Summary
Dans ce protocole, un modèle de colite adoptive de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. Les lymphocytes T CD4+ sont isolés à partir de souris transgéniques TCR CBir1. Ceux-ci sont spécifiques pour un antigène immunodominant du microbiote intestinal CBir1 flagellin, qui est transféré dans les souris Rag1-/- receveuses, entraînant une inflammation intestinale.
Abstract
Avec l’augmentation de l’incidence, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), qui sont des maladies chroniques affectant le tractus gastro-intestinal, imposent un fardeau sanitaire et financier considérable aux individus et à la société. Par conséquent, il est essentiel d’étudier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse et au développement des MII. Ici, un modèle de colite de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. La flagelline CBir1 a été reconnue comme l’antigène bactérien intestinal immunodominant dans la colite expérimentale et les patients atteints de la maladie de Crohn. Les lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR, spécifiques à la flagelline CBir1, peuvent induire une colite chronique après transfert adoptif chez des souris Rag1-/- immunodéficientes . La gravité de la maladie est évaluée par histopathologie. Les phénotypes des lymphocytes T CD4+ dans la lamina propria du côlon sont également déterminés. Ce modèle ressemble beaucoup au développement de la MII, qui fournit un modèle murin idéal pour étudier les mécanismes à l’origine de la pathogenèse des MII et tester les médicaments potentiels pour traiter les MII.
Introduction
Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris principalement la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU), sont caractérisées par une inflammation chronique récurrente-rémittente du tractus gastro-intestinal, qui touche des millions de personnes dans le monde1. Plusieurs facteurs ont été impliqués dans le développement et la pathogenèse des MII, notamment la susceptibilité génétique, le microbiote intestinal, les réponses immunitaires, l’alimentation et le mode de vie2. Cependant, le mécanisme exact de la MII n’est pas encore complètement compris.
L’un des intérêts particuliers est l’interaction entre le microbiote intestinal et les réponses immunitaires de l’hôte dans la régulation de l’inflammation intestinale3. Le microbiote intestinal fournit une série de molécules immunostimulantes et d’antigènes, qui peuvent activer les réponses immunitaires4. Alors que l’équilibre entre les lymphocytes T effecteurs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) est essentiel au maintien de l’homéostasie intestinale, la réponse excessive des lymphocytes T CD4+ de la muqueuse intestinale aux antigènes du microbiote intestinal contribue à l’inflammation intestinale5,6,7. En tant qu’antigène immunodominant du microbiote intestinal, la flagelline CBir1 a été liée à la pathogenèse de CD8,9 chez l’homme. De plus, le transfert de lymphocytes T transgéniques (Tg) CBir1 TCR induit une inflammation intestinale chez les souris immunodéficientes6, ressemblant étroitement à la MII humaine, ce qui indique que ce modèle de transfert de lymphocytes T aide à étudier les mécanismes de la MII humaine.
Ce travail décrit le protocole détaillé d’induction de la colite chez les souris Rag1-/- par transfert adoptif des lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ et l’évaluation de la gravité de la maladie. En outre, les résultats attendus sont montrés, et les étapes critiques de la procédure et du dépannage sont discutées, ce qui aidera les chercheurs à étudier les mécanismes de pathogenèse de l’inflammation intestinale et à tester les médicaments potentiels pour traiter les MII.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été effectuées selon le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas. Les souris CBir1 TCR Tg ont été fournies par le Dr Charles Elson de l’Université de l’Alabama à Birmingham. Les souris CBir1 TCR Tg peuvent être femelles ou mâles, mais devraient être à 8-12 semaines. Des souris Rag1-/- sur le fond C57BL/6 ont été obtenues au Jackson Laboratory10. Les souris Rag1-/- doivent être assorties au sexe et à l’âge, et le mâle ou la femelle peut être utilisé mais devrait être à 8-12 semaines. L’ensemble du protocole est résumé à la figure 1.
