Summary
In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.
Abstract
Met de toename van de incidentie leggen inflammatoire darmziekten (IBD), chronische ziekten die het maagdarmkanaal aantasten, een aanzienlijke gezondheids- en financiële last op individuen en de samenleving. Daarom is het van cruciaal belang om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de pathogenese en ontwikkeling van IBD. Hier wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-celtransfer colitismodel beschreven. CBir1 flagellin is erkend als het immunodominante darmbacteriële antigeen bij experimentele colitis en patiënten met de ziekte van Crohn. CBir1 TCR transgene naϊve CD4+ T-cellen, specifiek voor CBir1 flagellin, kunnen chronische colitis induceren na adoptieve overdracht naar immuun-deficiënte Rag1-/- muizen. De ernst van de ziekte wordt beoordeeld door histopathologie. De CD4+ T-celfenotypen in colon lamina propria worden ook bepaald. Dit model lijkt sterk op de ontwikkeling van IBD, dat een ideaal muizenmodel biedt voor het onderzoeken van de mechanismen die de pathogenese van IBD aansturen en het testen van de potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van IBD.
Introduction
Inflammatoire darmziekten (IBD), voornamelijk waaronder de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC), worden gekenmerkt door chronische, relapsing-remitting ontsteking van het maagdarmkanaal, die miljoenen wereldwijd treft1. Verschillende factoren zijn betrokken bij de ontwikkeling en pathogenese van IBD, waaronder genetische gevoeligheid, darmmicrobiota, immuunresponsen, dieet en levensstijl2. Het exacte mechanisme van IBD is echter nog steeds niet volledig begrepen.
Een van de bijzondere interesses is de interactie tussen darmmicrobiota en immuunresponsen van de gastheer bij het reguleren van darmontsteking3. Darmmicrobiota biedt een reeks immunostimulerende moleculen en antigenen, die immuunresponsen kunnen activeren4. Hoewel de balans tussen effector T-cellen en regulerende T-cellen (Tregs) van cruciaal belang is bij het handhaven van intestinale homeostase, draagt de overmatige intestinale mucosale CD4 + T-celrespons op darmmicrobiota-antigenen bij aan darmontsteking5,6,7. Als immunodominant darmmicrobiota-antigeen is CBir1 flagellin gerelateerd aan de pathogenese van humaan CD8,9. Bovendien induceert overdracht van CBir1 TCR transgene (Tg) T-cellen darmontsteking bij immuundeficiënte muizen6, die sterk lijken op de menselijke IBD, wat aangeeft dat dit T-celoverdrachtsmodel helpt bij het onderzoeken van de mechanismen van menselijke IBD.
Dit werk beschrijft het gedetailleerde protocol van het induceren van colitis bij Rag1-/- muizen door adoptieve overdracht van CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen en het beoordelen van de ernst van de ziekte. Bovendien worden de verwachte resultaten getoond en worden de kritieke stappen van de procedure en probleemoplossing besproken, wat onderzoekers zal helpen de mechanismen van pathogenese van darmontsteking te onderzoeken en de potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van IBD te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens het Comité voor het gebruik en de verzorging van de dieren van de University of Texas Medical Branch. CBir1 TCR Tg-muizen werden geleverd door Dr. Charles Elson van de Universiteit van Alabama in Birmingham. CBir1 TCR Tg-muizen kunnen vrouwelijk of mannelijk zijn, maar moeten 8-12 weken zijn. Rag1-/- muizen op de C57BL/6 achtergrond werden verkregen uit het Jackson Laboratory10. Rag1-/- muizen moeten geslachts- en leeftijdsgematcht zijn, en mannelijk of vrouwelijk kan worden gebruikt, maar moet 8-12 weken zijn. Het hele protocol is samengevat in figuur 1.
1. Voorbereiding van de ontvangende muizen
- Bereid Rag1-/- muizen voor op de C57BL/6-achtergrond, gefokt in dezelfde specifieke pathogeenvrije dierenfaciliteit. Bereken het aantal muizen per groep door middel van vermogensanalyse11.
