Summary
Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.
Abstract
Görülme sıklığının artmasıyla gastrointestinal sistemi etkileyen kronik hastalıklar olan inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), bireylere ve topluma önemli bir sağlık ve finansal yük getirmektedir. Bu nedenle, patogenezin ve IBD gelişiminin altında kalan mekanizmaların araştırılması kritik öneme sahiptir. Burada bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücre transferi kolit modeli tanımlanmıştır. CBir1 flagellin, deneysel kolitte ve Crohn hastalığı olan hastalarda immünomisinant bağırsak bakteriyel antijeni olarak kabul edilmiştir. CBir1 flagellin'e özgü CBir1 transgenik naϊve CD4+ T hücreleri, bağışıklık eksikliği olan Rag1/- farelere evlat edindikten sonra kronik kolite neden olabilir. Hastalığın şiddeti histopatoloji ile değerlendirilir. Kolonik lamina propriasındaki CD4+ T hücre fenotipleri de belirlenir. Bu model, IBD patogenezini yönlendiren mekanizmaları araştırmak ve IBD'yi tedavi etmek için potansiyel ilaçları test etmek için ideal bir murine modeli sağlayan IBD'nin geliştirilmesine yakından benzemektedir.
Introduction
Özellikle Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), gastrointestinal sistemin kronik, nükseden-remitting iltihabı ile karakterizedir ve dünya çapında milyonlarca 1. Genetik duyarlılık, bağırsak mikrobiyotası, immün yanıtlar, diyet ve yaşam tarzı2 dahil olmak üzere IBD'nin gelişiminde ve patogenezinde çeşitli faktörler söze dahil edilmiştir2. Ancak, IBD'nin tam mekanizması hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Özel ilgi alanlardan biri bağırsak mikrobiyotası ve konak immün yanıtları arasındaki etkileşim bağırsak iltihabını düzenlemede3. Bağırsak mikrobiyotası, immün yanıtları aktive edebilecek bir dizi immünostimülatuvar molekül ve antijen sağlar4. Efektör T hücreleri ile düzenleyici T hücreleri (Tregs) arasındaki denge bağırsak homeostazını korumada kritik öneme sahipken, bağırsak mikrobiyota antijenlerine aşırı bağırsak mukozal CD4+ T hücre yanıtı bağırsak iltihabına katkıda bulunur5,6,7. İmmünodominant gut mikrobiyota antijeni olarak, CBir1 flagellin insan CD8,9 patogenez ile ilişkili olmuştur. Ayrıca, CBir1 TCR transgenik (Tg) T hücrelerinin transferi, bağışıklık eksikliği olan farelerde bağırsak iltihabına neden olur6, insan IBD'sine çok benzer, bu da bu T hücre transfer modelinin insan IBD'nin mekanizmalarını araştırmaya yardımcı olduğunu gösterir.
Bu çalışma, CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücrelerinin benimsenerek ve hastalık şiddetini değerlendirerek Rag1-/- farelerde kolit indüklemenin ayrıntılı protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, beklenen sonuçlar gösterilir ve araştırmacıların bağırsak iltihabı patogenezinin mekanizmalarını araştırmalarına ve IBD tedavisi için potansiyel ilaçları test etmelerine yardımcı olacak prosedürün ve sorun gidermenin kritik adımları tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nin Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi'ne göre gerçekleştirildi. CBir1 TCR Tg fareleri Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nden Dr. Charles Elson tarafından sağlandı. CBir1 TCR Tg fareleri dişi veya erkek olabilir, ancak 8-12 haftada olmalıdır. C57BL/6 arka planındaki Rag1-/- fareler Jackson Laboratuvarı10'dan elde edildi. Rag1-/- fareler cinsiyet ve yaşla eşleşmelidir ve erkek veya dişi kullanılabilir, ancak 8-12 haftada olmalıdır. Protokolün tamamı Şekil 1'de özetlenmiştir.
1. Alıcı farelerin hazırlanması
- Aynı patojen içermeyen hayvan tesisinde yetiştirilen C57BL/6 arka planında Rag1/- fareleri hazırlayın. Güç analizine göre grup başına fare sayısını hesaplayın11.
NOT: Rag1-/- farelerin olgun T hücreleri ve B hücreleri yok10. - Fareleri kulak yumruğuyla işaretleyin.