1. Préparation des souris receveuses
- Préparez des souris Rag1-/- sur le fond C57BL/6, élevées dans la même installation spécifique exempte d’agents pathogènes. Calculez le nombre de souris par groupe par analyse de puissance11.
REMARQUE: Les souris Rag1-/- n’ont pas de cellules T matures et de cellules B10. - Marquez les souris par un coup de poing à l’oreille.
- Peser les souris le jour même du transfert de lymphocytes T.
2. Préparation des réactifs et des solutions
REMARQUE: Les réactifs utilisés sont toxiques ou à risque biologique et leur manipulation nécessite des précautions et des mesures de sécurité.
- Préparer le tampon de lavage: ajouter 5 mL de 100x pénicilline-streptomycine dans 500 mL de milieu RPMI 1640. Mélangez-le bien et conservez-le à 4 °C.
- Préparez le tampon de lyse Tris-NH4Cl.
- Préparer la solution Partie A. Dissoudre 2,06 g de base de Tris dans 100 mL d’eau double distillée (ddH2O) et ajuster la valeur du pH à 7,2 avec HCl.
- Préparer la solution Partie B. Dissoudre 7,47 g de NH4Cl dans 800 mL de ddH2O.
- Mélangez bien A et B. Mesurez le pH et ajustez-le à 7,2 sinon.
- Réglez le volume total à 1000 mL. Autoclavez puis conservez-le à 4 °C.
- Préparez le tampon d’isolement.
- Ajouter 2,5 g de BSA et 500 μL d’EDTA (0,5 M, pH 8,0) dans 500 mL de 1x PBS. Mélangez bien.
- Filtrer la solution à l’aide d’un filtre jetable de 0,22 μm à couvercle de bouteille sous vide (voir tableau des matériaux). Conservez-le à 4 °C.
- Préparez le tampon FACS. Ajouter 1 mL de FBS et 50 μL d’EDTA (0,5 M, pH 8,0) dans 50 mL de tampon de lavage (préparé à l’étape 2.1). Bien mélanger et conserver à 4 °C.
- Préparez le support complet. Ajouter 5 mL de FBS dans 45 mL de tampon de lavage. Bien mélanger et conserver à 4 °C.
- Préparez la mémoire tampon EDTA-PBS.
- Calculez le volume du tampon EDTA-PBS nécessaire. Volume (mL) = nombre de souris x 20.
- Ajouter le volume approprié de FBS, EDTA et HEPES dans le PBS (2 % de FBS, 0,5 mM d’EDTA, 10 mM de HEPES dans PBS) (voir tableau des matériaux).
- Mélangez-le bien et préchauffez-le au bain-marie à 37 °C.
- Préparez le tampon de digestion.
- Calculez le volume du tampon de digestion nécessaire. Volume (mL) = nombre de souris x 10.
- Ajouter le volume approprié de FBS, de collagénase IV et de DNase I dans le tampon de lavage (2 % du FBS, 0,5 mg/mL de collagénase IV et 10 U/mL de DNase I dans le tampon de lavage) (voir tableau des matériaux).
- Mélangez-le bien et préchauffez-le au bain-marie à 37 °C.
- Préparez la solution Percoll.
- Préparez 100% Percoll. Ajouter 5 mL de PBS 10x dans 45 mL de Percoll d’origine (voir Tableau des matériaux).
- Préparez 2% de FBS dans le tampon de lavage. Ajouter 1 mL de FBS dans 49 mL de tampon de lavage.
- Caulculer le volume de 40 % de solution de percoll et de 75 % de solution de percoll. Volume de 40% de solution Percoll (mL) = nombre de souris x 4; Volume de 75 % de solution Percoll (mL) = nombre de souris x 2.
REMARQUE : Les réactifs/solutions préparés aux étapes 2.1 à 2.5 seront utilisés aux étapes 3 à 4, et ceux préparés aux étapes 2.6 à 2.8 seront utilisés à l’étape 9. Tous les réactifs/solutions utilisés à l’étape 9 doivent être fraîchement préparés. Il est recommandé de faire 5 % de tampon supplémentaire pour toutes les étapes.
