Summary
In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.
Abstract
Mit der Zunahme der Inzidenz stellen entzündliche Darmerkrankungen (IBD), bei denen es sich um chronische Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts handelt, eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Daher ist es wichtig, die Mechanismen zu untersuchen, die der Pathogenese und Entwicklung von IBD zugrunde liegen. Hier wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Transfer-Kolitis-Modell beschrieben. CBir1 Flagellin wurde als immundominantes bakterielles Darmantigen bei experimenteller Kolitis und Patienten mit Morbus Crohn anerkannt. CBir1 TCR transgene naϊve CD4+ T-Zellen, spezifisch für CBir1-Flagellin, können nach adoptivem Transfer in immundefizierende Rag1-/- Mäuse eine chronische Kolitis induzieren. Der Schweregrad der Erkrankung wird durch Histopathologie beurteilt. Die CD4+ T-Zell-Phänotypen in der Kolonlamina propria werden ebenfalls bestimmt. Dieses Modell ähnelt stark der Entwicklung von IBD, die ein ideales mausines Modell für die Untersuchung der Mechanismen bietet, die die Pathogenese von IBD antreiben, und das Testen der potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD.
Introduction
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), vor allem Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), sind durch chronische, schubförmig remittierende Entzündungen des Magen-Darm-Traktes gekennzeichnet, von denen weltweit Millionen betroffen sind1. Mehrere Faktoren wurden an der Entwicklung und Pathogenese von IBD beteiligt, darunter genetische Anfälligkeit, Darmmikrobiota, Immunantworten, Ernährung und Lebensstil2. Der genaue Mechanismus von IBD ist jedoch noch nicht vollständig verstanden.
Eines der besonderen Interessen ist die Wechselwirkung zwischen Darmmikrobiota und Wirtsimmunantworten bei der Regulierung von Darmentzündungen3. Die Darmmikrobiota liefert eine Reihe von immunstimulierenden Molekülen und Antigenen, die Immunantworten aktivieren können4. Während das Gleichgewicht zwischen Effektor-T-Zellen und regulatorischen T-Zellen (Tregs) für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase entscheidend ist, trägt die übermäßige CD4+ T-Zell-Reaktion der Darmschleimhaut auf Darmmikrobiota-Antigene zur Darmentzündung bei5,6,7. Als immundominantes Darmmikrobiota-Antigen wurde CBir1-Flagellin mit der Pathogenese des menschlichen CD8,9 in Verbindung gebracht. Darüber hinaus induziert der Transfer von transgenen (Tg) CBir1 TCR-T-Zellen bei immundefizienten Mäusen6 eine Darmentzündung, die der menschlichen IBD sehr ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass dieses T-Zell-Transfermodell dazu beiträgt, die Mechanismen der menschlichen IBD zu untersuchen.
Diese Arbeit beschreibt das detaillierte Protokoll der Induktion von Kolitis in Rag1-/- Mäusen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen und die Beurteilung der Schwere der Erkrankung. Außerdem werden die erwarteten Ergebnisse gezeigt und die kritischen Schritte des Verfahrens und der Fehlerbehebung diskutiert, die den Forschern helfen werden, die Mechanismen der Pathogenese von Darmentzündungen zu untersuchen und die potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD zu testen.
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Protocol
Alle Tierprozeduren wurden gemäß dem Ausschuss für die Verwendung und Pflege der Tiere der University of Texas Medical Branch durchgeführt. CBir1 TCR Tg Mäuse wurden von Dr. Charles Elson von der University of Alabama in Birmingham zur Verfügung gestellt. CBir1 TCR Tg Mäuse können weiblich oder männlich sein, sollten aber nach 8-12 Wochen sein. Rag1-/- Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund wurden aus dem Jackson Laboratory10 gewonnen. Rag1-/- Mäuse müssen geschlechts- und altersangepasst sein, und entweder männlich oder weiblich kann verwendet werden, sollte aber nach 8-12 Wochen sein. Das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
1. Vorbereitung der Empfängermäuse
- Bereiten Sie Rag1-/- Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund vor, die in derselben spezifischen pathogenfreien Tieranlage gezüchtet werden. Berechnen Sie die Anzahl der Mäuse pro Gruppe durch Leistungsanalyse11.
