Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63293
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch

Summary

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

Abstract

עם העלייה בשכיחות, מחלות מעי דלקתיות (IBD), שהן מחלות כרוניות המשפיעות על מערכת העיכול, מטילות נטל בריאותי וכלכלי ניכר על יחידים וחברה. לכן, זה קריטי לחקור את המנגנונים שבבסיס הפתוגנזה ופיתוח של IBD. כאן מתואר מודל קוליטיס של העברת תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים אנטיגן. CBir1 flagellin הוכר כאנטיגן חיידקי המעיים האימונודומיננטי בקוליטיס ניסיוני וחולים עם מחלת קרוהן. CBir1 TCR מהונדס naϊve CD4+ תאי T, ספציפיים ל- CBir1 flagellin, יכולים לגרום לקוליטיס כרונית לאחר העברה מאמצת לעכברים Rag1-/- לקויי מערכת החיסון. חומרת המחלה מוערכת על ידי היסטופתולוגיה. הפנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופריה המעי הגס נקבעים גם הם. מודל זה דומה מאוד להתפתחות של מחלת המעי הרגיז, המספקת מודל מורין אידיאלי לחקירת המנגנונים המניעים את הפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז ובדיקת התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD), בעיקר כולל מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC), מאופיינות בדלקת כרונית, חוזרת ונשנית של מערכת העיכול, המשפיעה על מיליונים ברחבי העולם1. מספר גורמים היו מעורבים בהתפתחות ובפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז, כולל רגישות גנטית, מיקרוביוטה במעיים, תגובות חיסוניות, תזונה ואורח חיים2. עם זאת, המנגנון המדויק של IBD עדיין לא מובן לחלוטין.

אחד האינטרסים הספציפיים הוא האינטראקציה בין מיקרוביוטה במעיים ותגובות חיסוניות מארחות בוויסות דלקת מעיים3. מיקרוביוטה במעיים מספקת סדרה של מולקולות ואנטיגנים אימונוסטימולטוריים, שיכולים להפעיל תגובות חיסוניות4. בעוד שהאיזון בין תאי T משפיעים לתאי T תקינים (Tregs) הוא קריטי בשמירה על הומאוסטזיס מעיים, תגובת תאי רירית המעיים המוגזמת CD4+ T לאנטיגנים של מיקרוביוטה במעיים תורמת לדלקת מעיים 5,6,7. כאנטיגן מיקרוביוטה מעיים אימונודומיננטי, CBir1 flagellin היה קשור לפתוגנזה של CD8,9 אנושי. יתר על כן, העברה של תאי TCR מהונדסים CBir1 TCR (Tg) T גורמת לדלקת מעיים בעכברים לקויים במערכת החיסון6, הדומה מאוד ל- IBD האנושי, המציין כי מודל העברת תאי T זה מסייע לחקור את המנגנונים של מחלת המעי הרגיז האנושית.

עבודה זו מתארת את הפרוטוקול המפורט של גרימת קוליטיס ב Rag1-/- עכברים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + תאי T והערכה של חומרת המחלה. חוץ מזה, התוצאות הצפויות מוצגות, ואת השלבים הקריטיים של ההליך ופתרון בעיות נדונים, אשר יסייע לחוקרים לחקור את המנגנונים של פתוגנזה של דלקת מעיים ולבדוק את התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי ועדת הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס על השימוש והטיפול בבעלי החיים. עכברי TCR TG CBir1 סופקו על ידי ד"ר צ'ארלס אלסון מאוניברסיטת אלבמה בברמינגהאם. CBir1 TCR Tg עכברים יכולים להיות נקבה או זכר אבל צריך להיות ב 8-12 שבועות. עכברים על רקע C57BL/6 הושגו ממעבדת ג'קסון10. Rag1-/- עכברים חייבים להיות תואמי מין וגיל, וניתן להשתמש בזכר או בנקבה אך צריכים להיות ב 8-12 שבועות. הפרוטוקול כולו מסוכם באיור 1.

1. הכנת עכברי הנמען

  1. הכן Rag1-/- עכברים על רקע C57BL/6, bred באותו מתקן בעלי חיים ספציפי ללא פתוגן. חשב את מספר העכברים לקבוצה לפי ניתוח הספק11.
    הערה: עכברי Rag1-/- אין תאי T בוגרים ותאי B10.
  2. סמן את העכברים על ידי אגרוף אוזניים.
  3. לשקול את העכברים באותו היום של העברת תא T.

2. הכנת הריאגנטים והפתרונות

הערה: הריאגנטים המשמשים רעילים, או מסוכנים ביולוגיים והטיפול בהם זקוק לאמצעי זהירות ואמצעי בטיחות.