3. Isolement des lymphocytes T SPléniques CBir1 TCR Tg CD4+
- Euthanasier CBir1 TCR Tg souris/souris par luxation cervicale avec euthanasie au CO2 (taux de déplacement gaz-air de 30% à 70%). Mouiller les souris avec 70% d’éthanol.
- Effectuez une incision de l’abdomen gauche d’environ 1 cm, éloignez la peau du tissu musculaire abdominal, faites une incision d’environ 3 cm dans le tissu musculaire abdominal et retirez la rate avec des ciseaux et des pinces stériles. Placer la rate dans une boîte de culture contenant 5 mL de tampon de lavage pré-froid (préparé à l’étape 2.1).
- Broyer la rate avec la surface rugueuse de deux lames de verre stériles. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 50 mL en passant à travers une passoire à cellules de 100 μm (voir tableau des matériaux). Rincez les lames de verre et le plat de culture avec 5 mL de tampon de lavage pré-froid et transférez le tampon de lavage dans le tube.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de tampon de lyse Tris-NH4Cl préchauffé (préparé à l’étape 2.2) par rate. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Ajouter 10 mL de tampon de lavage pré-froid au tube.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement pré-froid (préparé à l’étape 2.3).
- Comptez les cellules. Bien mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu trypan. Chargez 10 μL du mélange sur une lame, insérez la lame dans le compteur de cellules automatisé (voir Tableau des matériaux) et obtenez le numéro de cellule viable12.
REMARQUE: Environ 1 x 108 cellules peuvent être obtenues à partir d’une souris donneuse dans cette étape. - Centrifuger la suspension de cellule restante de l’étape 3.6 à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez tous les surnageants.
- Vortexez soigneusement les particules magnétiques CD4 anti-souris (voir Tableau des matériaux), ajoutez directement 50 μL de particules par 107 cellules et mélangez soigneusement avec des pastilles de cellules. Incuber pendant 30 min à 4 °C.
REMARQUE: Tout autre kit commercial d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ peut être utilisé ici. - Transférer la suspension cellule-particule dans un tube de collecte stérile. Ajouter 3,5 mL de tampon d’isolation pré-froid dans le tube.
- Placez le tube sur l’aimant de séparation cellulaire (voir Tableau des matériaux) pendant 8 minutes à température ambiante. Aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL.
- Retirez le tube de l’aimant de séparation cellulaire (voir Tableau des matériaux), remettez en suspension les cellules avec un tampon d’isolation préreflet de 3,5 mL et placez le tube sur l’aimant pendant 4 minutes à température ambiante. Aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL.
- Répétez l’étape 3.11.
- Remettre en suspension les cellules avec 1 mL de tampon FACS pré-froid (préparé à l’étape 2.4).
4. Purification des lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+
- Comptez les cellules à la suite de l’étape 3.6.
- Si la concentration cellulaire est de >107/mL, ajoutez un volume de tampon FACS pour vous assurer que la concentration cellulaire est ≤ 107/mL.
REMARQUE: ~ 1 × 107 cellules peuvent être obtenues à partir d’une souris donneuse dans cette étape. - Colorez les marqueurs de surface avec 10 μL de CD4-APC anti-souris, 10 μL de CD25-Percp/Cy5.5 anti-souris et 10 μL de CD62L-PE13,14 anti-souris (voir tableau des matériaux). Mélanger doucement et incuber pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Lavez les cellules avec 2 mL de tampon FACS pré-froid. Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirer tous les surnageants à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL.
- Répétez l’étape 4.4.
- Remettre les cellules en suspension à la concentration de 40 x 106/mL dans un tampon FACS pré-froid.
REMARQUE: Pour éviter que le trieur ne se bouche, passez les cellules à travers une passoire de 70 μm. - Ajouter 0,1 μg/mL de DAPI.
REMARQUE: DAPI est utilisé pour exclure les cellules mortes. - Préparer des tubes centrifuges de 15 mL contenant 4 mL de milieu complet (préparés à l’étape 2.5) pour la collecte des cellules triées.