OPMERKING: Rag1-/- muizen hebben geen volwassen T-cellen en B-cellen10. - Markeer de muizen op gehoorstoot.
- Weeg de muizen op dezelfde dag van de T-celoverdracht.
2. Bereiding van de reagentia en oplossingen
OPMERKING: De gebruikte reagentia zijn giftig of biologisch gevaarlijk en hun behandeling vereist voorzorgsmaatregelen en veiligheidsmaatregelen.
- Bereid wasbuffer voor: voeg 5 ml 100x penicilline-streptomycine toe aan 500 ml RPMI 1640 medium. Meng het grondig en bewaar het bij 4 °C.
- Bereid Tris-NH4Cl Lysis Buffer voor.
- Bereid oplossing deel A. Los 2,06 g Tris-basis op in 100 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en stel de pH-waarde met HCl in op 7,2.
- Bereid oplossing deel B. Los 7,47 g NH4Cl op in 800 ml ddH2O.
- Meng A en B goed door elkaar. Meet de pH en stel deze in op 7,2 zo niet.
- Stel het totale volume in op 1000 ml. Autoclaaf en bewaar het vervolgens bij 4 °C.
- Bereid de isolatiebuffer voor.
- Voeg 2,5 g BSA en 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) toe aan 500 ml 1x PBS. Meng het grondig.
- Filtreer de oplossing door een vacuüm aangedreven wegwerpflesbladfilter van 0,22 μm (zie Materiaaltabel). Bewaren bij 4 °C.
- FACS-buffer voorbereiden. Voeg 1 ml FBS en 50 μl EDTA (0,5 M, pH 8,0) toe aan 50 ml wasbuffer (bereid in stap 2.1). Meng goed en bewaar het bij 4 °C.
- Bereid volledig medium voor. Voeg 5 ml FBS toe in 45 ml wasbuffer. Meng goed en bewaar het bij 4 °C.
- Bereid EDTA-PBS-buffer voor.
- Bereken het benodigde volume van de EDTA-PBS-buffer. Volume (ml) = muisnummer x 20.
- Voeg het juiste volume FBS, EDTA en HEPES toe aan de PBS (2% FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES in PBS) (zie Tabel met materialen).
- Meng het grondig en warm het voor in een waterbad van 37 °C.
- Bereid de digestiebuffer voor.
- Bereken het volume van de benodigde digestiebuffer. Volume (ml) = muisnummer x 10.
- Voeg het juiste volume FBS, Collagenase IV en DNase I toe in de wasbuffer (2% FBS, 0,5 mg / ml Collagenase IV en 10 U / ml DNase I in wasbuffer) (zie tabel met materialen).
- Meng het grondig en warm het voor in een waterbad van 37 °C.
- Bereid Percoll-oplossing voor.
- Bereid 100% Percoll. Voeg 5 ml 10x PBS toe in 45 ml originele Percoll (zie materiaaltabel).
- Bereid 2% FBS voor in wasbuffer. Voeg 1 ml FBS toe in 49 ml wasbuffer.
- Caulculeer het volume van 40 % Percoll Solution en 75 % Percoll Solution. Volume van 40% Percoll-oplossing (ml) = muisnummer x 4; Volume van 75% Percoll-oplossing (ml) = muisnummer x 2.
OPMERKING: De in stap 2.1-2.5 bereide reagentia/oplossingen worden gebruikt in de stappen 3-4 en de reagentia/oplossingen die in stap 2.6-2.8 zijn bereid, worden in stap 9 gebruikt. Alle in stap 9 gebruikte reagentia/oplossingen moeten vers worden bereid. Het maken van 5% extra buffer wordt aanbevolen voor alle stappen.
3. Isolatie van milt CBir1 TCR Tg CD4 + T-cellen
- Euthanaseer CBir1 TCR Tg muis/muizen door een cervicale dislocatie met CO2 euthanasie (30%-70% gas-lucht verplaatsingssnelheid). Maak de muizen nat met 70% ethanol.