- Fareleri T hücre transferinin aynı gününde tartın.
2. Reaktiflerin ve çözümlerin hazırlanması
NOT: Kullanılan reaktifler toksik veya biyolojik tehlikedir ve kullanımları için önlemlere ve güvenlik önlemlerine ihtiyaç vardır.
- Yıkama Tamponu Hazırlayın: 500 mL RPMI 1640 ortamına 5 mL 100x Penisilin-Streptomisin ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın.
- Tris-NH4Cl Lizis Arabelleği hazırlayın.
- Çözelti Parçası A'yı hazırlayın.
- Çözüm Parçası B'yi Hazırlayın.
- A ve B'yi iyice karıştırın. pH'ı ölçün ve değilse 7,2'ye ayarlayın.
- Toplam ses seviyesini 1000 mL'ye ayarlayın. Otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
- yalıtım arabelleği hazırlayın.
- 500 mL 1x PBS'ye 2,5 g BSA ve 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) ekleyin. İyice karıştırın.
- Çözeltiyi 0,22 μm vakumla tahrikli tek kullanımlık şişe üst filtresinden geçirin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de saklayın.
- FACS Arabelleği hazırlayın. 50 mL Yıkama Tamponuna (adım 2.1'de hazırlanmış) 1 mL FBS ve 50 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın.
- Komple Orta Hazırlanın. 45 mL Yıkama Tamponu'nda 5 mL FBS ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın.
- EDTA-PBS Arabelleği hazırlayın.
- Gereken EDTA-PBS Arabelleği'nin hacmini hesaplayın. Birim (mL) = fare numarası x 20.
- PBS'ye uygun FBS, EDTA ve HEPES hacmi ekleyin (FBS'nin %2'si, EDTA'nın 0,5 mM'si, PBS'de 10 mM HEPES) (bkz. Malzeme Tablosu).
- 37 °C'lik su banyosunda iyice ve önceden ısıtın.
- Sindirim Arabelleği'ni hazırlayın.
- Gereken Özet Arabelleği'nin hacmini hesaplayın. Birim (mL) = fare numarası x 10.
- Yıkama Tamponunda uygun FBS, Kollajenaz IV ve DNase I hacmi ekleyin (FBS'nin% 2'si, Kollajenaz IV'ün 0.5 mg / mL'si ve Yıkama Tamponunda 10 U / mL DNase I) (bkz. Malzeme Tablosu).
- 37 °C'lik su banyosunda iyice ve önceden ısıtın.
- Percoll Çözümünü Hazırlayın.
- %100 Percoll hazırlayın. 45 mL orijinal Perkol'a 5 mL 10x PBS ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Yıkama Tamponunda % 2 FBS hazırlayın. 49 mL Yıkama Tamponu'nda 1 mL FBS ekleyin.
- %40 Percoll Çözeltisi ve %75 Percoll Sokunun hacmini hesapla. %40'ın Hacmi Kovan Çözeltisi (mL) = fare numarası x 4; %75'lik Toplama Çözümü (mL) hacmi = fare numarası x 2.
NOT: 2.1-2.5 adımlarında hazırlanan reaktifler/çözümler 3-4. adımlarda, 2.6-2.8 adımlarında hazırlananlar ise 9. 9. adımda kullanılan tüm reaktifler/çözeltiler yeni hazırlanmalıdır. Tüm adımlar için %5 ekstra Tampon yapılması önerilir.
3. Dalak CBir1 TCR Tg CD4+ T hücrelerinin izolasyonu
- CBir1 TCR Tg fare/fareleri CO2 ötanazisi ile servikal çıkık ile ötenazi (%30-%70 gaz-hava deplasman oranı). Fareleri% 70 etanol ile ıslatın.
- ~1 cm sol karın kesisi yapın, cildi karın kas dokusundan çekin, karın kas dokusunda ~ 3 cm'lik bir kesi yapın ve dalağını steril makas ve tostips ile çıkarın. Dalağını 5 mL soğuk öncesi Yıkama Tamponu içeren bir kültür yemeğine yerleştirin (adım 2.1'de hazırlanır).