- Chargez les cellules sur le trieur. Trier les lymphocytes T naϊve CD4+ viables (cellules DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ) en mode pureté (taille de la buse: 70 μm; Pression: 70 PSI; Taux d’événements: 8000-12000 événements / s; Efficacité : supérieure à 90 %) (figure 2).
REMARQUE: Les lymphocytes T Naϊve CD4+ expriment une expression élevée de CD62L et n’ont pas le marqueur d’activation CD2513,14. - Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirer tous les surnageants à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL.
- Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de 1x PBS.
- Compter les cellules après l’étape 3.6
REMARQUE: ~ 5 × 106 cellules peuvent être obtenues à partir d’une souris donneuse dans cette étape.
5. Transfert cellulaire dans les souris receveuses
- Resuspendez les lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ à la concentration de 5 x 106/mL en ajoutant 1x PBS.
- Réchauffez les souris Rag-/- sous une lampe chauffante (voir Tableau des matériaux) pendant 4 min et retenez les souris à l’aide d’un dispositif de retenue pour souris.
- Transférer par voie intraveineuse 200 μL de la suspension cellulaire dans la veine caudale de souris Rag-/- à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL (27 G) (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Les cellules d’une souris donneuse sont suffisantes pour être transférées à environ cinq souris receveuses.
6. Surveillance des signes cliniques pendant la progression de la colite
- Pesez les souris chaque semaine et augmentez l’observation à deux fois par semaine une fois que les souris commencent à perdre >5% du poids d’origine.
- Observez la réponse / le mouvement des souris lorsqu’elles sont doucement stimulées.
- Observez d’autres anomalies cliniques. c.-à-d. la posture et la consistance des selles.
7. Collecte du côlon et notation histopathologique
- Sacrifier les souris receveuses par une luxation cervicale avec du CO2 à un moment de la perte de poids >20% du poids initial ou 6 semaines après le transfert cellulaire. Mouiller les souris avec 70% d’éthanol.
- Effectuez une incision cutanée médiane ventrale d’environ 1 cm, éloignez la peau du tissu musculaire abdominal, faites une incision d’environ 3 cm dans le tissu musculaire abdominal, identifiez le caecum et retirez tout le côlon avec des ciseaux et des pinces stériles. Mouiller le côlon avec du PBS pré-froid dans un plat de culture.
- Inciser le côlon dans le sens de la longueur et le rincer avec du PBS pré-froid. Couper 1/3 du côlon longitudinalement.
- Placez la bande de côlon dans une serviette en papier avec le côté luminal tourné vers le haut. Effectuez un laminage suisse à l’aide d’un cure-dent15.
- Placez le colon Swiss dans une cassette et mettez la cassette dans du formol tamponné à 10% pendant 24 h16, suivi d’une déshydratation à l’aide d’un processeur automatisé (voir Tableau des matériaux) et d’un enrobage de paraffine.
- Coupez des coupes de tissu de 5 μm sur un microtome, montées sur des lames, et effectuez la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H &E)17 (voir tableau des matériaux).
- Déterminez les scores histopathologiques en combinant les scores pour chacun des six paramètres pour un maximum de 12. Inflammation de la lamina propria (normale, 0; légère, 1; modérée, 2; sévère, 3); perte de cellules de gobelet (normale, 0; légère, 1; modérée, 2; sévère, 3); crypte anormale (normale, 0; hyperplasique, 1; désorganisation, 2; perte de crypte, 3); abcès de crypte (absent, 0; présent, 1); érosion muqueuse et ulcération (normale, 0; légère, 1; modérée, 2; sévère, 3); et changement sous-muqueux (aucun, 0; sous-muqueuse, 1; transmural, 2)18.
8. Isolement et coloration des cellules de lamina propria intestinale
- Après l’étape 7.3, coupez un autre 2/3 du côlon en morceaux de 0,5 à 1 cm et lavez-le avec du PBS pré-froid.
