve transgeniche CBir1 T sono state purificate escludendo detriti (A), cellule non singole (B-C), cellule morte (D) e cellule attivate (E-F). La sottopopolazione è stata mostrata in (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le variazioni di peso dei topi Rag1-/- dopo il trasferimento delle cellule T. 1 x 106 cellule T naϊve transgeniche CBir1 TCR sono state trasferite nei topi Rag1-/- e i topi Rag1-/- che ricevevano PBS sono stati usati come controlli. I pesi dei topi sono stati registrati ogni settimana. I dati sono stati presentati in ± SD media; T-test dello studente; p<0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La morfologia grossolana e la colorazione di ematossilina ed eosina del colon da topi Rag1-/- che ricevevano cellule T naϊve transgeniche CBir1 TCR. (A) I topi riceventi sono stati sacrificati sei settimane dopo il trasferimento cellulare ed è stata mostrata la morfologia grossolana del colon. (B-E) I topi riceventi sono stati sacrificati in diversi punti temporali e i topi Rag1-/- hanno ricevuto PBS come controlli. I coloni sono stati elaborati per la colorazione di ematossilina ed eosina. Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione ematossilina ed eosina del colon. Barra di scala = 200 μm. (F) Sono stati determinati i punteggi istopatologici. I dati sono stati presentati in ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon di topi Rag-/- che ricevono cellule T naϊve transgeniche CBir1 TCR. Quando i topi riceventi sono stati sacrificati 6 settimane dopo il trasferimento cellulare, le cellule della lamina propria del colon sono state isolate per la colorazione dei fenotipi delle cellule T CD4 + . (A-E) La strategia di gating per l'analisi dei fenotipi delle cellule T. (F-G) (F) Le cellule T IL-17A+ CD4+ , le cellule T IFNγ+ CD4+ , le cellule T IL-17+ IFNγ+ CD4+ e (G) Foxp3+ Tregs sono state determinate mediante citometria a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene ogni passaggio sia essenziale per la riproducibilità di questo modello di colite, ci sono diversi passaggi critici. I topi Rag-/- riceventi devono ricevere adeguate cellule T naϊve CD4+ vitali per indurre l'infiammazione intestinale. Abbiamo usato la milza per l'isolamento di cellule T CD4+ ingenue invece di MLN. Perché la resa delle cellule T CD4+ ingenue nelle MLN è molto più bassa che nella milza. CD62L è altamente espresso nelle cellule T naïve e CD44 e CD25 sono i marcatori di attivazione delle cellule T13,14. In questo studio, abbiamo usato per la prima volta perline magnetiche anti-CD4 per isolare le cellule T CD4 + dalla milza. Quindi abbiamo usato la combinazione di anticorpi anti-CD4, anti-CD62L e anti-CD25 per l'isolamento delle cellule T CD4+ naïve13,14. I ricercatori potrebbero utilizzare altri marcatori per ordinare le cellule T CD4 + ingenue. CD45RBhi è anche marcatore di cellule T naïve. Le cellule T CD45RBhi CD25- CD4+ sono comunemente usate come cellule T naïve di cellule T transgeniche non TCR wild-type23. Pertanto, le tecniche di selezione delle cellule e l'iniezione endovenosa delle cellule T nei topi riceventi sono essenziali. L'impostazione del protocollo gating come modello è utile per accelerare gli esperimenti con meno errori. Per evitare la morte cellulare, le cellule dovrebbero sempre essere tenute sul ghiaccio. Inoltre, la colorazione delle cellule con DAPI è altamente raccomandata per escludere le cellule morte perché DAPI non può transitare attraverso le membrane cellulari intatte, rendendola un'eccellente sonda a cellule morte24. Riscaldare i topi per stimolare la dilatazione delle vene della coda fornisce una migliore visibilità venosa per l'iniezione endovenosa. Tutte le procedure sono raccomandate per essere eseguite da ricercatori qualificati.