- Voer een linker buikincisie van ~ 1 cm uit, trek de huid weg van het buikspierweefsel, maak een incisie van ~ 3 cm in het buikspierweefsel en verwijder de milt met een steriele schaar en tang. Plaats de milt in een kweekschaal met 5 ml voorkoelde wasbuffer (bereid in stap 2.1).
- Maal de milt met het ruwe oppervlak van twee steriele glasglijbanen. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 ml door een celzeef van 100 μm te gaan (zie Materiaaltabel). Spoel de glazen glaasjes en kweekschaal af met 5 ml voorkoelde wasbuffer en breng de wasbuffer over in de buis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 5 ml voorverwarmde Tris-NH4Cl Lysis Buffer (bereid in stap 2.2) per milt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 10 ml voorkoelde wasbuffer toe aan de buis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 10 ml pre-koude isolatiebuffer (bereid in stap 2.3).
- Tel de cellen. Meng 10 μL celsuspensie met 10 μL trypan blauw grondig. Laad 10 μL van het mengsel op een dia, plaats de dia in de geautomatiseerde celteller (zie tabel met materialen) en verkrijg het levensvatbare celnummer12.
OPMERKING: Ongeveer 1 x 108 cellen kunnen in deze stap van één donormuis worden verkregen. - Centrifugeer de resterende celsuspensie vanaf stap 3.6 bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi alle supernatanten weg.
- Vortex de anti-muis CD4 Magnetische Deeltjes grondig (zie Tabel met Materialen), voeg direct 50 μL van de deeltjes per 107 cellen toe en meng grondig met celkorrels. Incubeer gedurende 30 min bij 4 °C.
OPMERKING: Elke andere commerciële CD4 + T-celverrijkingskit kan hier worden gebruikt. - Breng de celdeeltjessuspensie over in een steriele opvangbuis. Voeg 3,5 ml voor-koude isolatiebuffer toe aan de buis.
- Plaats de buis gedurende 8 minuten op de celscheidingsmagneet (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur. Aspiraleer het supernatant voorzichtig met behulp van een 3 ml transferpipet.
- Verwijder de buis uit de celscheidingsmagneet (zie materiaaltabel), resuspend de cellen met 3,5 ml pre-koude isolatiebuffer en plaats de buis gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op de magneet. Aspiraleer het supernatant voorzichtig met behulp van een 3 ml transferpipet.
- Herhaal stap 3.11.
- Resuspend de cellen met 1 ml pre-koude FACS Buffer (bereid in stap 2.4).
4. Zuivering van CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T cellen
- Tel de cellen na stap 3.6.
- Als de celconcentratie >107/ml is, voegt u een volume FACS-buffer toe om ervoor te zorgen dat de celconcentratie ≤ 107/ml is.
OPMERKING: ~1 × 107 cellen kunnen in deze stap worden verkregen van één donormuis. - Kleur de oppervlaktemarkers met 10 μL anti-muis CD4-APC, 10 μL anti-muis CD25-Percp/Cy5.5 en 10 μL anti-muis CD62L-PE13,14 (zie Materiaaltabel). Meng zachtjes en incubeer gedurende 30 min bij 4 °C in het donker.
- Was de cellen met 2 ml pre-koude FACS-buffer. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Aspirateer alle supernatanten met behulp van een 3 ml transferpipet.
- Herhaal stap 4.4.
- Resuspend de cellen tot de concentratie van 40 x 106/ml in pre-koude FACS-buffer.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de sorteerder verstopt raakt, laat u de cellen door een zeef van 70 μm gaan. - Voeg 0,1 μg/ml DAPI toe.
OPMERKING: DAPI wordt gebruikt voor het uitsluiten van de dode cellen. - Bereid centrifugebuizen van 15 ml met 4 ml volledig medium (bereid in stap 2.5) voor het verzamelen van de gesorteerde cellen.