- Transférer les segments du côlon dans un tampon EDTA-PBS préchauffé de 20 mL dans un tube centrifuge de 50 mL. Incuber à 37 °C en agitant à 250 tr/min pendant 30 min.
- Vortex le tube, jeter les surnageants en le faisant passer à travers un tamis stérile (diamètre: 0,01 pouce), et remettre en suspension les segments du côlon dans 20 mL de PBS pré-froid dans le tube de 50 mL.
- Répétez l’étape 8.3 deux fois.
- Placez les segments du côlon dans un tube C (voir tableau des matériaux) contenant 10 mL de tampon de digestion préchauffé.
- Placez le tube sur une machine Dissociator (voir Tableau des matériaux) et incubez sous le programme de « 37C_m_LPDK_1 » pendant 25 min.
REMARQUE: « 37C_m_LPDK_1 » est un programme de préréglage standard dans la machine Dissociator utilisée pour remuer les échantillons et les maintenir à 37 ° C. - Vérifiez si le tissu est digéré complètement, ce qui signifie qu’aucun morceau de tissu ne se trouve dans le tampon de digestion. Sinon, répétez le programme de « 37C_m_LPDK_1 ».
- Recueillir le surnageant en passant à travers un tamis métallique et une passoire de 100 μL. Rincer avec 10 mL de PBS pré-froid.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirez tous les surnageants.
- Remettre les cellules en suspension dans 4 mL de solution Percoll à 40 % et bien mélanger (préparé à l’étape 2.8).
- Transférer les cellules remises en suspension à 2 mL de solution Percoll à 75 % dans un tube centrifuge de 15 mL.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 850 x g pendant 20 min à 20 °C (Rampe d’accélération: 0; Rampe de freinage: 0).
- Retirez soigneusement la graisse sur la couche supérieure à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL et transférez la couche cellulaire à 20 mL de tampon de lavage dans un tube de 50 mL.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jeter tous les surnageants et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu fini.
- Comptez les cellules à la suite de l’étape 3.6.
- Ensemencez les cellules dans une plaque de 24 puits, activez-les avec 50 ng/mL de Phorbol-12-myristate 13-acétate et 750 ng/mL d’ionomycine pendant 2 h, suivie d’une incubation avec 5 μg/mL de Brefeldin A pendant 3 h (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Les réactifs utilisés sont toxiques et leur manipulation nécessite des précautions et des mesures de sécurité. - Transférer les cellules dans un tube FACS, ajouter 2 mL de tampon FACS et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Incuber les cellules avec 12,5 μg/mL de CD16/3219 anti-souris dans un tampon FACS (voir Tableau des matériaux) pour bloquer les récepteurs Fc pendant 5 min à température ambiante.
- Tache pour marqueur vivant/mort et de surface.
- Lavez les cellules avec 2 mL de tampon FACS et centrifugez-les à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Colorez les cellules avec un colorant vivant et des marqueurs de surface (c.-à-d. anticorps CD3 anti-souris et anti-souris CD4)20 (voir tableau des matériaux) dans le tampon FACS à la concentration optimisée pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
REMARQUE: Les réactifs utilisés sont toxiques et leur manipulation nécessite des précautions et des mesures de sécurité.
- Effectuer la coloration cellulaire et nucléaire.
- Ajouter 2 mL de tampon FACS et centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Perméabiliser et fixer les cellules en réutilisant les cellules avec 200 μL de solution de travail Transcription Factor Fix (voir Tableau des matériaux) pendant 40 min à température ambiante.
- Ajouter 2 mL de tampon permanent et centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Incuber les cellules avec des marqueurs cellulaires et nucléaires (c.-à-d. des anticorps anti-souris IFNγ, anti-souris IL-17A et anti-souris Foxp3)20 dans un tampon de Perm (voir tableau des matériaux) pendant 30 min-1 h à température ambiante.
- Ajouter 2 mL de tampon permanent et centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension des cellules avec 200 μL de tampon FACS et exécuter les échantillons sur un cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux).