Molti fattori potrebbero influenzare l'esito dei modelli di colite, che deve essere prestata attenzione. In primo luogo, i topi Rag1-/- riceventi dovrebbero essere abbinati all'età e al sesso. Nel modello di trasferimento delle cellule T CD45RBhi, le cellule T di donatori maschi e femmine possono essere trasferite a riceventi maschi di Rag-/- , mentre solo le donatrici di sesso femminile possono essere utilizzate quando si utilizzano riceventi di sesso femminile23. Tuttavia, non vediamo una differenza significativa tra i destinatari maschi e femmine. I topi riceventi potrebbero essere femmine o maschi e le cellule T di donatori maschi possono anche indurre la colite nelle riceventi di sesso femminile. Poiché il cambiamento di peso è un prezioso indicatore della progressione della colite, si raccomanda di utilizzare i topi riceventi tra 8-12 settimane per presentare una linea di peso stabile. Questi topi riceventi devono essere allevati e tenuti nella stessa stanza della struttura animale perché il microbiota è fondamentale per regolare lo sviluppo della colite25. Il tempo per sviluppare la colite varia quando si trasferiscono diversi numeri di cellule T4 CD4 naïve CBir1 TCR Tg. Come previsto, meno cellule richiedono un tempo più lungo per l'induzione della colite e un numero maggiore di cellule richiede un tempo più breve per l'induzione della colite. Si raccomanda l'uso di 1 x 106 cellule per topo ricevente poiché i topi riceventi dimostrano segni clinici di colite ~ 2-3 settimane dopo il trasferimento cellulare e sviluppano colite relativamente grave ~ 6 settimane dopo il trasferimento cellulare. Inoltre, rispetto all'iniezione intraperitoneale, l'iniezione endovenosa di cellule nella vena della coda induce una colite più consistente. Per l'isolamento delle cellule della lamina propria del colon, i tessuti del colon non devono asciugarsi; altrimenti, ridurrebbe la resa e la vitalità delle cellule. Una delle preoccupazioni particolari è che la durata della colite cambierebbe se i topi riceventi fossero trasferiti con cellule TG TG CBir1 TCR geneticamente modificate o trattati con farmaci26. Inoltre, le cellule T TG TCR CBir1 inducono anche l'infiammazione intestinale in altri topi immunodeficienti, come i topi TCRβ / δ - / - che mancano di cellule T27.
Poiché l'accumulo di prove indica un ruolo cruciale delle cellule T reattive antigene-specifiche dell'intestino nella patogenesi dell'IBD, l'uso di cellule T specifiche per un antigene batterico intestinale definito fornirà informazioni su come l'antigene batterico intestinale induce le risposte delle cellule T per indurre la colite. La flagellina dell'antigene del microbiota intestinale CBir1 è abbondante nel tratto gastrointestinale, che è correlato alla patogenesi di IBD8,9. Questo modello di colite assomiglia a diverse caratteristiche critiche dell'IBD, tra cui diarrea, perdita di peso, reperti istopatologici e risposte immunitarie intestinali anormali. Pertanto, questo modello di colite è utile per studiare i meccanismi dell'IBD umano e fornisce uno strumento per valutare i trattamenti per l'IBD. È interessante notare che il recente lavoro di Chiaranunt et al. ha indicato che la specificità delle cellule T all'antigene CBir 1 del microbiota da solo potrebbe non essere sufficiente per indurre l'attivazione delle cellule T e la colite. Ciò è evidenziato dalle cellule TG TG CBir1 wild-type indotte dalla colite nei destinatari di Rag-/-, mentre le cellule T Rag-/- CBir1 non hanno indotto colite nella loro struttura animale, suggerendo che le cellule T intestinali che rispondono a specifici antigeni batterici intestinali possono richiedere altri batteri commensali correlati, ad esempio Helicobacter spp, per funzionare come adiuvante28 . Un aspetto interessante di questo modello è che diversi sottoinsiemi di cellule T, vale a dire le cellule Th1, Th17 e Treg, sono presenti nella lamina propria dei topi riceventi colitici, il che offre un'opportunità unica per indagare i ruoli non solo delle cellule T effettrici ma anche dei Treg nella patogenesi della colite29.
Tuttavia, poiché questo modello di colite è mediato da cellule T specifiche del microbiota intestinale, una limitazione per questo modello di colite è che la durata dell'induzione della colite può variare in diverse strutture animali a seconda del microbiota intestinale.
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Disclosures
Nessun autore ha interessi finanziari, professionali o personali contrastanti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, dal premio STARs dell'Università del Texas System (Y.C.) e dal James W. McLaughlin Fellowship Fund della University of Texas Medical Branch di Galveston (W.Y.). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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