- Dalağını iki steril cam kaydırağın pürüzlü yüzeyiyle öğütün. Hücre süspansiyonunu 100 μm hücre süzgecinden geçirerek 50 mL santrifüj tüpüne aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Cam kaydırakları ve kültür çanağını 5 mL soğuk öncesi Yıkama Tamponu ile durulayın ve Yıkama Tamponunu tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve dalak başına önceden ısıtılmış 5 mL Tris-NH4Cl Lizis Tamponu (adım 2.2'de hazırlanmış) ile hücreleri yeniden biriktirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Tüpe 10 mL soğuk öncesi Yıkama Tamponu ekleyin.
- Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. Süpernatant atın ve hücreleri 10 mL soğuk öncesi İzolasyon Tamponu ile yeniden depola (adım 2.3'te hazırlanmıştır).
- Hücreleri sayın. 10 μL hücre süspansiyonu ile 10 μL trippan mavisi iyice karıştırın. Karışımın 10 μL'lik kısmını bir slayda yükleyin, slaydı Otomatik Hücre Sayacı'na yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve uygulanabilir hücre numarasını 12 elde edin.
NOT: Bu adımda bir donör fareden yaklaşık 1 x 108 hücre elde edilebilir. - Kalan hücre süspansiyonu 3,6 adımdan 350 x g'da 4 °C'de 8 dakika santrifüj edin. Tüm süpernatantları atın.
- Fare karşıtı CD4 Manyetik Parçacıkları iyice girdaplayın (bkz. Malzeme Tablosu), doğrudan 107 hücre başına 50 μL partikül ekleyin ve hücre peletleriyle iyice karıştırın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
NOT: Burada başka herhangi bir ticari CD4+ T hücre zenginleştirme kiti kullanılabilir. - Hücre parçacık süspansiyonu steril bir toplama tüpüne aktarın. Tüpe 3,5 mL soğuk öncesi İzolasyon Tamponu ekleyin.
- Tüpü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca Hücre Ayırma Mıknatısı üzerine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). 3 mL Transfer Pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice emiş edin.
- Tüpü Hücre Ayırma Mıknatısı'ndan çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu), hücreleri 3,5 mL soğuk öncesi İzolasyon Tamponu ile yeniden depolayın ve tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca Mıknatısa yerleştirin. 3 mL Transfer Pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice emiş edin.
- 3.11.
- Hücreleri 1 mL soğuk öncesi FACS Tamponu ile yeniden depola (adım 2.4'te hazırlanmıştır).
4. CD4+ T hücrelerinin CBir1 TCR Tg naϊve saflaştırılması
- 3.6. adımı izleyen hücreleri sayın.
- Hücre konsantrasyonu >107/mL ise, hücre konsantrasyonunun 107/mL'≤ olduğundan emin olmak için bir hacim FACS arabelleği ekleyin.
NOT: Bu adımda bir donör fareden ~1 × 107 hücre elde edilebilir. - Yüzey işaretleyicilerini 10 μL fare önleyici CD4-APC, 10 μL fare karşıtı CD25-Percp/Cy5.5 ve 10 μL fare karşıtı CD62L-PE13,14 ile lekeleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Hafifçe karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 2 mL soğuk öncesi FACS tamponu ile yıkayın. Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. 3 mL Transfer Pipeti'ni kullanmanın tüm supernatantsusate'lerini aspire edin.
- Adım 4.4'i yineleyin.
- Hücreleri soğuk öncesi FACS tamponunda 40 x 106/mL konsantrasyonuna yeniden depolar.
NOT: Sıralayıcının tıkanmasını önlemek için hücreleri 70 μm'lik bir süzgeçten geçirin. - 0,1 μg/mL DAPI ekleyin.
NOT: DAPI ölü hücreleri dışlamak için kullanılır. - Sıralanmış hücreleri toplamak için 4 mL Komple Orta (adım 2,5'te hazırlanmış) içeren 15 mL santrifüj tüpleri hazırlayın.
- Hücreleri sıralayıcıya yükleyin. CD4+ T hücrelerini (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ hücreleri) saflık modunda (Nozül boyutu: 70 μm) tek uygulanabilir naϊve sıralayın; Basınç: 70 PSI; Etkinlik oranı: 8000-12000 olay/lar; Verimlilik: %90'dan yüksek) (Şekil 2).