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Representative Results
Environ 5 x 106 lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ par rate ont été isolés chez une souris adulte CBir1 TCR Tg. Le transfert de lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ a induit une colite chronique chez des souris Rag1-/- receveuses. Après le transfert cellulaire, les signes cliniques ont été surveillés pour évaluer la progression de l’inflammation intestinale, y compris la perte de poids, la consistance des selles et la posture voûtée. Comme prévu, les souris ont commencé à perdre du poids environ trois semaines après le transfert cellulaire, et le poids a atteint environ 80% à 85% du poids initial six semaines après le transfert cellulaire (Figure 3). De plus, les souris ont montré de la diarrhée environ 3 à 4 semaines après le transfert cellulaire et ont démontré une posture voûtée lorsqu’elles ont développé une colite sévère. La morphologie grossière du côlon a été montrée, et la gravité de la colite a été évaluée par le score histopathologique lorsque des souris ont été sacrifiées. Les souris recevant des lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ ont montré une courte durée du côlon 6 semaines après le transfert cellulaire (Figure 4A). Les souris receveuses ont démontré plus d’infiltration cellulaire dans la lamina propria intestinale 4 semaines après le transfert cellulaire (Figure 4C), la perte de cellules gobelet et l’hyperplasie des cellules épithéliales intestinales 5 semaines après le transfert cellulaire (Figure 4D), et l’érosion muqueuse et l’infiltration cellulaire inflammatoire dans la sous-muqueuse du côlon 6 semaines après le transfert cellulaire (Figure 4F). Dans le même temps, il n’y avait pas d’inflammation chez les souris Rag1-/- recevant le PBS seul (Figure 4B). En outre, il n’y a pas d’inflammation dans l’intestin grêle, mais le caecum a une inflammation. De plus, les phénotypes des lymphocytes T CD4+ dans la lamina propria du côlon ont été déterminés par cytométrie en flux. La stratégie de contrôle est illustrée (figure 5A-E). Les lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ se sont développés en cellules IFNγ+ Th1, cellules IL-17A+ Th17, lymphocytes T IFNγ+ IL-17+ CD4+ (Figure 5F) et lymphocytes Treg Foxp3+ dans la lamina propria intestinale des receveurs de Rag1-/- (Figure 5G).
Figure 1 : Procédure d’induction de la colite et évaluation de la gravité de la maladie. Les lymphocytes T CD4+ spléniques ont été isolés à partir de souris transgéniques TCR CBir1 à l’aide de billes magnétiques, puis les lymphocytes T naϊve ont été purifiés par tri. Les lymphocytes Tϊve transgéniques CBir1 TCR ont ensuite été transférés par voie intraveineuse chez des souris Rag1-/- receveuses. Lorsque les souris ont été sacrifiées environ six semaines après le transfert cellulaire, la gravité de la colite a été évaluée par des scores histopathologiques. Les phénotypes des lymphocytes T CD4+ dans la lamina propria du côlon ont été déterminés par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La stratégie de contrôle pour le tri des cellules T naϊve transgéniques CBir1 TCR. Les lymphocytes Tϊve transgéniques CBir1 viables ont été purifiés en excluant les débris (A), les cellules non individuelles (B-C), les cellules mortes (D) et les cellules activées (E-F). La sous-population a été indiquée en (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les changements de poids des souris Rag1-/- après le transfert de lymphocytes T. 1 x 106 lymphocytes Tcr transgéniques CBir1 ont été transférés dans des souris Rag1-/- et des souris