HINWEIS: Rag1-/- Mäuse haben keine reifen T-Zellen und B-Zellen10. - Markieren Sie die Mäuse durch Ohrschlag.
- Wiegen Sie die Mäuse am selben Tag des T-Zell-Transfers.
2. Herstellung der Reagenzien und Lösungen
HINWEIS: Die verwendeten Reagenzien sind giftig oder biogefährlich und ihre Handhabung erfordert Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsmaßnahmen.
- Waschpuffer vorbereiten: 5 ml 100x Penicillin-Streptomycin in 500 ml RPMI 1640 Medium geben. Mischen Sie es gründlich und lagern Sie es bei 4 °C.
- Tris-NH4Cl-Lysepuffer vorbereiten.
- Lösungsteil A herstellen 2,06 g Tris-Base in 100 mL doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) lösen und den pH-Wert mit HCl auf 7,2 einstellen.
- Lösung vorbereiten Teil B. 7,47 g NH4Cl in 800 ml ddH2O auflösen.
- Mischen Sie A und B gründlich. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf 7,2 ein, wenn nicht.
- Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 1000 ml ein. Autoklavieren und dann bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie den Isolationspuffer vor.
- 2,5 g BSA und 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) in 500 ml 1x PBS geben. Mischen Sie es gründlich.
- Filtern Sie die Lösung durch einen vakuumbetriebenen Einweg-Flaschendeckelfilter mit einer Größe von 0,22 μm (siehe Materialtabelle). Lagern Sie es bei 4 °C.
- Bereiten Sie DEN FACS-Puffer vor. 1 ml FBS und 50 μL EDTA (0,5 m, pH 8,0) in 50 ml Waschpuffer (hergestellt in Schritt 2.1) gegeben. Gründlich mischen und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie Complete Medium vor. Fügen Sie 5 ml FBS in 45 ml Waschpuffer hinzu. Gründlich mischen und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie den EDTA-PBS-Puffer vor.
- Berechnen Sie das Volumen des benötigten EDTA-PBS-Puffers. Volumen (ml) = Mausnummer x 20.
- Fügen Sie das entsprechende Volumen von FBS, EDTA und HEPES in der PBS hinzu (2% von FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES in PBS) (siehe Tabelle der Materialien).
- In einem 37 °C warmen Wasserbad gründlich vermischen und vorwärmen.
- Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor.
- Berechnen Sie das Volumen des benötigten Aufschlusspuffers. Volumen (ml) = Mausnummer x 10.
- Fügen Sie das entsprechende Volumen von FBS, Kollagenase IV und DNase I in Waschpuffer hinzu (2% von FBS, 0,5 mg / ml Kollagenase IV und 10 U / ml DNase I in Waschpuffer) (siehe Materialtabelle).
- In einem 37 °C warmen Wasserbad gründlich vermischen und vorwärmen.
- Bereiten Sie die Percoll-Lösung vor.
- Bereiten Sie 100% Percoll vor. Fügen Sie 5 ml 10x PBS in 45 ml Original Percoll hinzu (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie 2% FBS in Washing Buffer vor. Fügen Sie 1 ml FBS in 49 ml Waschpuffer hinzu.
- Verschließen Sie das Volumen von 40 % Percoll Solution und 75 % Percoll Solution. Volumen von 40% Percoll Solution (ml) = Mausnummer x 4; Volumen von 75% Percoll Solution (ml) = Mausnummer x 2.
ANMERKUNG: Die in den Schritten 2.1-2.5 hergestellten Reagenzien/Lösungen werden in den Schritten 3-4 und die in den Schritten 2.6-2.8 hergestellten Reagenzien/Lösungen in Schritt 9 verwendet. Alle in Schritt 9 verwendeten Reagenzien/Lösungen sollten frisch zubereitet werden. Für alle Schritte wird empfohlen, 5 % zusätzlichen Puffer herzustellen.
3. Isolierung von Milz-CBir1 TCR Tg CD4+ T-Zellen
- CBir1 TCR Tg Maus/Mäuse durch eine zervikale Luxation mit CO2-Euthanasie (30%-70% Gas-Luft-Verdrängungsrate) einschläfern. Befeuchten Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.
- Führen Sie einen ~ 1 cm langen Schnitt des linken Abdomens durch, ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg, machen Sie einen ~ 3 cm langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe und entfernen Sie die Milz mit steriler Schere und Pinzette. Die Milz wird in eine Kulturschale mit 5 ml vorgekühltem Waschpuffer (vorbereitet in Schritt 2.1) gegeben.