NOT: Naϊve CD4+ T hücreleri CD62L'nin yüksek ekspresyonunu ifade eder ve CD2513,14 aktivasyon işaretçisi eksikliği. - Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. 3 mL Transfer Pipeti kullanarak tüm süpernatantları aspire edin.
- Hücreleri 1x PBS'nin 500 μL'sinde yeniden biriktirin.
- 3.6 adımdan sonraki hücreleri sayma
NOT: Bu adımda bir donör fareden ~5 × 106 hücre elde edilebilir.
5. Alıcı farelere hücre transferi
- CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücrelerini 1x PBS ekleyerek 5 x 106/mL konsantrasyonuna yeniden kullanın.
- Rag-/- fareleri bir ısı lambası altında ısıtın (bkz. Malzeme Tablosu) 4 dakika boyunca ve fareleri bir fare kısıtlayıcı kullanarak kısıtlayın.
- Hücre süspansiyonunun 200 μL'lik kısmını 1 mL insülin şırıngını (27 G) kullanarak Rag/- farelerin kuyruk damarına intravenöz olarak aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Bir donör fareden alınan hücreler yaklaşık beş alıcı fareye aktarmak için yeterlidir.
6. Kolit ilerlemesi sırasında klinik belirtilerin izlenmesi
- Fareleri her hafta tartın ve fareler orijinal ağırlıkların% 5'ini kaybetmeye başladıktan sonra gözlemi haftada iki > artırın.
- Hafifçe uyarıldığında farelerin tepkisini /hareketini gözlemleyin.
- Diğer klinik anormallikleri gözlemleyin. yani duruş ve dışkı kıvamı.
7. Kolon koleksiyonu ve histopatolojik puanlama
- Alıcı fareleri, kilo kaybının bir zaman noktasında CO2 ile servikal çıkık > orijinal ağırlığın% 20'si veya 6 haftalık hücre sonrası transferi ile kurban edin. Fareleri% 70 etanol ile ıslatın.
- ~1 cm ventral orta hat cilt kesisi yapın, cildi karın kas dokusundan çekin, karın kas dokusunda ~ 3 cm'lik bir kesi yapın, cecum'ı tanımlayın ve tüm kolonu steril makas ve tostlarla çıkarın. Kolonu bir kültür çanağında soğuk öncesi PBS ile ıslatın.
- Kolonu uzunlamasına inzivaya ayırın ve soğuk öncesi PBS ile durulayın. Kolonun 1/3'ü uzunlamasına kesin.
- Kolon şeridini, parlak tarafı yukarı bakacak şekilde bir kağıt havluya yerleştirin. Kürdan kullanarak İsviçre haddeleme gerçekleştirin15.
- Kolon İsviçre'yi bir kasete yerleştirin ve kaseti 24 h16 için% 10 tamponlu formalin içine koyun, ardından otomatik bir işlemci (bkz. Malzeme Tablosu) ve parafin gömme kullanarak dehidrasyon.
- Slaytlara monte edilmiş bir mikrotom üzerinde 5 μm doku kesiti kesin ve Hematoksilin ve eozin (H&E) lekesini gerçekleştirin17 (bkz. Malzeme Tablosu).
- Altı parametrenin her birinin puanlarını en fazla 12 için birleştirerek histopatolojik puanları belirleyin. Lamina propria iltihabı (normal, 0; hafif, 1; orta, 2; şiddetli, 3); kadeh hücre kaybı (normal, 0; hafif, 1; orta, 2; şiddetli, 3); anormal mahzen (normal, 0; hiperplastik, 1; düzensizlik, 2; mahzen kaybı, 3); şifreli apseler (yoktur, 0; mevcut, 1); mukozal erozyon ve ülserasyon (normal, 0; hafif, 1; orta, 2; şiddetli, 3); ve submukozal değişim (yok, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Bağırsak lamina propria hücrelerinin izolasyonu ve lekelenmesi
- 7.3. adımdan sonra, kolonun 2/3'ü daha 0,5-1 cm parçalar halinde kesin ve soğuk öncesi PBS ile yıkayın.
- Kolon parçalarını 50 mL santrifüj tüpünde önceden ısıtılmış 20 mL EDTA-PBS tamponuna aktarın. 37 °C'de 250 rpm sallanarak 30 dakika boyunca kuluçkaya yaslanın.