- Laad de cellen op de sorteerder. Sorteer enkele levensvatbare naϊve CD4+ T-cellen (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ cellen) in zuiverheidsmodus (Nozzle grootte: 70 μm; Druk: 70 PSI; Event rate: 8000-12000 events/s; Rendement: hoger dan 90%) (figuur 2).
OPMERKING: Naϊve CD4+ T-cellen drukken een hoge expressie van CD62L uit en missen de activeringsmarker CD2513,14. - Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Aspiraleer alle supernatanten met behulp van een 3 ml transferpipet.
- Resuspend de cellen in 500 μL van 1x PBS.
- Cellen tellen na stap 3.6
OPMERKING: ~5 × 106 cellen kunnen in deze stap worden verkregen van één donormuis.
5. Celoverdracht in de ontvangende muizen
- Resuspend de CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T cellen tot de 5 x 106/ml concentratie door toevoeging van 1x PBS.
- Verwarm de Rag-/- muizen gedurende 4 minuten onder een warmtelamp (zie Tabel met materialen) en houd de muizen in bedwang met behulp van een muisreparator.
- Breng intraveneus 200 μL van de celsuspensie over in de staartader van Rag-/- muizen met behulp van een insulinespuit van 1 ml (27 G) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Cellen van één donormuis zijn voldoende om over te dragen naar ongeveer vijf ontvangende muizen.
6. Monitoring van klinische symptomen tijdens de progressie van colitis
- Weeg de muizen elke week en verhoog de observatie tot twee keer per week zodra de muizen >5% van het oorspronkelijke gewicht beginnen te verliezen.
- Observeer de reactie/beweging van muizen wanneer ze zachtjes worden gestimuleerd.
- Observeer andere klinische afwijkingen. d.w.z. houding en consistentie van de ontlasting.
7. Colonverzameling en histopathologische scoring
- Offer de ontvangende muizen op door een cervicale dislocatie met CO2 op een tijdstip van het gewichtsverlies >20% van het oorspronkelijke gewicht of 6 weken na de celoverdracht. Maak de muizen nat met 70% ethanol.
- Voer een ventrale middellijnhuidincisie van ~ 1 cm uit, trek de huid weg van het buikspierweefsel, maak een incisie van ~ 3 cm in het buikspierweefsel, identificeer de blindedarm en verwijder de hele dikke darm met een steriele schaar en een tang. Maak de dikke darm nat met voorkoelde PBS in een kweekschaal.
- Snijd de dikke darm in de lengte en spoel deze af met voorverkouden PBS. Snijd 1/3 van de dikke darm in de lengterichting.
- Plaats de dubbele darmstrook in een papieren handdoek met de luminale zijde naar boven gericht. Voer Zwitsers rollen uit met een tandenstoker15.
- Plaats de colon Swiss in een cassette en plaats de cassette gedurende 24 uur in 10% gebufferde formaline, gevolgd door uitdroging met behulp van een geautomatiseerde processor (zie Tabel met materialen) en paraffine-inbedding.
- Knip 5 μm weefselsecties op een microtoom, gemonteerd op dia's en voer de Hematoxyline- en eosine (H & E) -vlek uit17 (zie Materiaaltabel).
- Bepaal de histopathologische scores door de scores voor elk van de zes parameters te combineren voor een maximum van 12. Lamina propria ontsteking (normaal, 0; mild, 1; matig, 2; ernstig, 3); goblet celverlies (normaal, 0; mild, 1; matig, 2; ernstig, 3); abnormale crypte (normaal, 0; hyperplastisch, 1; desorganisatie, 2; cryptverlies, 3); crypt abcessen (afwezig, 0; aanwezig, 1); mucosale erosie en ulceratie (normaal, 0; mild, 1; matig, 2; ernstig, 3); en submucosale verandering (geen, 0; submucosa, 1; transmuraal, 2)18.
8. Isolatie en kleuring van intestinale lamina propria cellen
- Snijd na stap 7.3 nog eens 2/3 van de dikke darm in stukjes van 0,5-1 cm en was deze met voorkoelde PBS.