- Schleifen Sie die Milz mit der rauen Oberfläche von zwei sterilen Glasobjektträgern. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, indem Sie es durch ein 100-μm-Zellsieb führen (siehe Materialtabelle). Glasobjektträger und Kulturschale mit 5 mL Vorkühlpuffer abspülen und den Waschpuffer in das Röhrchen geben.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 5 ml vorgewärmtem Tris-NH4Cl-Lysepuffer (hergestellt in Schritt 2.2) pro Milz. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 10 ml vorgekühlten Waschpuffer in die Tube.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 10 ml vorkaltem Isolationspuffer (hergestellt in Schritt 2.3).
- Zählen Sie die Zellen. Mischen Sie 10 μL Zellsuspension mit 10 μL Trypanblau gründlich. Laden Sie 10 μL der Mischung auf einen Objektträger, führen Sie den Objektträger in den automatisierten Zellzähler ein (siehe Materialtabelle) und erhalten Sie die lebensfähige Zellnummer12.
HINWEIS: Ungefähr 1 x 108 Zellen können in diesem Schritt von einer Spendermaus gewonnen werden. - Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension aus Schritt 3.6 bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Verwerfen Sie alle Überstände.
- Wirbeln Sie die Anti-Maus-CD4-Magnetpartikel gründlich (siehe Materialtabelle), fügen Sie direkt 50 μL der Partikel pro 107 Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit Zellpellets. 30 min bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Jedes andere kommerzielle CD4+ T-Zellanreicherungskit kann hier verwendet werden. - Die Zellpartikelsuspension in ein steriles Sammelröhrchen überführen. Geben Sie 3,5 ml vorgekühlten Isolationspuffer in das Rohr.
- Legen Sie das Rohr für 8 min bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten (siehe Materialtabelle). Den Überstand vorsichtig mit einer 3 ml Transferpipette absaugen.
- Entfernen Sie das Rohr vom Zelltrennmagneten (siehe Materialtabelle), befestigen Sie die Zellen erneut mit 3,5 ml vorkaltem Isolationspuffer und legen Sie das Rohr für 4 minuten bei Raumtemperatur auf den Magneten. Den Überstand vorsichtig mit einer 3 ml Transferpipette absaugen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.11.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml vorkaltem FACS-Puffer (hergestellt in Schritt 2.4).
4. Reinigung von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T Zellen
- Zählen Sie die Zellen nach Schritt 3.6.
- Wenn die Zellkonzentration > 107/ml beträgt, fügen Sie ein Volumen DES FACS-Puffers hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellkonzentration ≤ 107/ml beträgt.
HINWEIS: ~1 × 107 Zellen können in diesem Schritt von einer Spendermaus gewonnen werden. - Färben Sie die Oberflächenmarker mit 10 μL Anti-Maus-CD4-APC, 10 μL Anti-Maus-CD25-Percp/Cy5.5 und 10 μL Anti-Maus-CD62L-PE13,14 (siehe Materialtabelle). Vorsichtig mischen und im Dunkeln 30 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit 2 ml vorkaltem FACS-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie alle Überstände mit einer 3 ml Transferpipette.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4.
- Resuspendieren Sie die Zellen auf die Konzentration von 40 x 106/ ml im vorkalten FACS-Puffer.
HINWEIS: Um ein Verstopfen des Sortierers zu verhindern, führen Sie die Zellen durch ein 70-μm-Sieb. - Fügen Sie 0,1 μg/ml DAPI hinzu.
HINWEIS: DAPI wird zum Ausschließen der toten Zellen verwendet. - Bereiten Sie 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 4 mL Complete Medium (hergestellt in Schritt 2.5) zum Sammeln der sortierten Zellen vor.
- Laden Sie die Zellen auf den Sortierer. Sortieren Sie einzelne lebensfähige naϊve CD4+ T-Zellen (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ Zellen) im Reinheitsmodus (Düsengröße: 70 μm; Druck: 70 PSI; Veranstaltungsrate: 8000-12000 Ereignisse/s; Wirkungsgrad: höher als 90%) (Abbildung 2).