- Tüpü girdap, steril bir elekten geçirerek süpernatantları atın (çap: 0.01 inç) ve kolon segmentlerini 50 mL'lik tüpte 20 mL'lik soğuk öncesi PBS'de yeniden depolar.
- 8.3 adımlarını iki kez yineleyin.
- Kolon parçalarını önceden ısıtılmış 10 mL Sindirim Tamponu içeren bir C tüpüne yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tüpü bir Dissociator makinesine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve 25 dakika boyunca "37C_m_LPDK_1" programı altında kuluçkaya yatırın.
NOT: "37C_m_LPDK_1", Dissociator makinesinde numuneleri karıştırmak ve 37 °C'de tutmak için kullanılan standart bir ön ayar programıdır. - Dokunun tamamen sindirilip sindirilmediğini kontrol edin, bu da Sindirim tamponunda hiçbir doku parçasının bulunmadığı anlamına gelir. Değilse, "37C_m_LPDK_1" programını tekrarlayın.
- Metal bir elek ve 100 μL süzgeçten geçerek süpernatant toplayın. 10 mL soğuk öncesi PBS ile durulayın.
- Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. Tüm süpernatantları aspire edin.
- Hücreleri % 40 Percoll Çözeltisinin 4 mL'sinde yeniden kullanın ve iyice karıştırın (adım 2.8'de hazırlanmıştır).
- Yeniden 15 mL santrifüj tüpünde yeniden 2 mL%75 Percoll çözeltisine aktarın.
- Hücre süspansiyonu 850 x g'da 20 °C'de 20 dakika santrifüj (Hızlanma rampası: 0; Fren rampası: 0).
- 3 mL Transfer Pipet kullanarak üst katmandaki yağı dikkatlice çıkarın ve hücre tabakasını 50 mL'lik bir tüpte 20 mL Yıkama Tamponu'na aktarın.
- Hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. Tüm süpernatantları atın ve 1 mL Tamamlanmış Ortam'da hücreleri yeniden depola.
- 3.6. adımı izleyen hücreleri sayın.
- Hücreleri 24 kuyulu bir plakada tohumlayın, 50 ng/mL Phorbol-12-myristate 13-asetat ve 750 ng/mL iyonomisinin 2 saat boyunca aktif hale getirilir, ardından 3 saat boyunca 5 μg/mL Brefeldin A ile inkübasyon (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Kullanılan reaktifler toksiktir ve kullanımlarının önlemlere ve güvenlik önlemlerine ihtiyacı vardır. - Hücreleri bir FACS tüpüne aktarın, 2 mL FACS Tampon ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın.
- Fc reseptörlerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca engellemek için 12,5 μg/mL fare önleyici CD16/3219 ile hücreleri (bkz. Malzeme Tablosu) FACS tamponunda kuluçkaya yatırın.
- Canlı/ölü ve yüzey işaretleyici için leke.
- Hücreleri 2 mL FACS Tampon ile yıkayın ve 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj edin. Üstnatant atın.
- Hücreleri canlı boya ve yüzey işaretleyicileri (yani fare önleyici CD3 ve fare önleyici CD4 antikorları)20 (bkz. Malzeme Tablosu) FACS Tamponunda karanlıkta 4 °C'de 30 dakika boyunca optimize edilmiş konsantrasyonda lekeleyin.
NOT: Kullanılan reaktifler toksiktir ve kullanımlarının önlemlere ve güvenlik önlemlerine ihtiyacı vardır.
- Hücresel ve nükleer lekelenmeyi gerçekleştirin.
- 2 mL FACS Tampon ekleyin ve hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın.
- 200 μL Transkripsiyon Faktörü Düzeltme çalışma çözümü (bkz. Malzeme Tablosu) ile hücreleri oda sıcaklığında 40 dakika boyunca yeniden boyutlandırarak hücrelerin dengesini bozun ve sabitlayın.
- 2 mL Perm tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın.
- Hücreleri hücresel ve nükleer işaretleyicilerle (örneğin, fare karşıtı IFNφ, fare karşıtı IL-17A ve fare karşıtı Foxp3 antikorları)20 perm tamponunda (bkz. Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında 30 dakika-1 saat kuluçkaya yatırın.
- 2 mL Perm tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın.