  1. הכנת מאגר כביסה: להוסיף 5 מ"ל של 100x פניצילין-סטרפטומיצין לתוך 500 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. מערבבים אותו ביסודיות ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את מאגר תמוגה Tris-NH4Cl.
    1. הכן פתרון חלק A. להמיס 2.06 גרם של בסיס טריס ב 100 מ"ל של מים מזוקקים כפול (ddH2O) ולהתאים את ערך ה- pH ל 7.2 עם HCl.
    2. הכן פתרון חלק B. להמיס 7.47 גרם של NH4Cl ב 800 מ"ל של ddH2O.
    3. יש לערבב את A ו-B ביסודיות. למדוד את ה- pH ולהתאים אותו ל 7.2 אם לא.
    4. כוונן את עוצמת הקול הכוללת ל- 1000 מ"ל. Autoclave ולאחר מכן לאחסן אותו ב 4 °C (65 °F).
  3. הכן את מאגר הבידוד.
    1. הוסף 2.5 גרם של BSA ו 500 μL של EDTA (0.5 M, pH 8.0) לתוך 500 מ"ל של 1x PBS. מערבבים את זה ביסודיות.
    2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן בקבוק חד פעמי מונחה 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). לאחסן אותו ב 4 °C (5 °F).
  4. הכן את מאגר FACS. הוסיפו 1 מ"ל של FBS ו-50 μL של EDTA (0.5 מ', pH 8.0) ל-50 מ"ל של מאגר כביסה (מוכן בשלב 2.1). מערבבים היטב ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן בינוני מלא. יש להוסיף 5 מ"ל של FBS ב-45 מ"ל של מאגר כביסה. מערבבים היטב ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. הכן מאגר EDTA-PBS.
    1. חשב את אמצעי האחסון של מאגר EDTA-PBS הדרוש. עוצמת קול (מ"ל) = מספר עכבר x 20.
    2. הוסף נפח מתאים של FBS, EDTA ו- HEPES ב- PBS (2% של FBS, 0.5 מ"מ של EDTA, 10 מ"מ של HEPES ב- PBS) (ראה טבלת חומרים).
    3. מערבבים אותו ביסודיות וחם מראש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. הכן את מאגר העיכול.
    1. חשב את הנפח של מאגר העיכול הדרוש. עוצמת קול (מ"ל) = מספר עכבר x 10.
    2. הוסיפו נפח מתאים של FBS, Collagenase IV ו-DNase I במאגר כביסה (2% מ-FBS, 0.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז 4 ו-10 U/mL של DNase I במאגר כביסה) (ראו טבלת חומרים).
    3. מערבבים אותו ביסודיות וחם מראש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. הכן פתרון פרקול.
    1. הכינו 100% פרקול. הוסיפו 5 מ"ל של 10x PBS ב-45 מ"ל של פרקול מקורי (ראו טבלת חומרים).
    2. הכינו 2% FBS במאגר כביסה. יש להוסיף מ"ל אחד של FBS ב-49 מ"ל של מאגר כביסה.
    3. קולקולאט את הנפח של 40 % פתרון Percoll ו 75 % פתרון Percoll. נפח של 40% פתרון פרקול (mL) = מספר עכבר x 4; נפח של 75% פתרון פרקול (מ"ל) = מספר עכבר x 2.
      הערה: הריאגנטים/פתרונות שהוכנו בשלבים 2.1-2.5 ישמשו בשלבים 3-4, ואלה שהוכנו בשלבים 2.6-2.8 ישמשו בשלב 9. כל הריאגנטים / פתרונות המשמשים בשלב 9 צריך להיות מוכן טרי. ביצוע 5 % מאגר נוסף מומלץ עבור כל השלבים.