- Breng de colonsegmenten over in een centrifugebuis van 20 ml met voorverwarmde EDTA-PBS in een centrifugebuis van 50 ml. Incubeer bij 37 °C met 250 rpm schudden gedurende 30 min.
- Vortex de buis, gooi de supernatanten weg door deze door een steriele zeef (diameter: 0,01 inch) te laten gaan en resuspend de colonsegmenten in 20 ml voorkoelde PBS in de buis van 50 ml.
- Herhaal stap 8.3 tweemaal.
- Plaats de segmenten van de dikke darm in een C-buis (zie Materiaaltabel) met 10 ml voorverwarmde digestiebuffer.
- Plaats de buis op een dissociatormachine (zie tabel met materialen) en incubeer onder het programma "37C_m_LPDK_1" gedurende 25 minuten.
OPMERKING: "37C_m_LPDK_1" is een standaard vooraf ingesteld programma in de dissociatormachine die wordt gebruikt voor het roeren van de monsters en deze op 37 °C te houden. - Controleer of weefsel volledig verteerd is, wat betekent dat er geen stukje weefsel in de Digestiebuffer zit. Zo niet, herhaal dan het programma van "37C_m_LPDK_1".
- Verzamel het supernatant door door een metalen zeef en een zeef van 100 μL te gaan. Spoel af met 10 ml voorkoelde PBS.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Aspirateer alle supernatanten.
- Resuspend de cellen in 4 ml 40% Percoll-oplossing en meng deze grondig (bereid in stap 2.8).
- Breng de geresuspendeerde cellen over in 2 ml 75% Percoll-oplossing in een centrifugebuis van 15 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 850 x g gedurende 20 minuten bij 20 °C (versnellingshelling: 0; Remklep: 0).
- Verwijder voorzichtig vet op de bovenste laag met behulp van een 3 ml transferpipet en breng de cellaag over op 20 ml wasbuffer in een buis van 50 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi alle supernatanten en resuspend cellen weg in 1 ml voltooid medium.
- Tel de cellen na stap 3.6.
- Zaai de cellen in een 24-well plaat, activeer ze met 50 ng / ml Phorbol-12-myristate 13-acetaat en 750 ng / ml ionomycine gedurende 2 uur, gevolgd door incubatie met 5 μg / ml Brefeldin A gedurende 3 uur (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De gebruikte reagentia zijn giftig en de hantering ervan vereist voorzorgsmaatregelen en veiligheidsmaatregelen. - Breng de cellen over in een FACS-buis, voeg 2 ml FACS-buffer toe en centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 350 x g . Gooi het supernatant weg.
- Incubeer de cellen met 12,5 μg/ml antimuis CD16/3219 in (zie tabel met materialen) FACS-buffer om Fc-receptoren gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren.
- Vlek voor levend/dood en oppervlakte marker.
- Was de cellen met 2 ml FACS-buffer en centrifugeer ze gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 350 x g . Gooi het supernatant weg.
- Kleur de cellen met levende kleurstof en oppervlaktemarkers (d.w.z. anti-muis CD3- en antimuis CD4-antilichamen)20 (zie Materiaaltabel) in FACS Buffer bij de geoptimaliseerde concentratie gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: De gebruikte reagentia zijn giftig en de hantering ervan vereist voorzorgsmaatregelen en veiligheidsmaatregelen.
- Voer de cellulaire en nucleaire kleuring uit.
- Voeg 2 ml FACS-buffer toe en centrifugeer de celsuspensie gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 350 x g . Gooi het supernatant weg.
- Permeabiliseer en fixeer de cellen door de cellen gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur opnieuw te conditioneren met 200 μL transcriptiefactorfix-werkoplossing (zie tabel met materialen).
- Voeg 2 ml Perm-buffer toe en centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Incubeer de cellen met cellulaire en nucleaire markers (d.w.z. anti-muis IFNγ, anti-muis IL-17A en anti-muis Foxp3 antilichamen)20 in Perm buffer (zie Tabel van materialen) gedurende 30 min-1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 2 ml Perm-buffer toe en centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml FACS-buffer toe en centrifugeer de celsuspensie gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 350 x g. Gooi het supernatant weg.