HINWEIS: Naϊve CD4+ T-Zellen exprimieren eine hohe Expression von CD62L und es fehlt der Aktivierungsmarker CD2513,14. - Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie alle Überstände mit einer 3 ml Transferpipette.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL 1x PBS.
- Zählen von Zellen nach Schritt 3.6
HINWEIS: ~5 × 106 Zellen können in diesem Schritt von einer Spendermaus gewonnen werden.
5. Zelltransfer in die Empfängermäuse
- Resuspend die CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T Zellen auf die 5 x 106/ml Konzentration durch Zugabe von 1x PBS.
- Erwärmen Sie die Rag-/- Mäuse unter einer Wärmelampe (siehe Materialtabelle) für 4 min und halten Sie die Mäuse mit einem Mausrückhaltesystem zurück.
- Intravenöse Übertragung von 200 μL der Zellsuspension in die Schwanzvene von Rag-/- Mäusen unter Verwendung einer 1 ml Insulinspritze (27 G) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Zellen einer Spendermaus reichen aus, um auf etwa fünf Empfängermäuse übertragen zu werden.
6. Überwachung der klinischen Symptome während der Progression der Kolitis
- Wiegen Sie die Mäuse jede Woche und erhöhen Sie die Beobachtung auf zweimal pro Woche, sobald die Mäuse beginnen, >5% des ursprünglichen Gewichts zu verlieren.
- Beobachten Sie die Reaktion/ Bewegung von Mäusen, wenn sie sanft stimuliert werden.
- Beobachten Sie andere klinische Anomalien. d.h. Haltung und Stuhlkonsistenz.
7. Kolonsammlung und histopathologisches Scoring
- Opfern Sie die Empfängermäuse durch eine zervikale Luxation mit CO2 zu einem Zeitpunkt der Gewichtsabnahme >20% des ursprünglichen Gewichts oder 6 Wochen nach dem Zelltransfer. Befeuchten Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.
- Führen Sie einen ~ 1 cm ventralen Mittellinien-Hautschnitt durch, ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg, machen Sie einen ~ 3 cm langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe, identifizieren Sie den Blinddarm und entfernen Sie den gesamten Dickdarm mit steriler Schere und Pinzette. Befeuchten Sie den Dickdarm mit vorkaltem PBS in einer Kulturschale.
- Schneiden Sie den Dickdarm der Länge nach ein und spülen Sie ihn mit vorkaltem PBS aus. Schneiden Sie 1/3 des Dickdarms längs ab.
- Legen Sie den Doppelpunktstreifen in ein Papiertuch mit der leuchtenden Seite nach oben. Führen Sie Schweizer Rollen mit einem Zahnstocher durch15.
- Legen Sie den Doppelpunkt Swiss in eine Kassette und legen Sie die Kassette für 24 h16 in 10% gepuffertes Formalin, gefolgt von Dehydration mit einem automatisierten Prozessor (siehe Materialtabelle) und Paraffineinbettung.
- Schneiden Sie 5 μm Gewebeschnitte auf einem Mikrotom, montiert auf Objektträgern, und führen Sie die Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung17 durch (siehe Materialtabelle).
- Bestimmen Sie die histopathologischen Scores, indem Sie die Scores für jeden der sechs Parameter für maximal 12 kombinieren. Lamina propria Entzündung (normal, 0; mild, 1; mittelschwer, 2; schwer, 3); Kelchzellverlust (normal, 0; mild, 1; mittelschwer, 2; schwer, 3); abnorme Krypta (normal, 0; hyperplastisch, 1; Desorganisation, 2; Kryptenverlust, 3); Krypta-Abszesse (abwesend, 0; gegenwärtig, 1); Schleimhauterosion und Ulzeration (normal, 0; mild, 1; mittelschwer, 2; schwer, 3); und submuköse Veränderung (keine, 0; submukosa, 1; transmural, 2)18.
8. Isolierung und Färbung von intestinalen Lamina propria-Zellen
- Nach Schritt 7.3 weitere 2/3 des Dickdarms in 0,5-1 cm große Stücke schneiden und mit vorkaltem PBS waschen.
- Übertragen Sie die Dickdarmsegmente in einen 20 ml vorgewärmten EDTA-PBS-Puffer in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Inkubieren bei 37 °C mit 250 U/min Schütteln für 30 min.