3. בידוד של תאי CBir1 TCR TCR טחול TG CD4 + T

  1. המתת חסד CBir1 TCR Tg עכבר / עכברים על ידי נקע צוואר הרחם עם המתת חסד CO2 (30%-70% שיעור עקירת גז-אוויר). הרטיבו את העכברים עם 70% אתנול.
  2. בצעו חתך בבטן שמאלית של כ-1 ס"מ, הרחיקו את העור מרקמת שריר הבטן, עשו חתך של כ-3 ס"מ ברקמת שריר הבטן, והסירו את הטחול עם מספריים סטריליים ומלקחיים. מניחים את הטחול בצלחת תרבית המכילה 5 מ"ל של חוצץ כביסה טרום קר (מוכן בשלב 2.1).
  3. טוחנים את הטחול עם המשטח המחוספס של שתי מגלשות זכוכית סטריליות. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל על ידי עובר דרך מסננת תא 100 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). שטפו את מגלשות הזכוכית ואת צלחת התרבות עם 5 מ"ל של חוצץ כביסה קר מראש והעבירו את מאגר הכביסה לצינור.
  4. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). השליכו את הסופר-נרטיב והגדילו מחדש את התאים עם 5 מ"ל של מאגר תמיס טריס-NH4Cl שחומם מראש (מוכן בשלב 2.2) לטחול. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש להוסיף לצינור 10 מ"ל של חוצץ כביסה קר מראש.
  5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). השלך את supernatant ו resuspened התאים עם 10 מ"ל של חוצץ בידוד טרום קר (מוכן בשלב 2.3).
  6. תספור את התאים. מערבבים 10 μL של השעיית תאים עם 10 μL של טריפאן כחול ביסודיות. טען 10 μL של התערובת על שקופית, הכנס את השקופית לתוך מונה התא האוטומטי (ראה רשימת חומרים) ולקבל את מספר התא קיימא12.
    הערה: ניתן להשיג בשלב זה כ- 1 x 108 תאים מעכבר תורם אחד.
  7. צנטריפוגה ההשעיה התא הנותרת משלב 3.6 ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F ). זרוק את כל הסופר-נאנטים.
  8. מערבולת חלקיקים מגנטיים CD4 נגד עכבר ביסודיות (ראה טבלת חומרים), ישירות להוסיף 50 μL של החלקיקים לכל 107 תאים ולערבב עם כדורי תאים ביסודיות. דגירה במשך 30 דקות ב 4 °C (65 °F).
    הערה: ניתן להשתמש כאן בכל ערכת העשרת תאים מסחרית CD4+ T מסחרית אחרת.
  9. העבר את ההשעיה של חלקיקי התא לצינור איסוף סטרילי. הוסף 3.5 מ"ל של חוצץ בידוד טרום קר לתוך הצינור.
  10. מניחים את הצינור על מגנט הפרדת התאים (ראה טבלת חומרים) במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה העברה 3 מ"ל.
  11. הסר את הצינור ממגנט הפרדת התאים (ראה טבלת חומרים), resuspend התאים עם 3.5 מ"ל לפני חוצץ בידוד קר, ומניחים את הצינור למגנט במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה העברה 3 מ"ל.
  12. חזור על שלב 3.11.
  13. לפנק מחדש את התאים עם 1 מ"ל של מאגר FACS טרום קר (מוכן בשלב 2.4).

4. טיהור של CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ תאי T

  1. ספור את התאים לאחר שלב 3.6.
  2. אם ריכוז התא הוא >107/מ"ל, הוסף נפח של מאגר FACS כדי לוודא שריכוז התא הוא ≤ 107/mL.
    הערה: ~ 1 × 107 תאים ניתן להשיג מעכבר תורם אחד בשלב זה.
  3. להכתים את סמני פני השטח עם 10 μL של CD4-APC נגד העכבר, 10 μL של CD25-Percp/Cy5.5 נגד העכבר, ו 10 μL של CD62L-PE13,14 נגד העכבר (ראה רשימת חומרים). מערבבים בעדינות ודגורים במשך 30 דקות ב 4 °C (50 °F) בחושך.
  4. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של מאגר FACS טרום קר. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). לשאוף את כל supernatantsusing פיפטה העברה 3 מ"ל.
  5. חזור על שלב 4.4.
  6. התקן מחדש את התאים לריכוז של 40 x 106/mL במאגר FACS טרום קר.
    הערה: כדי למנוע מהממיין לסתום את הפה, העבירו את התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר.
  7. הוסף 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI.
    הערה: DAPI משמש לאי-הכללת התאים המתים.
  8. הכן צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל המכילים 4 מ"ל של מדיום מלא (מוכן בשלב 2.5) לאיסוף התאים הממוינים.
  9. טען את התאים לסדרן. מיין תאי CD4+ T בני קיימא יחידים (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ תאים) במצב טוהר (גודל זרבובית: 70 מיקרומטר; לחץ: 70 PSI; תעריף אירועים: 8000-12000 אירועים/ים; יעילות: גבוה מ-90% (איור 2).
    הערה: תאי Naϊve CD4+ T מבטאים ביטוי גבוה של CD62L וחסרים את סמן ההפעלה CD2513,14.
  10. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). לשאוף את כל supernatants באמצעות פיפטה העברה 3 מ"ל.
  11. resuspend התאים ב 500 μL של 1x PBS.
  12. ספירת תאים לאחר שלב 3.6
    הערה: ~ 5 × 106 תאים ניתן להשיג מעכבר תורם אחד בשלב זה.