Rag1-/- recevant du PBS ont été utilisées comme témoins. Les poids des souris étaient enregistrés chaque semaine. Les données ont été présentées en moyenne ± DT; Test t de l’élève; p<0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La morphologie brute et la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine du côlon chez des souris Rag1-/- recevant des cellules T naϊve transgéniques CBir1 TCR. (A) Les souris receveuses ont été sacrifiées six semaines après le transfert cellulaire, et la morphologie brute du côlon a été montrée. (B-E) Les souris receveuses ont été sacrifiées à différents moments, et les souris Rag1-/- ont reçu pbS comme témoins. Les côlons ont été traités pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Des images représentatives de la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine du côlon sont montrées. Barre d’échelle = 200 μm. (F) Les scores histopathologiques ont été déterminés. Les données ont été présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Les phénotypes des lymphocytes T CD4+ dans la lamina propria colique de souris Rag-/- recevant des lymphocytes T naϊve transgéniques CBir1 TCR. Lorsque les souris receveuses ont été sacrifiées 6 semaines après le transfert cellulaire, les cellules de lamina propria du côlon ont été isolées pour colorer les phénotypes des lymphocytes T CD4+. (A-E) La stratégie de contrôle pour l’analyse des phénotypes des lymphocytes T. (F-G) (F) Les lymphocytes T IL-17A+ CD4+, les lymphocytes T IFNγ+ CD4+, les lymphocytes T IL-17+ IFNγ+ CD4+ et les Tregs (G) Foxp3+ ont été déterminés par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que chaque étape soit essentielle à la reproductibilité de ce modèle de colite, il existe plusieurs étapes critiques. Les souris Rag-/- receveuses doivent recevoir suffisamment de lymphocytes T NAΪve CD4+ viables adéquats pour induire une inflammation intestinale. Nous avons utilisé des rates pour isoler les lymphocytes T CD4+ naïfs au lieu des MLN. Parce que le rendement des lymphocytes T CD4+ naïfs dans les MLN est beaucoup plus faible que dans la rate. CD62L est fortement exprimé dans les lymphocytes T naïfs, et CD44 et CD25 sont les marqueurs d’activation des lymphocytes T13,14. Dans cette étude, nous avons d’abord utilisé des billes magnétiques anti-CD4 pour isoler les lymphocytes T CD4+ de la rate. Ensuite, nous avons utilisé la combinaison d’anticorps anti-CD4, anti-CD62L et anti-CD25 pour isoler les lymphocytes T CD4+ naïfs13,14. Les chercheurs pourraient utiliser d’autres marqueurs pour trier les lymphocytes T CD4+ naïfs. CD45RBhi est également un marqueur des lymphocytes T naïfs. Les lymphocytes T CD45RBHI CD25-CD4+ sont couramment utilisés comme lymphocytes T naïfs de lymphocytes T transgéniques non TCR de type sauvage23. Par conséquent, les techniques de tri des cellules et d’injection intraveineuse des cellules T dans les souris receveuses sont essentielles. La configuration du protocole de contrôle en tant que modèle est utile pour accélérer les expériences avec moins d’erreurs. Pour éviter la mort cellulaire, les cellules doivent toujours être maintenues sur la glace. En outre, la coloration des cellules avec DAPI est fortement recommandée pour exclure les cellules mortes, car DAPI ne peut pas transiter à travers les membranes cellulaires intactes, ce qui en fait une excellente sonde de cellules mortes24. Réchauffer les souris pour stimuler la dilatation des veines caudales offre une meilleure visibilité veineuse pour l’injection intraveineuse. Il est recommandé que toutes les procédures soient effectuées par des chercheurs formés.