- Wirbeln Sie die Röhre, verwerfen Sie die Überstände, indem Sie sie durch ein steriles Sieb (Durchmesser: 0,01 Zoll) führen, und resuspendieren Sie die Dickdarmsegmente in 20 ml vorkaltem PBS im 50 ml Rohr.
- Wiederholen Sie Schritt 8.3 zweimal.
- Legen Sie die Dickdarmsegmente in ein C-Röhrchen (siehe Materialtabelle), das 10 ml vorgewärmten Aufschlusspuffer enthält.
- Legen Sie das Rohr auf eine Dissoziatormaschine (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie unter dem Programm "37C_m_LPDK_1" für 25 min.
HINWEIS: "37C_m_LPDK_1" ist ein voreingestelltes Standardprogramm in der Dissoziatormaschine, das zum Rühren der Proben und zum Halten bei 37 °C verwendet wird. - Überprüfen Sie, ob das Gewebe vollständig verdaut ist, was bedeutet, dass sich kein Stück Gewebe im Verdauungspuffer befindet. Wenn nicht, wiederholen Sie das Programm "37C_m_LPDK_1".
- Sammeln Sie den Überstand, indem Sie durch ein Metallsieb und ein 100-μL-Sieb gehen. Spülen Sie mit 10 ml vorkaltem PBS.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie alle Überstände.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml 40% iger Percoll-Lösung und mischen Sie sie gründlich (vorbereitet in Schritt 2.8).
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf 2 ml 75% ige Percoll-Lösung in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 850 x g für 20 min bei 20 °C (Beschleunigungsrampe: 0; Bremsrampe: 0).
- Entfernen Sie vorsichtig Fett auf der obersten Schicht mit einer 3 ml Transferpipette und übertragen Sie die Zellschicht auf 20 ml Waschpuffer in einem 50 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Verwerfen Sie alle Überstände und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml abgeschlossenem Medium.
- Zählen Sie die Zellen nach Schritt 3.6.
- Säen Sie die Zellen in eine 24-Well-Platte, aktivieren Sie sie mit 50 ng / ml Phorbol-12-Myristat 13-Acetat und 750 ng / ml Ionomycin für 2 h, gefolgt von einer Inkubation mit 5 μg / ml Brefeldin A für 3 h (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die verwendeten Reagenzien sind giftig und ihre Handhabung erfordert Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsmaßnahmen. - Übertragen Sie die Zellen in ein FACS-Röhrchen, fügen Sie 2 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 8 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 12,5 μg/ml Anti-Maus-CD16/3219 in (siehe Materialtabelle) FACS-Puffer, um Fc-Rezeptoren für 5 min bei Raumtemperatur zu blockieren.
- Fleck für Lebend-/Tot- und Oberflächenmarker.
- Waschen Sie die Zellen mit 2 mL FACS Buffer und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 8 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
- Färben Sie die Zellen mit Lebendfarbstoff und Oberflächenmarkern (d. h. Anti-Maus-CD3- und Anti-Maus-CD4-Antikörper)20 (siehe Materialtabelle) in FACS Buffer in der optimierten Konzentration für 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
HINWEIS: Die verwendeten Reagenzien sind giftig und ihre Handhabung erfordert Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsmaßnahmen.
- Führen Sie die zelluläre und nukleare Färbung durch.
- 2 ml FACS-Puffer zugeben und die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Permeabilisieren und fixieren Sie die Zellen, indem Sie die Zellen mit 200 μL Transkriptionsfaktor-Fix-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) für 40 minuten bei Raumtemperatur wiederverwenden.
- 2 ml Perm-Puffer zugeben und die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Inkubieren Sie die Zellen mit zellulären und nuklearen Markern (d. h. Anti-Maus-IFNγ-, Anti-Maus-IL-17A- und Anti-Maus-Foxp3-Antikörper)20 im Perm-Puffer (siehe Materialtabelle) für 30 min-1 h bei Raumtemperatur.