- Resuspend cellen met 200 μL FACS Buffer en voer de monsters uit op een flowcytometer (zie Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ongeveer 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T cellen per milt werden geïsoleerd uit een volwassen CBir1 TCR Tg muis. Overdracht van CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen veroorzaakte chronische colitis bij ontvangende Rag1-/- muizen. Na celoverdracht werden klinische symptomen gecontroleerd om de progressie van darmontsteking te evalueren, waaronder gewichtsverlies, consistentie van de ontlasting en gebogen houding. Zoals verwacht begonnen muizen ongeveer drie weken na de celoverdracht gewicht te verliezen en het gewicht bereikte ongeveer 80% -85% van het oorspronkelijke gewicht zes weken na celoverdracht (figuur 3). Bovendien vertoonden muizen diarree rond 3-4 weken na celoverdracht en vertoonden ze een gebogen houding toen ze ernstige colitis ontwikkelden. De bruto morfologie van de dikke darm werd aangetoond en de ernst van de colitis werd beoordeeld aan de hand van de histopathologische score wanneer muizen werden geofferd. Muizen die CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen kregen, vertoonden een korte colonlengte 6 weken na celoverdracht (figuur 4A). De ontvangende muizen vertoonden meer celinfiltratie in de intestinale lamina propria 4 weken na celoverdracht (figuur 4C), bokaalcelverlies en intestinale epitheelcelhyperplasie 5 weken na celoverdracht (figuur 4D), en mucosale erosie en ontstekingscelinfiltratie in de submucosa van de dikke darm 6 weken na celoverdracht (figuur 4F). Tegelijkertijd was er geen ontsteking bij Rag1-/- muizen die alleen PBS kregen (figuur 4B). Bovendien is er geen ontsteking in de dunne darm, maar de blindedarm heeft een ontsteking. Bovendien werden CD4+ T-celfenotypen in colon lamina propria bepaald door flowcytometrie. De gatingstrategie is weergegeven (figuur 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen ontwikkelden zich tot IFNγ+ Th1-cellen, IL-17A+ Th17-cellen, IFNγ+ IL-17+ CD4+ T-cellen (figuur 5F) en Foxp3+ Treg-cellen in intestinale lamina propria van Rag1-/- ontvangers (figuur 5G).
Figuur 1: De procedure van inductiecolitis en beoordeling van de ernst van de ziekte. Milt CD4 + T-cellen werden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen met behulp van magnetische kralen, en vervolgens naϊve T-cellen werden gezuiverd door sortering. CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen werden vervolgens intraveneus overgebracht naar reciserverende Rag1-/- muizen. Toen de muizen ongeveer zes weken na de celoverdracht werden opgeofferd, werd de ernst van colitis beoordeeld aan de hand van histopathologische scores. De CD4+ T-celfenotypen in colon lamina propria werden bepaald door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De gatingstrategie voor het sorteren van CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen. Levensvatbare enkele CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen werden gezuiverd door puin (A), niet-enkele cellen (B-C), dode cellen (D) en geactiveerde cellen (E-F) uit te sluiten. De subpopulatie werd weergegeven in (G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De gewichtsveranderingen van Rag1-/- muizen na T-celoverdracht. 