- 1 mL FACS Tampon ekleyin ve hücre süspansiyonu 4 °C'de 8 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın.
- Hücreleri 200 μL FACS Tamponu ile yeniden biriktirin ve numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dalak başına yaklaşık 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücreleri yetişkin bir CBir1 TCR Tg fareden izole edildi. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücrelerinin transferi, alıcı Rag1/- farelerde kronik kolit indüklendi. Hücre transferlerinden sonra, kilo kaybı, dışkı kıvamı ve kambur duruş da dahil olmak üzere bağırsak iltihabının ilerlemesini değerlendirmek için klinik belirtiler izlendi. Beklendiği gibi, fareler hücre transferi sonrası yaklaşık üç hafta kilo vermeye başladı ve kilo hücre transferden altı hafta sonra orijinal ağırlığın yaklaşık% 80-85'ine ulaştı (Şekil 3). Ek olarak, fareler hücre transferi sonrası yaklaşık 3-4 hafta ishal gösterdi ve şiddetli kolit geliştiklerinde kambur duruş gösterdi. Kolonun brüt morfolojisi gösterildi ve kolit şiddeti fareler kurban edildiğinde histopatolojik skorla değerlendirildi. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücreleri alan fareler hücre transfer sonrası 6 hafta kısa kolon uzunluğu gösterdi (Şekil 4A). Alıcı fareler bağırsak lamina propriasında daha fazla hücre infiltrasyonunu göstermiştir 4 hafta hücre transferi sonrası (Şekil 4C), goblet hücre kaybı ve bağırsak epitel hücre hiperplazisi 5 hafta hücre transferi sonrası (Şekil 4D) ve kolonun submucosasında mukozal erozyon ve inflamatuar hücre infiltrasyon 6 hafta hücre transferi sonrası (Şekil 4F). Aynı zamanda, sadece PBS alan Rag1-/- farelerde iltihap yoktu (Şekil 4B). Ayrıca, ince bağırsakta iltihap yoktur, ancak cecum iltihaplanır. Ayrıca kolonik lamina propriasında CD4+ T hücre fenotipleri akış sitometrisi ile belirlendi. Gating stratejisi gösterilmiştir (Şekil 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T hücreleri IFNφ+ Th1 hücreleri, IL-17A+ Th17 hücreleri, IFNφ+ IL-17+ CD4+ T hücreleri (Şekil 5F) ve Rag1/- alıcılarının bağırsak lamina propriasında Foxp3+ Treg hücreleri (Şekil 5G) olarak geliştirilmiştir.
Şekil 1: İndüksiyon kolit prosedürü ve hastalık şiddetinin değerlendirilmesi. Splenik CD4+ T hücreleri manyetik boncuklar kullanılarak CBir1 TCR transgenik farelerden izole edildi ve daha sonra naϊve T hücreleri sıralanarak saflaştırıldı. CBir1 TCR transgenik naϊve T hücreleri daha sonra intravenöz olarak alıcı Rag1-/- farelere aktarıldı. Fareler hücre transferinin ardından yaklaşık altı hafta kurban edildiğinde kolit şiddeti histopatolojik skorlar ile değerlendirildi. Kolonik lamina propriasındaki CD4+ T hücre fenotipleri akış sitometrisi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CBir1 TCR transgenik naϊve T hücrelerini sıralamak için gating stratejisi. Uygulanabilir tek CBir1 TCR transgenik naϊve T hücreleri, döküntüler (A), tek olmayan hücreler (B-C), ölü hücreler (D) ve aktif hücreler (E-F) hariç tutularak saflaştırılmıştır. Alt nüfus (G) olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Rag1-/- farelerin ağırlık değişiklikleri T hücre transferi sonrası. 1 x 106 CBir1 TCR transgenik naϊve T hücreleri Rag1-/- farelere aktarıldı ve KONTROL OLARAK RAG1-/- fareler kullanıldı. Fare ağırlıkları her hafta kaydedildi. Veriler SD'± ortalama olarak sunuldu; Öğrencinin t-testi; s<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Rag1-/- CBir1 TCR transgenik naϊve T hücrelerinden kolonun brüt morfolojisi ve Hematoksilin ve eozin lekelenmesi. (A) Alıcı fareler hücre transferinden altı hafta sonra kurban edildi ve kolonun brüt morfolojisi gösterildi. (B-E) Alıcı fareler farklı zaman noktalarında kurban edildi ve Rag1-/- fareler kontrol olarak PBS aldı. Kolonlar Hematoksilin ve eozin lekesi için işlendi. Hematoksilin ve kolonun eozin lekelemesinin temsili görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (F) Histopatolojik skorlar belirlendi. Veriler SD ± olarak sunuldu .