- 2 ml Perm-Puffer zugeben und die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- 1 ml FACS-Puffer zugeben und die Zellsuspension bei 350 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie Zellen mit 200 μL FACS-Puffer und lassen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer laufen (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Etwa 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen pro Milz wurden aus einer adulten CBir1 TCR Tg Maus isoliert. Der Transfer von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen induzierte chronische Kolitis in Empfänger-Rag1-/- Mäusen. Nach dem Zelltransfer wurden klinische Symptome überwacht, um das Fortschreiten der Darmentzündung zu bewerten, einschließlich Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und gebeugter Haltung. Wie erwartet, begannen Mäuse etwa drei Wochen nach dem Zelltransfer an Gewicht zu verlieren, und das Gewicht erreichte sechs Wochen nach dem Zelltransfer etwa 80% -85% des ursprünglichen Gewichts (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigten Mäuse etwa 3-4 Wochen nach dem Zelltransfer Durchfall und zeigten eine gebeugte Haltung, wenn sie eine schwere Kolitis entwickelten. Die grobe Morphologie des Dickdarms wurde gezeigt, und der Schweregrad der Kolitis wurde anhand des histopathologischen Scores beurteilt, wenn Mäuse geopfert wurden. Mäuse, die CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen erhielten, zeigten 6 Wochen nach dem Zelltransfer eine kurze Dickdarmlänge (Abbildung 4A). Die Empfängermäuse zeigten mehr Zellinfiltration in der Darmlamina propria 4 Wochen nach dem Zelltransfer (Abbildung 4C), Kelchzellverlust und Intestinalepithelzellhyperplasie 5 Wochen nach dem Zelltransfer (Abbildung 4D) und Schleimhauterosion und Entzündungszellinfiltration in der Submukosa des Dickdarms 6 Wochen nach dem Zelltransfer (Abbildung 4F). Gleichzeitig gab es keine Entzündung bei Rag1-/- Mäusen, die nur PBS erhielten (Abbildung 4B). Außerdem gibt es keine Entzündung im Dünndarm, aber der Blinddarm hat eine Entzündung. Zusätzlich wurden CD4+ T-Zell-Phänotypen in Colon-Lamina propria mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Gating-Strategie ist dargestellt (Abbildung 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen entwickelten sich zu IFNγ+ Th1-Zellen, IL-17A+ Th17-Zellen, IFNγ+ IL-17+ CD4+ T-Zellen (Abbildung 5F) und Foxp3+ Treg-Zellen in intestinalen Lamina propria von Rag1-/- Empfängern (Abbildung 5G).
Abbildung 1: Das Verfahren der Induktionskoalliitis und beurteilung der Schwere der Erkrankung. Milz-CD4+ -T-Zellen wurden aus transgenen CBir1-TCR-Mäusen unter Verwendung magnetischer Kügelchen isoliert, und dann wurden naϊve T-Zellen durch Sortierung gereinigt. CBir1 TCR transgene naϊve T-Zellen wurden dann intravenös in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen. Wenn die Mäuse etwa sechs Wochen nach dem Zelltransfer geopfert wurden, wurde der Schweregrad der Kolitis anhand histopathologischer Scores beurteilt. Die CD4+ T-Zell-Phänotypen in Colon-Lamina propria wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Gating-Strategie zur Sortierung von CBir1 TCR transgenen naϊve T-Zellen. Lebensfähige einzelne CBir1 TCR transgene naϊve T-Zellen wurden gereinigt, indem Trümmer (A), Nicht-Einzelzellen (B-C), tote Zellen (D) und aktivierte Zellen (E-F) ausgeschlossen wurden. Die Subpopulation wurde in (G) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Gewichtsveränderungen von Rag1-/- Mäusen nach dem T-Zelltransfer. 