1 x 106 CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen werden overgebracht naar Rag1-/- muizen en Rag1-/- muizen die PBS kregen, werden gebruikt als controles. Muisgewichten werden elke week geregistreerd. De gegevens werden gepresenteerd in gemiddelde ± SD; Student t-test; p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De grove morfologie en hematoxyline- en eosinekleuring van de dikke darm van Rag1-/- muizen die CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen kregen. (A) De ontvangende muizen werden zes weken na celoverdracht opgeofferd en de grove morfologie van de dikke darm werd getoond. (B-E) De ontvangende muizen werden op verschillende tijdstippen geofferd en Rag1-/- muizen kregen PBS als controles. De dikke darm werd verwerkt voor Hematoxyline en eosinekleuring. Representatieve afbeeldingen van Hematoxyline en eosinekleuring van de dikke darm worden getoond. Schaalbalk = 200 μm. (F) Histopathologische scores werden bepaald. De gegevens werden gepresenteerd in de gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: De CD4+ T-celfenotypen in colon lamina propria van Rag-/- muizen die CBir1 TCR transgene naϊve T-cellen krijgen. Toen de ontvangende muizen 6 weken na celoverdracht werden opgeofferd, werden colon lamina propria-cellen geïsoleerd voor het kleuren van CD4 + T-celfenotypen. (A-E) De gating strategie voor de analyse van T-cel fenotypes. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T cellen, IFNγ+ CD4+ T cellen, IL-17+ IFNγ+ CD4+ T cellen, en (G) Foxp3+ Tregs werden bepaald door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel elke stap essentieel is voor de reproduceerbaarheid van dit colitismodel, zijn er verschillende kritieke stappen. De ontvangende Rag-/- muizen moeten voldoende levensvatbare naϊve CD4+ T-cellen krijgen om darmontsteking te induceren. We gebruikten milten voor de isolatie van naïeve CD4+ T-cellen in plaats van MLN's. Omdat de opbrengst van naïeve CD4+ T-cellen in MLN's veel lager is dan in milten. CD62L komt sterk tot expressie in naïeve T-cellen en CD44 en CD25 zijn de activeringsmarkers van T-cellen13,14. In deze studie gebruikten we voor het eerst anti-CD4 magnetische kralen om CD4 + T-cellen uit milten te isoleren. Vervolgens gebruikten we de combinatie van anti-CD4, anti-CD62L en anti-CD25 antilichamen voor isolatie van naïeve CD4+ T-cellen13,14. Onderzoekers zouden andere markers kunnen gebruiken voor het sorteren van de naïeve CD4 + T-cellen. CD45RBhi is ook marker van naïeve T-cellen. CD45RBhi CD25- CD4+ T-cellen worden vaak gebruikt als naïeve T-cellen van wild-type niet-TCR transgene T-cellen23. Daarom zijn de technieken van het sorteren van cellen en intraveneuze injectie van de T-cellen in de ontvangende muizen essentieel. Het instellen van het gating-protocol als sjabloon is handig om de experimenten met minder fouten te versnellen. Om celdood te voorkomen, moeten cellen altijd op ijs worden gehouden. Bovendien wordt het kleuren van cellen met DAPI ten zeerste aanbevolen voor het uitsluiten van dode cellen omdat DAPI niet over intacte celmembranen kan gaan, waardoor het een uitstekende dode celsonde is24. Het verwarmen van de muizen om de verwijding van de staartaders te stimuleren, zorgt voor een betere zichtbaarheid van de ader voor intraveneuze injectie. Alle procedures worden aanbevolen om te worden uitgevoerd door getrainde onderzoekers.