Şekil 5: CBir1 TCR transgenik naϊve T hücreleri alan Rag-/- farelerin kolonik lamina propriasındaKI CD4+ T hücre fenotipleri. Alıcı fareler hücre transferinin ardından 6 hafta kurban edildiğinde, kolonik lamina propria hücreleri CD4 + T hücre fenotiplerinin boyanmaları için izole edildi. (A-E) T hücre fenotiplerinin analizi için gating stratejisi. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T hücreleri, IFNφ+ CD4+ T hücreleri, IL-17+ IFNφ+ CD4+ T hücreleri ve (G) Foxp3+ Tregs akış sitometrisi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kolit modelinin tekrarlanabilirliği için her adım şart olsa da, birkaç kritik adım vardır. Alıcı Rag-/- fareler bağırsak iltihabını teşvik etmek için CD4 + T hücreleri naϊve yeterli uygulanabilir almalıdır. MLN'ler yerine naif CD4+ T hücrelerinin izolasyonu için dalak kullandık. Çünkü MLN'lerde naif CD4+ T hücrelerinin verimi dalaklara göre çok daha düşüktür. CD62L naif T hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir ve CD44 ve CD25 T hücrelerinin aktivasyon belirteçleridir13,14. Bu çalışmada ilk olarak CD4+ T hücrelerini dalaklardan izole etmek için anti-CD4 manyetik boncuklar kullandık. Daha sonra naif CD4+ T hücrelerinin izolasyonu için anti-CD4, anti-CD62L ve anti-CD25 antikorlarının kombinasyonunu kullandık13,14. Araştırmacılar naif CD4 + T hücrelerini sıralamak için başka belirteçler kullanabilirler. CD45RBhi aynı zamanda naif T hücrelerinin işaretleyicisidir. CD45RBhi CD25- CD4+ T hücreleri genellikle TCR transgenik olmayan vahşi tip T hücrelerinin naif T hücreleri olarak kullanılır23. Bu nedenle, hücreleri sıralama ve T hücrelerinin alıcı farelere intravenöz olarak enjeksiyon teknikleri esastır. Gating protokolünü şablon olarak ayarlamak, denemeleri daha az hatayla hızlandırmak için yararlıdır. Hücre ölümünü önlemek için hücreler her zaman buzda tutulmalıdır. Ayrıca, DAPI ile hücreleri boyamak ölü hücreleri hariç tutmanız için şiddetle tavsiye edilir, çünkü DAPI sağlam hücre zarları arasında geçiş yapamaz, bu da onu mükemmel bir ölü hücre probu24 haline getirir. Kuyruk damarlarının genişlemesini uyarmak için farelerin ısıtılması, intravenöz enjeksiyon için daha iyi damar görünürlüğü sağlar. Tüm prosedürlerin eğitimli araştırmacılar tarafından yapılması önerilir.