De nombreux facteurs peuvent avoir un impact sur le résultat des modèles de colite, ce qui doit être pris en compte. Tout d’abord, les souris Rag1-/- receveuses doivent correspondre à l’âge et au sexe. Dans le modèle de transfert de lymphocytes T CD45RBhi, les lymphocytes T de donneurs mâles et femelles peuvent être transférés à des receveurs mâles de Rag-/- tandis que seules les donneuses femelles peuvent être utilisées lors de l’utilisation de femelles receveurs23. Cependant, nous ne voyons pas de différence significative entre les bénéficiaires masculins et féminins. Les souris receveuses peuvent être des femelles ou des mâles, et les lymphocytes T de donneurs mâles peuvent également induire la colite chez les receveuses. Étant donné que le changement de poids est un indicateur précieux de la progression de la colite, il est recommandé d’utiliser les souris receveuses entre 8 et 12 semaines pour présenter une ligne de poids stable. Ces souris receveuses doivent être élevées et gardées dans la même pièce de l’animalerie, car le microbiote est essentiel à la régulation du développement de la colite25. Le temps nécessaire pour développer la colite varie lors du transfert de différents nombres de lymphocytes T CBir1 TCR Tg naïfs CD4. Comme prévu, moins de cellules nécessitent un temps plus long pour l’induction de la colite, et un plus grand nombre de cellules nécessitent un temps plus court pour l’induction de la colite. L’utilisation de 1 x 106 cellules par souris receveuse est recommandée car les souris receveuses présentent des signes cliniques de colite ~ 2-3 semaines après le transfert cellulaire et développent une colite relativement sévère ~ 6 semaines après le transfert cellulaire. De plus, par rapport à l’injection intrapéritonéale, l’injection intraveineuse de cellules dans la veine caudale induit une colite plus cohérente. Pour l’isolement des cellules de lamina propria du côlon, les tissus du côlon ne doivent pas se dessécher; sinon, cela réduirait le rendement et la viabilité des cellules. L’une des préoccupations particulières est que la durée de la colite serait modifiée si les souris receveuses étaient transférées avec des lymphocytes TG TG CBir1 TCR génétiquement modifiés ou traitées avec des médicaments26. En outre, les lymphocytes TG TG CBir1 TCR induisent également une inflammation intestinale chez d’autres souris immunodéficientes, telles que les souris TCRβ/δ-/- , qui manquent de lymphocytes T27.
Comme l’accumulation de preuves indique un rôle crucial des lymphocytes T réactifs spécifiques à l’antigène bactérien intestinal dans la pathogenèse des MII, l’utilisation de lymphocytes T spécifiques pour un antigène bactérien intestinal défini fournira des informations sur la façon dont l’antigène bactérien intestinal induit des réponses des lymphocytes T pour induire la colite. L’antigène CBir1 du microbiote intestinal est abondant dans le tractus gastro-intestinal, ce qui est lié à la pathogenèse de la MII8,9. Ce modèle de colite ressemble à plusieurs caractéristiques critiques de la MII, y compris la diarrhée, la perte de poids, la découverte histopathologique et les réponses immunitaires intestinales anormales. Par conséquent, ce modèle de colite est utile pour étudier les mécanismes des MII humaines et fournit un outil pour évaluer les traitements des MII. Fait intéressant, les travaux récents de Chiaranunt et al. ont indiqué que la spécificité des lymphocytes T dans l’antigène CBir 1 du microbiote pourrait à elle seule ne pas être suffisante pour induire l’activation des lymphocytes T et la colite. Ceci est mis en évidence par les lymphocytes TG TCR de type sauvage induits par la colite chez les receveurs de Rag-/- tandis que les lymphocytes T Rag-/- CBir1 n’ont pas induit de colite chez leur animalier, ce qui suggère que les lymphocytes T intestinaux répondant à un antigène bactérien intestinal spécifique peuvent nécessiter d’autres bactéries commensales interdépendantes, par exemple Helicobacter spp, pour fonctionner comme adjuvant28 . Un aspect intéressant de ce modèle est que différents sous-ensembles de lymphocytes T, à savoir les cellules Th1, Th17 et Treg, sont présents dans la lamina propria de souris receveuses colitiques, ce qui offre une occasion unique d’étudier les rôles non seulement des lymphocytes T effecteurs, mais aussi des Tregs dans la pathogenèse de la colite29.
Cependant, comme ce modèle de colite est médié par des lymphocytes T spécifiques du microbiote intestinal, une limitation de ce modèle de colite est que la durée d’induction de la colite peut varier dans différentes installations animales en fonction du microbiote intestinal.
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Disclosures
Aucun auteur n’a d’intérêts financiers, professionnels ou personnels conflictuels.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les subventions DK125011, AI150210 et DK124132 des National Institutes of Health, le prix STARs system de l’Université du Texas (Y.C.) et le James W. McLaughlin Fellowship Fund de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston (W.Y.). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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