Veel factoren kunnen van invloed zijn op de uitkomst van de colitismodellen, waar aandacht aan moet worden besteed. Ten eerste moeten de ontvangende Rag1-/- muizen leeftijd en geslacht op elkaar afstemmen. In het CD45RBhi T-celoverdrachtsmodel kunnen T-cellen van mannelijke en vrouwelijke donoren worden overgedragen aan mannelijke Rag-/- ontvangers, terwijl alleen vrouwelijke donoren kunnen worden gebruikt bij het gebruik van vrouwelijke ontvangers23. We zien echter geen significant verschil tussen mannelijke en vrouwelijke ontvangers. De ontvangende muizen kunnen vrouwtjes of mannetjes zijn, en T-cellen van mannelijke donoren kunnen ook colitis veroorzaken bij vrouwelijke ontvangers. Aangezien gewichtsverandering een waardevolle indicator is voor de progressie van colitis, wordt het aanbevolen om de ontvangende muizen tussen 8-12 weken te gebruiken om een stabiele gewichtslijn te presenteren. Deze ontvangende muizen moeten worden gefokt en in dezelfde kamer van de dierlijke faciliteit worden gehouden, omdat microbiota van cruciaal belang is bij het reguleren van de ontwikkeling van colitis25. De tijd om colitis te ontwikkelen varieert bij het overbrengen van verschillende aantallen CBir1 TCR Tg naïeve CD4 T-cellen. Zoals verwacht, hebben minder cellen een langere tijd nodig voor inductie van colitis en een hoger aantal cellen heeft een kortere tijd nodig voor inductie van colitis. Het gebruik van 1 x 106 cellen per ontvangende muis wordt aanbevolen omdat de ontvangende muizen klinische tekenen van colitis vertonen ~ 2-3 weken na celoverdracht en relatief ernstige colitis ~ 6 weken na celoverdracht ontwikkelen. Bovendien induceert intraveneuze injectie van cellen in de staartader, in vergelijking met intraperitoneale injectie, meer consistente colitis. Voor isolatie van colon lamina propria-cellen mogen de colonweefsels niet droog worden; anders zou het de opbrengst en levensvatbaarheid van cellen verminderen. Een van de specifieke zorgen is dat de duur van de colitis zou worden veranderd als de ontvangende muizen worden overgedragen met genetisch gemodificeerde CBir1 TCR Tg T-cellen of worden behandeld met geneesmiddelen26. Bovendien induceren CBir1 TCR Tg T-cellen ook darmontsteking bij andere immuundeficiënte muizen, zoals TCRβ / δ-/- muizen, die T-cellen missen27.
Aangezien accumulerend bewijsmateriaal wijst op een cruciale rol van darmbacteriële antigeenspecifieke reactieve T-cellen in de pathogenese van IBD, zal het gebruik van T-cellen specifiek voor een gedefinieerd darmbacterbacteriaal antigeen inzicht geven in hoe darmbacteriële antigeen T-celreacties induceert om colitis te induceren. Darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin is overvloedig aanwezig in het maagdarmkanaal, wat gerelateerd is aan de pathogenese van IBD8,9. Dit colitismodel lijkt op verschillende kritieke kenmerken van IBD, waaronder diarree, gewichtsverlies, histopathologische bevinding en abnormale intestinale immuunresponsen. Daarom is dit colitismodel nuttig om de mechanismen van menselijke IBD te bestuderen en biedt het een hulpmiddel om de behandelingen voor IBD te evalueren. Interessant is dat het recente werk van Chiaranunt et al. aangaf dat T-celspecificiteit aan het microbiota CBir 1-antigeen alleen mogelijk niet voldoende is om T-celactivatie en colitis te induceren. Dit wordt bewezen door de wild-type CBir1 TCR Tg T-cellen geïnduceerde colitis bij Rag-/- ontvangers, terwijl Rag-/- CBir1 T-cellen geen colitis induceerden in hun dierlijke faciliteit, wat suggereert dat darm-T-cellen die reageren op specifiek darmbacteriële antigeen andere onderling gerelateerde commensale bacteriën, bijvoorbeeld Helicobacter spp, nodig hebben om te functioneren als een adjuvant28 . Een opwindend aspect van dit model is dat verschillende T-celsubsets, namelijk Th1-, Th17- en Treg-cellen, aanwezig zijn in lamina propria van colitische ontvangermuizen, wat een unieke kans biedt om de rollen van niet alleen effector T-cellen, maar ook Tregs in de pathogenese van colitis29 te onderzoeken.
Aangezien dit colitismodel echter wordt gemedieerd door darmmicrobiota-specifieke T-cellen, is een beperking voor dit colitismodel dat de duur van de inductie van colitis kan variëren in verschillende dierlijke faciliteiten, afhankelijk van de darmmicrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen enkele auteur heeft tegenstrijdige financiële, professionele of persoonlijke belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-beurzen DK125011, AI150210 en DK124132, de University of Texas System STARs-prijs (Y.C.) en het James W. McLaughlin Fellowship Fund van the University of Texas Medical Branch in Galveston (W.Y.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