5. העברת תאים לעכברי הנמען

  1. תוסיף מחדש את תאי CBir1 TCR TCR Tg naϊve CD4+ T לריכוז של 5 x 106/mL על-ידי הוספת 1x PBS.
  2. מחממים את העכברים מתחת למנורת חום (ראו טבלת חומרים) למשך 4 דקות, ומרסנים את העכברים באמצעות מרסן עכברים.
  3. תוך ורידי להעביר 200 μL של השעיית התא לתוך הווריד הזנב של Rag-/ - עכברים באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל (27 גרם) (ראה טבלת חומרים).
    הערה: תאים מעכבר תורם אחד מספיקים כדי לעבור לכ-5 עכברים נמענים.

6. ניטור סימנים קליניים במהלך התקדמות קוליטיס

  1. לשקול את העכברים בכל שבוע ולהגדיל את התצפית פעמיים בשבוע פעם העכברים מתחילים לאבד >5% של משקולות המקוריות.
  2. שימו לב לתגובה/תזוזה של עכברים כאשר הם מגורים בעדינות.
  3. שים לב לחריגות קליניות אחרות. כלומר, יציבה ועקביות צואה.

7. אוסף מעי גס וניקוד היסטופתולוגי

  1. להקריב את העכברים המטופל על ידי נקע צוואר הרחם עם CO2 בנקודת זמן של ירידה במשקל >20% מהמשקל המקורי או 6 שבועות לאחר העברת התא. הרטיבו את העכברים עם 70% אתנול.
  2. בצעו חתך עור בקו האמצע של הגחון~ 1 ס"מ, הרחיקו את העור מרקמת שריר הבטן, בצעו חתך של כ-3 ס"מ ברקמת שריר הבטן, זהו את הצואה והסירו את המעי הגס כולו עם מספריים ומלקחיים סטריליים. הרטיבו את המעי הגס עם PBS קר מראש בצלחת תרבות.
  3. לחתוך את המעי הגס לאורכו ולשטוף אותו עם PBS טרום קר. חותכים 1/3 של המעי הגס אורך.
  4. מניחים את רצועת המעי הגס במגבת נייר כשהצד הזוהר פונה כלפי מעלה. בצע גלגול שוויצרי באמצעות קיסם15.
  5. מניחים את המעי הגס השוויצרי לתוך קלטת ולשים את הקלטת ב 10% פורמלין חוצץ עבור 24 שעות16, ואחריו התייבשות באמצעות מעבד אוטומטי (ראה טבלת חומרים) והטבעת פרפין.
  6. חותכים 5 מיקרומטר מקטעי רקמה על מיקרוטומיה, מותקנים על שקופיות, ומבצעים את הכתם המטוקסילין והאאוזין (H&E)17 (ראו טבלת חומרים).
  7. קבע את הציונים ההיסטופתולוגיים על ידי שילוב הציונים עבור כל אחד מששת הפרמטרים לכל היותר 12. דלקת Lamina propria (נורמלי, 0; מתון, 1; מתון, 2; חמור, 3); אובדן תאי גביע (נורמלי, 0; מתון, 1; בינוני, 2; חמור, 3); קריפטה חריגה (נורמלית, 0; היפרפלסטית, 1; חוסר ארגון, 2; אובדן קריפטה, 3); מורסות קריפטה (נעדרות, 0; הווה, 1); שחיקה רירית וכיב (נורמלי, 0; מתון, 1; מתון, 2; חמור, 3); ושינוי תת-מולקולרי (ללא, 0; תת-סוכר, 1; טרנסמורלי, 2)18.