Birçok faktör, dikkat edilmesi gereken kolit modellerinin sonucunu etkileyebilir. İlk olarak, alıcı Rag1-/- fareler yaş ve cinsiyetle eşleşmelidir. CD45RBhi T hücre transferi modelinde, erkek ve kadın donörlerden alınan T hücreleri erkek Paçavra/alıcılara aktarılabilirken, kadın alıcılar kullanılırken sadece kadın donörler kullanılabilir23. Ancak, erkek ve kadın alıcılar arasında önemli bir fark görmüyoruz. Alıcı fareler dişi veya erkek olabilir ve erkek donörlerden gelen T hücreleri de kadın alıcılarda kolit indükleyebilir. Kilo değişimi kolit ilerlemesinin değerli bir göstergesi olduğundan, alıcı farelerin kararlı bir ağırlık çizgisi sunmak için 8-12 hafta arasında kullanılması önerilir. Bu alıcı fareler yetiştirilmeli ve hayvan tesisinin aynı odasında tutulmalıdır, çünkü mikrobiyota kolit gelişimini düzenlemede kritik öneme sahiptir25. Kolit geliştirme süresi, farklı sayıda CBir1 TCR Tg naif CD4 T hücresi aktarırken değişir. Beklendiği gibi, daha az hücre kolit indüksiyonu için daha uzun bir süre gerektirir ve daha yüksek sayıda hücre kolitin indüksiyonu için daha kısa bir süre gerektirir. Alıcı fare başına 1 x 106 hücre kullanılması önerilir, çünkü alıcı fareler kolit klinik belirtileri gösterir ~ 2-3 hafta hücre transferi sonrası ve nispeten şiddetli kolit geliştirmek ~6 hafta hücre transferi sonrası. Ek olarak, intraperitoneal enjeksiyon ile karşılaştırıldığında, hücrelerin kuyruk damarına intravenöz enjeksiyonu daha tutarlı kolitlere neden olur. Kolonik lamina propria hücrelerinin izolasyonu için kolon dokuları kurumamalıdır; aksi takdirde, hücrelerin verimini ve canlılığını azaltır. Özellikle endişelerden biri, alıcı farelerin genetik olarak değiştirilmiş CBir1 TCR Tg T hücreleriyle transfer edilmesi veya ilaçlarla tedavi edilmesi durumunda kolitin süresinin değiştirileceğidir26. Ek olarak, CBir1 TCR Tg T hücreleri, T hücrelerinde olmayan TCRβ / δ - - fareler gibi diğer bağışıklık eksikliği olan farelerde bağırsak iltihabına neden olur27.
Birikmiş kanıtlar, IBD patogenezinde bağırsak bakteriyel antijene özgü reaktif T hücrelerinin önemli bir rolünü gösterdiğinden, tanımlanmış bir bağırsak bakteriyel antijenine özgü T hücrelerinin kullanılması, bağırsak bakteriyel antijenin kolit indükleyen T hücre yanıtlarını nasıl indüklediğine dair içgörüler sağlayacaktır. Bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin, IBD8,9 patogenez ile ilgili gastrointestinal sistemde bol miktarda bulunur. Bu kolit modeli, ishal, kilo kaybı, histopatolojik bulgu ve anormal bağırsak immün yanıtları da dahil olmak üzere IBD'nin çeşitli kritik özelliklerine benzer. Bu nedenle, bu kolit modeli insan IBD mekanizmalarını incelemek için yararlıdır ve IBD tedavilerini değerlendirmek için bir araç sağlar. İlginçtir ki, Chiaranunt ve ark.'ın son çalışmaları, mikrobiyota CBir 1 antijenine T hücre özgüllüğünün tek başına T hücre aktivasyonunu ve koliti teşvik etmek için yeterli olmayabileceğini gösterdi. Bu, Rag-/- alıcılarda vahşi tip CBir1 TCR T hücreleri indüklenmiş kolit ile kanıtlanırken, Rag-/- CBir1 T hücreleri hayvan tesislerinde kolit indüklemedi, bu da belirli bağırsak bakteriyel antijenlere yanıt veren bağırsak T hücrelerinin, örneğin Helicobacter spp gibi diğer ilişkili kommensal bakterilerin bir adjuvan olarak işlev görebileceğini düşündürmektedir28 . Bu modelin heyecan verici bir yönü, farklı T hücre alt kümelerinin, yani Th1, Th17 ve Treg hücrelerinin, kolit29 patogenezinde sadece efektör T hücrelerinin değil, aynı zamanda Treglerin rollerini araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlayan kolitik alıcı farelerin lamina propriasında bulunmasıdır29.
Bununla birlikte, bu kolit modeli bağırsak mikrobiyotasına özgü T hücreleri tarafından aracılık ettiği için, bu kolit modeli için bir sınırlama, kolitin indüksiyon süresinin bağırsak mikrobiyotasına bağlı olarak farklı hayvan tesislerinde değişebileceğidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir yazarın çakışan finansal, profesyonel veya kişisel çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından DK125011, AI150210 ve DK124132, Texas Üniversitesi Sistem STARs ödülü (Y.C.) ve Galveston Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nden James W. McLaughlin Burs Fonu (W.Y.) tarafından desteklendi. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