1 x 106 CBir1 TCR transgene naϊve T-Zellen wurden in Rag1-/- Mäuse übertragen, und Rag1-/- Mäuse, die PBS erhielten, wurden als Kontrollen verwendet. Die Gewichte der Mäuse wurden jede Woche aufgezeichnet. Die Daten wurden im Mittleren ± SD dargestellt; T-Test des Schülers; S<0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die grobe Morphologie und Hämatoxylin- und Eosinfärbung des Dickdarms von Rag1-/- Mäusen, die CBir1 TCR transgene naϊve T-Zellen erhielten. (A) Die Empfängermäuse wurden sechs Wochen nach dem Zelltransfer geopfert, und die grobe Morphologie des Dickdarms wurde gezeigt. (B-E) Die Empfängermäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten geopfert, und Rag1-/- Mäuse erhielten PBS als Kontrollen. Die Doppelpunkte wurden für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung verarbeitet. Repräsentative Bilder von Hämatoxylin- und Eosinfärbung des Dickdarms werden gezeigt. Maßstabsbalken = 200 μm. (F) Histopathologische Werte wurden bestimmt. Die Daten wurden in mittlerer ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die CD4+ T-Zell-Phänotypen in der Kolonlamina propria von Rag-/- Mäusen, die CBir1 TCR transgene naϊve T-Zellen erhalten. Als die Empfängermäuse 6 Wochen nach dem Zelltransfer geopfert wurden, wurden Kolonlamina propria-Zellen für die Färbung von CD4 + T-Zell-Phänotypen isoliert. (A-E) Die Gating-Strategie zur Analyse von T-Zell-Phänotypen. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T-Zellen, IFNγ+ CD4+ T-Zellen, IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-Zellen und (G) Foxp3+ Tregs wurden durch Durchflusszytometrie bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Obwohl jeder Schritt für die Reproduzierbarkeit dieses Colitis-Modells unerlässlich ist, gibt es mehrere kritische Schritte. Die Empfänger-Rag-/- Mäuse sollten ausreichend lebensfähige naϊve CD4+ T-Zellen erhalten, um eine Darmentzündung auszulösen. Wir verwendeten Milz für die Isolierung von naiven CD4+ T-Zellen anstelle von MLNs. Weil die Ausbeute an naiven CD4+ T-Zellen in MLNs viel geringer ist als in Milzen. CD62L wird in naiven T-Zellen hoch exprimiert, und CD44 und CD25 sind die Aktivierungsmarker von T-Zellen13,14. In dieser Studie verwendeten wir zuerst Anti-CD4-Magnetperlen, um CD4 + T-Zellen aus Milzen zu isolieren. Dann verwendeten wir die Kombination von Anti-CD4-, Anti-CD62L- und Anti-CD25-Antikörpern zur Isolierung naiver CD4+ T-Zellen13,14. Die Forscher könnten andere Marker verwenden, um die naiven CD4+ T-Zellen zu sortieren. CD45RBhi ist auch Marker für naive T-Zellen. CD45RBhi CD25- CD4+ T-Zellen werden häufig als naive T-Zellen von Wildtyp-Nicht-TCR-transgenen T-Zellen23 verwendet. Daher sind die Techniken der Sortierung von Zellen und der intravenösen Injektion der T-Zellen in die Empfängermäuse unerlässlich. Das Einrichten des Gating-Protokolls als Vorlage ist hilfreich, um die Experimente mit weniger Fehlern zu beschleunigen. Um den Zelltod zu vermeiden, sollten Zellen immer auf Eis gehalten werden. Außerdem wird das Färben von Zellen mit DAPI dringend empfohlen, um tote Zellen auszuschließen, da DAPI nicht über intakte Zellmembranen transitieren kann, was es zu einer ausgezeichneten toten Zellsonde macht24. Das Erwärmen der Mäuse zur Stimulierung der Dilatation der Schwanzvenen sorgt für eine bessere Sichtbarkeit der Vene für die intravenöse Injektion. Es wird empfohlen, alle Verfahren von ausgebildeten Forschern durchzuführen.