8. בידוד והכתמה של תאי לאמינה פרופריה מעיים

  1. לאחר שלב 7.3, לחתוך עוד 2/3 של המעי הגס לחתיכות 0.5-1 ס"מ ולשטוף אותו עם PBS קר מראש.
  2. מעבירים את מקטעי המעי הגס למאגר EDTA-PBS שחומם מראש ב-20 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 250 סל"ד רועדת למשך 30 דקות.
  3. מערבולת את הצינור, להשליך את supernatants על ידי העברתו דרך מסננת סטרילית (קוטר: 0.01 אינץ '), ו resuspend מקטעי המעי הגס ב 20 מ"ל של PBS טרום קר בצינור 50 מ"ל.
  4. חזור על שלב 8.3 פעמיים.
  5. מקם את מקטעי המעי הגס בצינור C (ראה טבלת חומרים) המכיל 10 מ"ל של מאגר עיכול שחומם מראש.
  6. מניחים את הצינור על מכונת Dissociator (ראה טבלת חומרים) ודגור תחת התוכנית של "37C_m_LPDK_1" במשך 25 דקות.
    הערה: "37C_m_LPDK_1" היא תוכנית קבועה מראש סטנדרטית במכונת Dissociator המשמשת לערבוב הדגימות ושמירה עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. בדוק אם הרקמה מתעכלת לחלוטין, מה שאומר שאף פיסת רקמה אינה נמצאת במאגר העיכול. אם לא, חזור על התוכנית של "37C_m_LPDK_1".
  8. לאסוף את supernatant על ידי עובר דרך מסננת מתכת מסננת 100 μL מסננת. יש לשטוף ב-10 מ"ל של PBS קר מראש.
  9. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). לשאוף את כל supernatants.
  10. Resuspend התאים ב 4 מ"ל של 40% פתרון Percoll ולערבב אותו ביסודיות (מוכן בשלב 2.8).
  11. מעבירים את התאים המחודשים ל-2 מ"ל של תמיסת 75% פרקול בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  12. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 850 x g במשך 20 דקות ב 20 °C (שיפועת תאוצה: 0; רמפה בלם: 0).
  13. יש להסיר בזהירות את השומן בשכבה העליונה באמצעות פיפטת העברה של 3 מ"ל ולהעביר את שכבת התא ל-20 מ"ל של מאגר כביסה בצינור של 50 מ"ל.
  14. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (60 °F). יש להשליך את כל הסופר-נאנטים ולספק מחדש את התאים ב-1 מ"ל של "מדיום שהושלם".
  15. ספור את התאים לאחר שלב 3.6.
  16. זרע את התאים בצלחת 24-well, להפעיל אותם עם 50 ng/ mL של Phorbol-12-myristate 13-אצטט ו 750 ng/mL של ionomycin עבור 2 שעות, ואחריו דגירה עם 5 מיקרוגרם / מ"ל של ברפלדין A במשך 3 שעות (ראה טבלת חומרים).
    הערה: הריאגנטים המשמשים רעילים, והטיפול בהם זקוק לאמצעי זהירות ואמצעי בטיחות.
  17. מעבירים את התאים לצינור FACS, מוסיפים 2 מ"ל של מאגר FACS, וצנטריפוגה התאים ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
  18. דגירה התאים עם 12.5 מיקרוגרם / מ"ל של CD16/3219 נגד עכברים (ראה טבלת חומרים) מאגר FACS כדי לחסום קולטני Fc במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  19. כתם עבור חי / מת וסמן פני השטח.
    1. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של מאגר FACS וצנטריפוגה אותם ב 350 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
    2. הכתים את התאים בצבע חי ובסמני שטח (כלומר, CD3 נגד עכברים ונוגדני CD4 נגד עכברים)20 (ראה טבלת חומרים) במאגר FACS בריכוז הממוטב למשך 30 דקות ב 4 °C (4 °C (4 °C בקירוב).
      הערה: הריאגנטים המשמשים רעילים, והטיפול בהם זקוק לאמצעי זהירות ואמצעי בטיחות.
  20. בצע את הכתמים התאיים והגרעיניים.
    1. הוסף 2 מ"ל של מאגר FACS וצנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
    2. Permeabilize ולתקן את התאים על ידי resususpending התאים עם 200 μL של תמלול גורם תיקון פתרון עבודה (ראה טבלת חומרים) במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הוסף 2 מ"ל של חיץ פרם וצנטריפוגה השעיית התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
    4. דגירה התאים עם סמנים תאיים וגרעיניים (כלומר, IFNγ נגד עכבר, אנטי עכבר IL-17A, ונוגדני Foxp3 נגד עכבר)20 במאגר פרם (ראה טבלת חומרים) במשך 30 דקות-1 שעה בטמפרטורת החדר.
    5. הוסף 2 מ"ל של חיץ פרם וצנטריפוגה השעיית התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
    6. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS וצנטריפוגה השעיית התא ב 350 x g במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
  21. תנצל מחדש תאים עם 200 μL של מאגר FACS והפעל את הדגימות על ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כ 5 x 106 CBir1 TCR TCR Tg naϊve CD4 + T תאים לטחול היו מבודדים מעכבר CBir1 TCR TG בוגר. העברה של CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ תאי T המושרה קוליטיס כרונית בנמען Rag1-/- עכברים. לאחר העברת תאים, סימנים קליניים היו במעקב כדי להעריך את ההתקדמות של דלקת מעיים, כולל ירידה במשקל, עקביות הצואה, ויציבה כפופה. כצפוי, עכברים החלו לרדת במשקל כשלושה שבועות לאחר העברת התא, והמשקל הגיע לסביבות 80%-85% מהמשקל המקורי שישה שבועות לאחר העברת התא (איור 3). בנוסף, עכברים הראו שלשולים סביב 3-4 שבועות לאחר העברת התא והפגינו יציבה כפופה כאשר הם פיתחו קוליטיס חמורה. מורפולוגיה גסה של המעי הגס הוצגה, וחומרת קוליטיס הוערך על ידי הציון ההיטופתולוגי כאשר עכברים הוקרבו. עכברים שקיבלו תאי CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T הראו אורך מעי גס 6 שבועות לאחר העברת התא (איור 4A). עכברי הנמען הדגימו יותר חדירת תאים במעיים למינה פרופריה 4 שבועות לאחר העברת התא (איור 4C), אובדן תאי גביע והיפרפלזיה של תאי אפיתל מעיים 5 שבועות לאחר העברת התא (איור 4D), ושחיקה רירית וחדירת תאים דלקתיים בתת-מולקולה של המעי הגס 6 שבועות לאחר העברת התא (איור 4F). יחד עם זאת, לא הייתה דלקת בעכברים שקיבלו PBS בלבד (איור 4B). חוץ מזה, אין דלקת במעי הדק, אבל cecum יש דלקת. בנוסף, פנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופוריה המעי הגס נקבעו על ידי ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית הגיטינג מוצגת (איור 5A-E). תאי CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T שפותחו לתאי IFNγ+ Th1, תאי IL-17A+ Th17, תאי IFNγ+ IL-17+ CD4+ T (איור 5F) ותאי Foxp3+ Treg בלמינה פרופוריה במעיים של Rag1/- נמענים (איור 5G).

Figure 1
איור 1: ההליך של קוליטיס אינדוקציה והערכה של חומרת המחלה. תאי CD4+ T של הטחול בודדו מעכברים מהונדסים CBir1 TCR באמצעות חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן תאי naϊve T טוהרו על ידי מיון. CBir1 TCR תאי naϊve T מהונדסים הועברו אז דרך הווריד לנמען Rag1-/- עכברים. כאשר העכברים הוקרבו כשישה שבועות לאחר העברת התא, חומרת קוליטיס הוערכה על ידי ציונים היסטופתולוגיים. הפנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופוריה המעי הגס נקבעו על ידי ציטומטריית זרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית ההתהוות למיון תאי TCR מהונדסים מסוג CBir1 TCR Tϊve T. תאי Naϊve TCR מהונדסים CBir1 יחיד קיימא טוהרו על ידי אי-הכללת פסולת (A), תאים שאינם יחידים (B-C), תאים מתים (D) ותאים מופעלים (E-F). אוכלוסיית המשנה הוצגה ב- (G). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שינויי המשקל של Rag1-/- עכברים לאחר העברת תאי T. 1 x 106 תאי TCR מהונדסים מסוג CBir1 TCR הועברו לעכברי Rag1/- ו- Rag1-/- עכברים שקיבלו PBS שימשו כפקדים. משקולות עכבר נרשמו כל שבוע. הנתונים הוצגו ב-SD ± ממוצע; מבחן T של התלמיד; עמ<0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: המורפולוגיה הגסה וההמטוקסילין וכתמי האאוזין של המעי הגס מ - Rag1-/- עכברים המקבלים תאי CBir1 TCR מהונדסים naϊve T. (A) העכברים הנמענים הוקרבו שישה שבועות לאחר העברת התא, והראה את המורפולוגיה הגסה של המעי הגס. (ב-ה) עכברי הנמען הוקרבו בנקודות זמן שונות, ועכברי Rag1/- קיבלו PBS כפקדים. המעי הגס עובד עבור הכתמת המטוקסילין ואאוזין. תמונות מייצגות של המטוקסילין וכתם אאוזין של המעי הגס מוצגות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (F) נקבעו ציונים היסטופתולוגיים. הנתונים הוצגו בממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופוריה המעי הגס של עכברי Rag-/- המקבלים תאי TCR מהונדסים מסוג CBir1 TCR. כאשר עכברי הנמען הוקרבו 6 שבועות לאחר העברת התא, תאי לאמינה פרופוריה המעי הגס היו מבודדים להכתמת פנוטיפים של תאי CD4+ T. (א-ה) אסטרטגיית הגיטינג לניתוח פנוטיפים של תאי T. (F-G) (F) תאי IL-17A+ CD4+ T, תאי IFNγ+ CD4+ T, תאי IL-17+ IFNγ+ CD4+ T, ו- (G) Foxp3+ Tregs נקבעו על ידי ציטומטריית זרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות כל צעד חיוני עבור רבייה של מודל קוליטיס זה, ישנם מספר צעדים קריטיים. הנמען Rag-/- עכברים צריכים לקבל נאותה naϊve CD4 + תאי T כדי לגרום לדלקת מעיים. השתמשנו בטחול לבידוד של תאי CD4 + T נאיביים במקום MLNs. כי התשואה של תאי CD4+ T נאיביים ב- MLNs נמוכה בהרבה מאשר בטחול. CD62L מתבטא מאוד בתאי T נאיביים, ו- CD44 ו- CD25 הם סמני ההפעלה של תאי T13,14. במחקר זה, השתמשנו לראשונה בחרוזים מגנטיים נגד CD4 כדי לבודד תאי CD4+ T מטחול. לאחר מכן השתמשנו בשילוב של נוגדי CD4, נוגדי CD62L ונוגדנים נגד CD25 לבידוד של תאי CD4 + T נאיביים13,14. חוקרים יכולים להשתמש סמנים אחרים למיון תאי CD4 + T נאיביים. CD45RBhi הוא גם סמן של תאי T נאיביים. תאי CD45RBhi CD25- CD4+ T משמשים בדרך כלל כתאי T נאיביים של תאי T מהונדסים מסוג פראי שאינו TCR23. לכן, הטכניקות של מיון תאים והזרקה תוך ורידי של תאי T לעכברי המטופל הם חיוניים. הגדרת פרוטוקול ההרחבה כתבנית מועילה להאצת הניסויים עם פחות שגיאות. כדי למנוע מוות של תאים, תאים תמיד צריכים להישמר על קרח. חוץ מזה, כתמים תאים עם DAPI מומלץ מאוד עבור למעט תאים מתים כי DAPI לא יכול לעבור על פני קרום תא שלם, מה שהופך אותו בדיקה מצוינת של תאים מתים24. חימום העכברים כדי לעורר התרחבות של ורידים הזנב מספק ראות ורידים טובה יותר להזרקה תוך ורידי. כל ההליכים מומלצים להתבצע על ידי חוקרים מיומנים.