Viele Faktoren können das Ergebnis der Colitis-Modelle beeinflussen, was beachtet werden muss. Zunächst sollten die Empfänger-Rag1-/- Mäuse alters- und geschlechtsangepasst sein. Im CD45RBhi-T-Zelltransfermodell können T-Zellen von männlichen und weiblichen Spendern auf männliche Lumpen-/- Empfänger übertragen werden, während bei der Verwendung weiblicher Empfänger nur weibliche Spender verwendet werden können23. Wir sehen jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Empfängern. Die Empfängermäuse könnten entweder Weibchen oder Männchen sein, und T-Zellen von männlichen Spendern können auch Colitis bei weiblichen Empfängern induzieren. Da die Gewichtsveränderung ein wertvoller Indikator für das Fortschreiten der Kolitis ist, wird empfohlen, die Empfängermäuse zwischen 8-12 Wochen zu verwenden, um eine stabile Gewichtslinie zu präsentieren. Diese Empfängermäuse sollten gezüchtet und im selben Raum der Tiereinrichtung gehalten werden, da die Mikrobiota für die Regulierung der Colitisentwicklung von entscheidender Bedeutung ist25. Die Zeit bis zur Entwicklung einer Kolitis variiert, wenn eine unterschiedliche Anzahl von CBir1 TCR Tg naiven CD4 T-Zellen übertragen wird. Wie erwartet, benötigen weniger Zellen eine längere Zeit für die Induktion von Colitis, und eine höhere Anzahl von Zellen benötigt eine kürzere Zeit für die Induktion von Colitis. Die Verwendung von 1 x 106 Zellen pro Empfängermaus wird empfohlen, da die Empfängermäuse klinische Anzeichen einer Kolitis ~ 2-3 Wochen nach dem Zelltransfer zeigen und eine relativ schwere Kolitis ~ 6 Wochen nach dem Zelltransfer entwickeln. Darüber hinaus induziert die intravenöse Injektion von Zellen in die Schwanzvene im Vergleich zur intraperitonealen Injektion eine konsistentere Kolitis. Zur Isolierung von Kolonlamina propria-Zellen darf das Dickdarmgewebe nicht austrocknen; Andernfalls würde es die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen verringern. Eine der besonderen Bedenken ist, dass sich die Dauer der Kolitis ändern würde, wenn die Empfängermäuse mit genetisch veränderten CBir1 TCR Tg T-Zellen übertragen oder mit Medikamenten behandelt werden26. Darüber hinaus induzieren CBir1 TCR Tg T-Zellen auch Darmentzündungen bei anderen immundefizienten Mäusen, wie TCRβ/δ-/- Mäusen, denen T-Zellen fehlen27.
Da die sich häufenden Beweise auf eine entscheidende Rolle von darmbakteriellen Antigen-spezifischen reaktiven T-Zellen bei der Pathogenese von IBD hinweisen, wird die Verwendung von T-Zellen, die für ein definiertes bakterielles Darmantigen spezifisch sind, Einblicke in die Art und Weise liefern, wie bakterielles Antigen im Darm T-Zell-Reaktionen induziert, um Kolitis zu induzieren. Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin ist im Magen-Darm-Trakt reichlich vorhanden, was mit der Pathogenese von IBD8,9 zusammenhängt. Dieses Colitis-Modell ähnelt mehreren kritischen Merkmalen von IBD, einschließlich Durchfall, Gewichtsverlust, histopathologischem Befund und abnormalen intestinalen Immunantworten. Daher ist dieses Colitis-Modell nützlich, um die Mechanismen der menschlichen IBD zu untersuchen und bietet ein Werkzeug zur Bewertung der Behandlungen für IBD. Interessanterweise zeigten die jüngsten Arbeiten von Chiaranunt et al., dass die Spezifität der T-Zellen für das Mikrobiota-CBir-1-Antigen allein möglicherweise nicht ausreicht, um eine T-Zell-Aktivierung und Kolitis zu induzieren. Dies wird durch die Wildtyp-CBir1 TCR Tg T-Zellen induzierte Kolitis bei Rag-/- Empfängern belegt, während Rag-/- CBir1 T-Zellen in ihrer tierischen Einrichtung keine Kolitis induzierten, was darauf hindeutet, dass Darm-T-Zellen, die auf spezifisches bakterielles Darmantigen reagieren, andere miteinander verbundene kommensale Bakterien, zum Beispiel Helicobacter spp, benötigen, um als Adjuvans zu fungieren28 . Ein spannender Aspekt dieses Modells ist, dass verschiedene T-Zell-Untergruppen, nämlich Th1-, Th17- und Treg-Zellen, in Lamina propria von colitischen Empfängermäusen vorhanden sind, was eine einzigartige Gelegenheit bietet, die Rolle nicht nur von Effektor-T-Zellen, sondern auch von Tregs bei der Pathogenese von Colitis29 zu untersuchen.
Da dieses Colitis-Modell jedoch durch Darmmikrobiota-spezifische T-Zellen vermittelt wird, besteht eine Einschränkung für dieses Colitis-Modell darin, dass die Dauer der Induktion von Colitis in verschiedenen Tiereinrichtungen je nach Darmmikrobiota variieren kann.
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Disclosures
Kein Autor hat widersprüchliche finanzielle, berufliche oder persönliche Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health Grants DK125011, AI150210 und DK124132, den University of Texas System STARs Award (Y.C.) und den James W. McLaughlin Fellowship Fund der University of Texas Medical Branch in Galveston (W.Y.) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