גורמים רבים עשויים להשפיע על התוצאה של מודלים קוליטיס, אשר צריך להיות שם לב. ראשית, הנמען Rag1-/- עכברים צריכים להיות בגיל והתאמה מגדרית. במודל העברת התאים CD45RBhi T, תאי T מתורמים זכרים ונקבות יכולים להיות מועברים למקבלי סמרטוטים זכרים, בעוד שרק תורמות נשיות יכולות לשמש בעת שימוש בנמענים נשיים23. עם זאת, איננו רואים הבדל משמעותי בין מקבלי זכר ונקבה. עכברי הנמען יכולים להיות נקבות או זכרים, ותאי T מתורמים זכרים יכולים גם לגרום לקוליטיס אצל נמענים נשיים. מאז שינוי במשקל הוא אינדיקטור בעל ערך של התקדמות קוליטיס, מומלץ להשתמש בעכברים המטופל בין 8-12 שבועות כדי להציג קו משקל יציב. עכברים נמענים אלה צריכים להיות bred ונשמר באותו חדר של מתקן בעלי החיים כי מיקרוביוטה היא קריטית בוויסות פיתוח קוליטיס25. הזמן לפתח קוליטיס משתנה בעת העברת מספרים שונים של CBir1 TCR TG תאי CD4 TÏiveive. כצפוי, פחות תאים דורשים זמן רב יותר עבור אינדוקציה של קוליטיס, ומספר גבוה יותר של תאים דורשים זמן קצר יותר עבור אינדוקציה של קוליטיס. שימוש 1 x 106 תאים לכל עכבר נמען מומלץ מאז העכברים המטופל להפגין סימנים קליניים של קוליטיס ~ 2-3 שבועות לאחר העברת התא ולפתח קוליטיס חמור יחסית ~ 6 שבועות לאחר העברת התא. בנוסף, בהשוואה להזרקה תוך-גופית, הזרקה תוך ורידית של תאים לווריד הזנב גורמת לקוליטיס עקבית יותר. לבידוד של תאי lamina פרופריה המעי הגס, רקמות המעי הגס לא חייב להתייבש; אחרת, זה יפחית את התשואה והכדאיות של התאים. אחד החששות הספציפיים הוא כי משך הקוליטיס ישתנה אם עכברי הנמען יועברו עם תאי CBir1 TCR Tg Tg TG TG מהונדסים גנטית או יטופלו בתרופות26. בנוסף, תאי CBir1 TCR Tg TG T גורמים גם לדלקת מעיים בעכברים אחרים הסובלים ממחסור במערכת החיסון, כגון TCRβ/δ-/- עכברים, שחסרים בהם תאי T27.

כפי שצובר ראיות מצביע על תפקיד מכריע של תאי T תגובתי ספציפיים אנטיגן חיידקי המעיים בפתוגנזה של IBD, באמצעות תאי T ספציפיים עבור אנטיגן חיידקי מעיים מוגדר יספק תובנות כיצד אנטיגן חיידקי המעיים לגרום לתגובות תאי T לגרום קוליטיס. מיקרוביוטה המעיים אנטיגן CBir1 flagellin הוא בשפע במערכת העיכול, אשר קשורה פתוגנזה של IBD8,9. מודל קוליטיס זה דומה למספר מאפיינים קריטיים של מחלת המעי הרגיז, כולל שלשולים, ירידה במשקל, ממצא היסטופתולוגי, ותגובות חיסוניות מעיים חריגות. לכן, מודל קוליטיס זה שימושי כדי ללמוד את המנגנונים של IBD אנושי ומספק כלי כדי להעריך את הטיפולים עבור IBD. מעניין, העבודה האחרונה של Chiaranunt ואח ' הצביעה על כך הספציפיות של תאי T לאנטיגן CBir 1 מיקרוביוטה לבד לא יכול להיות מספיק כדי לגרום להפעלת תאי T וקוליטיס. עדות לכך היא תאי CBir1 TCR Tg Tg T מסוג בר המושרה קוליטיס ב Rag-/- נמענים, בעוד שתאי Rag-/- CBir1 T לא גרמו לקוליטיס במתקן החי שלהם, מה שמרמז על כך שתאי T במעיים המגיבים לאנטיגן חיידקי מעיים ספציפיים עשויים לדרוש חיידקים קומנסליים הקשורים זה בזה, למשל, הליקובקטר spp, לתפקד כאדג'ובנט28 . היבט מרגש של מודל זה הוא כי תתי קבוצות תאי T שונים, כלומר Th1, Th17, ותאי Treg, נמצאים lamina propria של עכברי נמען קוליטי, אשר מספק הזדמנות ייחודית לחקור את התפקידים של לא רק תאי T מפעיל אלא גם Tregs בפתוגנזה של קוליטיס29.

עם זאת, כמו מודל קוליטיס זה מתווך על ידי תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים, מגבלה אחת עבור מודל קוליטיס זה היא כי משך האינדוקציה של קוליטיס עשוי להשתנות במתקני בעלי חיים שונים בהתאם מיקרוביוטה המעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף מחבר אין אינטרסים כלכליים, מקצועיים או אישיים סותרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מעניקים DK125011, AI1502110, ו- DK124132, פרס STARs מערכת אוניברסיטת טקסס (Y.C.), וקרן מלגת ג'יימס ו. מקלפלין מהסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון (W.Y.). איור 1 נוצר עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter MilliporeSigma SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
100-µm strainer BD Biosciences 352360
3-mL Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32 Biolegend 101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 Biolegend 102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 Biolegend 100327
Anti-Mouse CD4 APC Biolegend 100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles BD Biosciences 551539
Anti-Mouse CD4-BV421 Biolegend 100544
Anti-Mouse CD62L-PE Biolegend 104408
Anti-Mouse Foxp3-PE ThermoFisher 12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC Biolegend 505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 Biolegend 506922
Automated Cell Counter Bio-rad TC20
Brefeldin A BD Biosciences 555029
BSA Fisher Bioreagents BP1600-1
C tube Miltenyi 130-093-237
Cell Separation Magnet BD Biosciences 552311
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Dissociator Machine Miltenyi 130-096-427
DNase I Sigma-Aldrich
EDTA Corning 46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0) Corning 46-034-CI
FBS R&D Systems S11550
Flow cytometer BD Biosciences LSD Fortessa
Heat Lamp CoverShield BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit Abcam ab245880
Insulin Syringes BD Biosciences 329412
Ionomycin ThermoFisher I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit ThermoFisher L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers ThermoFisher SHKE6000
NH4Cl Thermo Scientific A687-500
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
RPMI 1640 Medium Cytiva HyClone SH3002702
Sorter BD Biosciences Arial Fusion
Tissue Automatic Processor ThermoFisher STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette Fisher Healthcare 22048142
Tris Base Thermo Scientific BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) Biolegend 424401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
  2. Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
  3. Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
  4. Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
  5. Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
  6. Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
  7. Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
  8. Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
  9. Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
  10. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
  13. Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
  14. Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
  15. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  16. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  18. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  19. Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
  20. Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
  21. Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
  22. Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
  23. Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
  24. Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
  25. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  26. Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
  27. Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
  28. Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
  29. Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).

Tags

רפואה גיליון 178
אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 <sup>+</sup> TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction … More

Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (178), e63293, doi:10.3791/63293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter