Summary
I detta protokoll beskrivs en gut microbiota antigen-specifika T cell adoptiv överföring kolit modell. CD4+ T-celler är isolerade från CBir1 TCR transgena möss. Dessa är specifika för ett immunodominant tarmmikrobiotaantigen CBir1 flagellin, som överförs till mottagaren Rag1-/- möss, vilket leder till tarminflammation.
Abstract
Med ökningen av incidensen medför inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), som är kroniska sjukdomar som påverkar mag-tarmkanalen, en betydande hälso- och ekonomisk börda för individer och samhälle. Därför är det viktigt att undersöka mekanismerna bakom patogenesen och utvecklingen av IBD. Här beskrivs en gut microbiota antigen-specifika T cell överföring kolit modell. CBir1 flagellin har erkänts som immunodominant gut bakteriell antigen i experimentell kolit och patienter med Crohns sjukdom. CBir1 TCR transgena nave CD4 + T-celler, specifika för CBir1 flagellin, kan inducera kronisk kolit efter adoptivöverföring till immunbrist Rag1-/- möss. Sjukdomen allvarlighetsgrad bedöms av histopatologi. CD4 + T cell fenotyper i colonic lamina propria bestäms också. Denna modell liknar nära utvecklingen av IBD, som ger en idealisk murin modell för att undersöka mekanismerna som driver patogenesen vid IBD och testa de potentiella läkemedlen för behandling av IBD.
Introduction
Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), främst inklusive Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC), kännetecknas av kronisk, skovvis förlöpande inflammation i mag-tarmkanalen, som påverkar miljontals över hela världen1. Flera faktorer har varit inblandade i utvecklingen och patogenesen vid IBD, inklusive genetisk känslighet, tarmfloran, immunsvar, kost och livsstil2. Den exakta mekanismen för IBD är dock fortfarande inte helt förstådd.
Ett av de särskilda intressena är interaktionen mellan tarmfloran och värd immunsvar vid reglering av tarminflammation3. Tarmfloran ger en serie immunstimulerande molekyler och antigener, som kan aktivera immunsvar4. Medan balansen mellan effektor T-celler och regulatoriska T-celler (Tregs) är avgörande för att upprätthålla intestinal homeostas, bidrar det överdrivna intestinala mukosala CD4 + T-cellssvaret på tarmmikrobiotaantigener till tarminflammation5,6,7. Som immunodominant tarm microbiota antigen, CBir1 flagellin har varit relaterade till patogenesen vid mänskliga CD8,9. Dessutom inducerar överföring av CBir1 TCR transgena (Tg) T-celler intestinal inflammation i immunbrist möss6, som liknar den mänskliga IBD, vilket indikerar att denna T-cellöverföringsmodell hjälper till att undersöka mekanismerna hos mänsklig IBD.
Detta arbete beskriver det detaljerade protokollet för att inducera kolit i Rag1-/- möss genom adoptiv överföring av CBir1 TCR Tg nave CD4 + T celler och bedöma sjukdomen allvarlighetsgrad. Dessutom visas de förväntade resultaten, och de kritiska stegen i förfarandet och felsökningen diskuteras, vilket kommer att hjälpa forskare att undersöka mekanismerna för patogenes vid tarminflammation och testa de potentiella läkemedlen för behandling av IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer utfördes enligt University of Texas Medical Branch's Committee on the Use and Care of the animals. CBir1 TCR Tg möss tillhandahölls av Dr. Charles Elson vid University of Alabama i Birmingham. CBir1 TCR Tg möss kan vara kvinnliga eller manliga men bör vara vid 8-12 veckor. Rag1-/- möss på C57BL/6 bakgrund erhölls från Jackson Laboratory10. Rag1-/- möss måste vara köns- och åldersmatchade, och antingen hane eller kvinna kan användas men bör vara vid 8-12 veckor. Hela protokollet sammanfattas i figur 1.
1. Beredning av mottagarmössen
- Förbered Rag1-/- möss på C57BL/6-bakgrunden, uppfödda i samma specifika patogenfria djuranläggning. Beräkna antalet möss per grupp efter effektanalys11.
OBS: Rag1-/- möss har inte mogna T-celler och B-celler10. - Markera mössen med öronslag.
- Väg mössen på samma dag som T-cellöverföringen.
2. Beredning av reagenser och lösningar
OBS: De reagenser som används är giftiga eller biofarliga och deras hantering behöver försiktighetsåtgärder och säkerhetsåtgärder.
- Förbered tvättbuffert: tillsätt 5 ml 100x Penicillin-Streptomycin i 500 ml RPMI 1640 medium. Blanda den noggrant och förvara den vid 4 °C.
- Förbered Tris-NH4Cl Lysis Buffer.
- Förbered lösningsdel A. Lös upp 2,06 g Tris-basen i 100 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och justera pH-värdet till 7,2 med HCl.
- Förbered lösningsdel B. Lös upp 7,47 g NH4Cl i 800 ml ddH2O.
- Blanda A och B noggrant. Mät pH-värdet och justera det till 7,2 om inte.
- Justera den totala volymen till 1000 ml. Autoklav och förvara den sedan vid 4 °C.
- Förbered isoleringsbufferten.
- Tillsätt 2,5 g BSA och 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 500 ml 1x PBS. Blanda det noggrant.
- Filtrera lösningen genom ett vakuumdrivet engångsfilter på 0,22 μm (se Materialtabell). Förvara den vid 4 °C.
- Förbered FACS-bufferten. Tillsätt 1 ml FBS och 50 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 50 ml tvättbuffert (beredd i steg 2.1). Blanda ordentligt och förvara den vid 4 °C.
- Förbered Complete Medium. Tillsätt 5 ml FBS i 45 ml tvättbuffert. Blanda ordentligt och förvara den vid 4 °C.
- Förbered EDTA-PBS-bufferten.
- Beräkna volymen för den EDTA-PBS-buffert som behövs. Volym (mL) = musnummer x 20.
- Lägg till lämplig volym FBS, EDTA och HEPES i PBS (2 % av FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES i PBS) (se Tabell över material).
- Blanda den noggrant och förvärmd i ett vattenbad på 37 °C.
- Förbered matsmältningsbufferten.
- Beräkna volymen på digestionsbufferten som behövs. Volym (mL) = musnummer x 10.
- Tillsätt lämplig volym FBS, Collagenase IV och DNase I i tvättbuffert (2% av FBS, 0,5 mg/ml kollagenas IV och 10 U/ml DNase I i tvättbuffert) (se Tabell över material).
- Blanda den noggrant och förvärmd i ett vattenbad på 37 °C.
- Förbered Percoll Solution.
- Förbered 100% Percoll. Tillsätt 5 ml 10x PBS i 45 ml original Percoll (se Materialtabell).
- Förbered 2% FBS i tvättbuffert. Tillsätt 1 ml FBS i 49 ml tvättbuffert.
- Kaukaulera volymen på 40 % Percoll Solution och 75 % Percoll Solution. Volym på 40% Percoll Solution (mL) = musnummer x 4; Volym på 75% Percoll Solution (mL) = musnummer x 2.
OBS: De reagenser/lösningar som bereds i steg 2.1-2.5 kommer att användas i steg 3-4, och de som bereds i steg 2.6-2.8 kommer att användas i steg 9. Alla reagenser/lösningar som används i steg 9 ska vara nyberedda. Att göra 5 % extra buffert rekommenderas för alla steg.
3. Isolering av mjälte CBir1 TCR Tg CD4 + T-celler
- Avliva CBir1 TCR Tg mus/möss genom en livmoderhalscancer förskjutning med CO2 dödshjälp (30%-70% gas-luft deplacement). Blöt mössen med 70% etanol.
- Utför ett ~ 1 cm vänster buksnitt, dra huden bort från bukmuskelvävnaden, gör ett ~ 3 cm snitt i bukmuskelvävnaden och ta bort mjälten med steril sax och tång. Placera mjälten i en odlingsfat som innehåller 5 ml förkyld tvättbuffert (beredd i steg 2.1).
- Slipa mjälten med den grova ytan av två sterila glasrutschbanor. Överför cellfjädringen till ett 50 ml centrifugrör genom att passera genom en 100 μm cellsil (se Materialtabell). Skölj glasrutschbanorna och odlingsfatet med 5 ml förkyld tvättbuffert och överför tvättbufferten till röret.
- Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna med 5 ml förvärmd Tris-NH4Cl Lysis Buffer (beredd i steg 2,2) per mjälte. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur. Tillsätt 10 ml förkyld tvättbuffert i röret.
- Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna med 10 ml förfrysningsbuffert (beredd i steg 2.3).
- Räkna cellerna. Blanda 10 μL cellfjädring med 10 μL trypanblått noggrant. Ladda 10 μL av blandningen på en bild, sätt in bilden i den automatiska cellräknaren (se Materialtabellen) och få det livskraftiga cellnumret12.
OBS: Cirka 1 x 108 celler kan erhållas från en donatormus i detta steg. - Centrifugera den återstående cellfjädringen från steg 3,6 vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kassera alla supernatanter.
- Virvel antimus CD4 magnetiska partiklar noggrant (se Tabell över material), tillsätt direkt 50 μL av partiklarna per 107 celler och blanda med cellpellets noggrant. Inkubera i 30 min vid 4 °C.
OBS: Alla andra kommersiella CD4 + T-cellsberikningssatser kan användas här. - Överför cellpartikelsuspensionen till ett sterilt uppsamlingsrör. Tillsätt 3,5 ml isoleringsbuffert före kyla i röret.
- Placera röret på cellseparationsmagneten (se Materialtabell) i 8 min vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt av supernatanten med en 3 mL Transfer Pipette.
- Ta bort röret från cellseparationsmagneten (se Materialtabell), återanvänd cellerna med 3,5 ml isoleringsbuffert före kyla och placera röret på magneten i 4 minuter vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt av supernatanten med en 3 mL Transfer Pipette.
- Upprepa steg 3.11.
- Återanvänd cellerna med 1 ml förkyld FACS-buffert (beredd i steg 2.4).
4. Rening av CBir1 TCR Tg nave CD4 + T-celler
- Räkna cellerna efter steg 3.6.
- Om cellkoncentrationen är >107/ml, tillsätt en volym FACS-buffert för att se till att cellkoncentrationen är ≤ 107/ml.
OBS: ~1 × 107 celler kan erhållas från en donatormus i detta steg. - Färga ytmarkörerna med 10 μL antimus-CD4-APC, 10 μL antimus-CD25-Percp/Cy5.5 och 10 μL antimus-CD62L-PE13,14 (se materialförteckning). Blanda försiktigt och inkubera i 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna med 2 ml förkyld FACS-buffert. Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera alla supernatantsusing en 3 mL Överföring Pipette.
- Upprepa steg 4.4.
- Återanvänd cellerna till koncentrationen 40 x 106/ml i förkyld FACS-buffert.
OBS: För att förhindra att sorteraren täpper till, skicka cellerna genom en 70 μm sil. - Tillsätt 0,1 μg/ml DAPI.
OBS: DAPI används för att utesluta de döda cellerna. - Förbered 15 ml centrifugrör som innehåller 4 ml complete medium (beredda i steg 2.5) för insamling av de sorterade cellerna.
- Ladda cellerna på sorteraren. Sortera enstaka livskraftiga naϊve CD4+ T-celler (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+-celler) i renhetsläge (Munstycksstorlek: 70 μm; Tryck: 70 PSI; Händelsefrekvens: 8000-12000 händelser/händelser; Effektivitet: högre än 90 %) (figur 2).
OBS: Naϊve CD4 + T-celler uttrycker högt uttryck för CD62L och saknar aktiveringsmarkören CD2513,14. - Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera alla supernatanter med en 3 mL Transfer Pipette.
- Återanvänd cellerna i 500 μL 1x PBS.
- Räkna celler efter steg 3.6
OBS: ~5 × 106 celler kan erhållas från en donatormus i detta steg.
5. Cellöverföring till mottagarmössen
- Återanvänd CBir1 TCR Tg nave CD4+ T-cellerna till 5 x 106/ml-koncentrationen genom att tillsätta 1x PBS.
- Värm trasan-/- mössen under en värmelampa (se Materialtabell) i 4 minuter och håll fast mössen med hjälp av en mushållmedel.
- Överför intravenöst 200 μL av cellupphängningen till svansvenen hos Rag-/- möss med en 1 ml insulinspruta (27 G) (se Materialtabell).
OBS: Celler från en donatormus räcker för att överföra till cirka fem mottagarmöss.
6. Övervakning av kliniska tecken under kolitprogression
- Väg mössen varje vecka och öka observationen till två gånger i veckan när mössen börjar förlora >5% av ursprungliga vikter.
- Observera mössens respons/rörelse när de stimuleras försiktigt.
- Observera andra kliniska avvikelser. hållning och avföringskonsistens.
7. Kolonsamling och histopatologisk poängsättning
- Offra mottagarmössen genom en livmoderhalscancer förskjutning med CO2 vid en tidpunkt av viktminskningen >20% av originalvikten eller 6 veckor efter cellöverföring. Blöt mössen med 70% etanol.
- Utför ett ~ 1 cm ventralt mittlinje hudsnitt, dra huden bort från bukmuskelvävnaden, gör ett ~ 3 cm snitt i bukmuskelvävnaden, identifiera cecum och ta bort hela tjocktarmen med steril sax och tång. Blöt tjocktarmen med förkyld PBS i en odlingsfat.
- Incise tjocktarmen på längden och skölj den med förkyld PBS. Skär 1/3 av tjocktarmen längsgående.
- Placera kolonremsan i en pappershandduk med den självlysande sidan vänd uppåt. Utför schweizisk rullning med en tandpetare15.
- Placera tjocktarmen Schweiz i en kassett och lägg kassetten i 10% buffrat formalin för 24 h16, följt av uttorkning med hjälp av en automatiserad processor (se Materialtabell) och paraffininbäddning.
- Skär 5 μm vävnadssektioner på en mikrotom, monterad på diabilder, och utför hematoxylin- och eosinfläcken (H&E) ( se Materialtabell).
- Bestäm histopatologiska poäng genom att kombinera poängen för var och en av de sex parametrarna för högst 12. Lamina propria inflammation (normal, 0; mild, 1; måttlig, 2; svår, 3); bägare cellförlust (normal, 0; mild, 1; måttlig, 2; svår, 3); onormal krypta (normal, 0; hyperplastisk, 1; oorganisering, 2; kryptförlust, 3); crypt abscesses (frånvarande, 0; närvarande, 1); slemhinnans erosion och sårbildning (normal, 0; mild, 1; måttlig, 2; svår, 3); och submukosal förändring (ingen, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Isolering och färgning av intestinala lamina propriaceller
- Efter steg 7.3, skär ytterligare 2/3 av tjocktarmen i 0,5-1 cm bitar och tvätta den med förkyld PBS.
- Överför kolonsegmenten till 20 ml förvärmd EDTA-PBS-buffert i ett 50 ml centrifugrör. Inkubera vid 37 °C med 250 varv/min skakningar i 30 min.
- Virvla röret, kassera supernatanterna genom att passera det genom en steril sikt (diameter: 0,01 tum) och återanvänd kolonsegmenten i 20 ml förkyld PBS i 50 ml-röret.
- Upprepa steg 8.3 två gånger.
- Placera kolonsegmenten i ett C-rör (se Materialtabell) som innehåller 10 ml förvärmd rötningsbuffert.
- Placera röret på en dissociatormaskin (se Materialtabell) och inkubera under programmet "37C_m_LPDK_1" i 25 minuter.
OBS: "37C_m_LPDK_1" är ett standardförinställt program i dissociatormaskinen som används för att röra om proverna och hålla dem vid 37 °C. - Kontrollera om vävnaden smälts helt, vilket innebär att ingen bit vävnad finns i matsmältningsbufferten. Om inte, upprepa programmet "37C_m_LPDK_1".
- Samla supernatanten genom att passera genom en metallsikt och 100 μL sil. Skölj med 10 ml förkyld PBS.
- Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera alla supernatanter.
- Återanvänd cellerna i 4 ml 40% Percoll Solution och blanda den noggrant (beredd i steg 2.8).
- Överför de återsuspenderade cellerna till 2 ml 75% Percoll-lösning i ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellfjädringen vid 850 x g i 20 min vid 20 °C (Accelerationsramp: 0; Bromsramp: 0).
- Ta försiktigt bort fett på det övre lagret med en 3 ml överföringspipett och överför cellskiktet till 20 ml tvättbuffert i ett 50 ml-rör.
- Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kassera alla supernatanter och återanvänd celler i 1 ml slutfört medium.
- Räkna cellerna efter steg 3.6.
- Frö cellerna i en 24-välplatta, aktivera dem med 50 ng/mL Phorbol-12-myristat 13-acetat och 750 ng/mL jonomycin i 2 timmar, följt av inkubation med 5 μg/ml Brefeldin A för 3 h (se Materialtabell).
OBS: De reagenser som används är giftiga och deras hantering kräver försiktighetsåtgärder och säkerhetsåtgärder. - Överför cellerna till ett FACS-rör, tillsätt 2 ml FACS-buffert och centrifugera cellerna vid 350 x g i 8 minuter vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Inkubera cellerna med 12,5 μg/ml antimus-CD16/3219 i (se Materialtabell) FACS-buffert för att blockera Fc-receptorer i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Fläck för levande/död och ytmarkör.
- Tvätta cellerna med 2 ml FACS-buffert och centrifugera dem vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Färga cellerna med levande färgämnen och ytmarkörer (dvs. antimus-CD3 och antimus CD4-antikroppar)20 (se Tabell över material) i FACS-buffert vid den optimerade koncentrationen i 30 min vid 4 °C i mörker.
OBS: De reagenser som används är giftiga och deras hantering kräver försiktighetsåtgärder och säkerhetsåtgärder.
- Utför cellulär och nukleär färgning.
- Tillsätt 2 ml FACS-buffert och centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Permeabilisera och fixera cellerna genom att återanvända cellerna med 200 μL transkriptionsfaktorfixarbetslösning (se Tabell över material) i 40 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 ml Perm-buffert och centrifugera cellupphängningen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Inkubera cellerna med cellulära och nukleära markörer (dvs. antimus IFNγ, antimus IL-17A och antimus Foxp3-antikroppar)20 i Perm-buffert (se Materialtabell) i 30 min-1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 ml Perm-buffert och centrifugera cellupphängningen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Tillsätt 1 ml FACS-buffert och centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 8 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Återanvänd celler med 200 μL FACS-buffert och kör proverna på en flödescytometer (se Materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cirka 5 x 106 CBir1 TCR Tg nave CD4 + T celler per mjälte isolerades från en vuxen CBir1 TCR Tg mus. Överföring av CBir1 TCR Tg nave CD4 + T-celler inducerad kronisk kolit hos mottagare Rag1-/- möss. Efter cellöverföring övervakades kliniska tecken för att utvärdera utvecklingen av intestinal inflammation, inklusive viktminskning, avföring konsistens och hunched hållning. Som förväntat började möss gå ner i vikt cirka tre veckor efter cellöverföring, och vikten nådde cirka 80-85% av originalvikten sex veckor efter cellöverföring (figur 3). Dessutom visade möss diarré runt 3-4 veckor efter cellöverföring och visade hunched hållning när de utvecklade svår kolit. Brutto morfologi av kolon visades, och kolitis allvarlighetsgrad bedömdes av histopatologiska poängen när möss offrades. Möss som fick CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T-celler visade kort kolonlängd 6 veckor efter cellöverföring (figur 4A). De mottagande mössen visade mer cell infiltration i intestinala lamina propria 4 veckor efter cell överföring (figur 4C), bägare cell förlust och intestinal epitelial cell hyperplasi 5 veckor efter cell överföring (figur 4D), och slemhinnan erosion och inflammatorisk cell infiltration i submucosa av kolon 6 veckor efter cell överföring (figur 4F). Samtidigt fanns det ingen inflammation hos Rag1-/- möss som fick PBS ensam (figur 4B). Dessutom finns det ingen inflammation i tunntarmen, men cecum har inflammation. Dessutom, CD4 + T cell fenotyper i colonic lamina propria fastställdes av flöde cytometri. Gatingstrategin visas (figur 5A-E). CBir1 TCR Tg nave CD4 + T-celler utvecklade till IFNγ + Th1-celler, IL-17A + Th17-celler, IFNγ + IL-17 + CD4 + T-celler (figur 5F) och Foxp3 + Treg-celler i intestinala laminaproprier av Rag1-/- mottagare (figur 5G).
Figur 1: Förfarandet för induktionskolit och bedömning av sjukdomens svårighetsgrad. Splenic CD4 + T celler isolerades från CBir1 TCR transgena möss med magnetiska pärlor, och sedan naϊve T celler renades genom sortering. CBir1 TCR transgena nave T celler överfördes sedan intravenöst till mottagare Rag1-/- möss. När mössen offrades runt sex veckor efter cell överföring, kolitis allvarlighetsgrad bedömdes av histopatologiska poäng. CD4 + T cell fenotyper i colonic lamina propria fastställdes av flöde cytometri. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Gitterstrategin för sortering av CBir1 TCR transgena T-celler. Livskraftiga enskilda CBir1 TCR transgena nave T-celler renades genom att utesluta skräp (A), icke-enstaka celler (B-C), döda celler (D) och aktiverade celler (E-F). Delpopulationen visades i (G). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Viktförändringar av Rag1-/- möss efter T-cellöverföring. Musvikter registrerades varje vecka. Data presenterades i medelvärde ± SD; Studentens t-test; p<0.001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Den grova morfologin och hematoxylin- och eosinfärgningen av tjocktarmen från Rag1-/- möss som får CBir1 TCR transgena T-celler. (A) De mottagande mössen offrades sex veckor efter cellöverföring och kolonets bruttomorfologi visades. (B-E) De mottagande mössen offrades vid olika tidpunkter, och Rag1-/- möss fick PBS som kontroller. Kolon bearbetades för Hematoxylin och eosin färgning. Representativa bilder av Hematoxylin och eosinfärgning av tjocktarmen visas. Skala bar = 200 μm. (F) Histopatologiska poäng fastställdes. Data presenterades i medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: CD4+ T-cellsfenotyperna i colonic lamina propria av Rag-/- möss som får CBir1 TCR transgena nave T-celler. När de mottagande mössen offrades 6 veckor efter cell överföring, koloniska lamina propria celler isolerades för färgning CD4 + T cell fenotyper. (A-E) Gating strategi för analys av T-cells fenotyper. (F-G) (F) IL-17A+ CD4+ T-celler, IFNγ+ CD4+ T-celler, IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-celler och (G) Foxp3+ Tregs bestämdes av flödescytometri. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om varje steg är viktigt för reproducerbarheten av denna kolitmodell, finns det flera kritiska steg. Mottagaren Rag-/- möss bör få tillräckliga livskraftiga naϊve CD4 + T-celler för att inducera tarminflammation. Vi använde mjältar för isolering av naiva CD4 + T-celler istället för MLN. Eftersom utbytet av naiva CD4 + T-celler i MLN är mycket lägre än i mjältar. CD62L uttrycks starkt i naiva T-celler, och CD44 och CD25 är aktiveringsmarkörerna för T-celler13,14. I denna studie använde vi först anti-CD4 magnetiska pärlor för att isolera CD4 + T celler från mjältar. Sedan använde vi kombinationen av anti-CD4, anti-CD62L och anti-CD25 antikroppar för isolering av naiva CD4 + T-celler13,14. Forskare kan använda andra markörer för att sortera de naiva CD4 + T-cellerna. CD45RBhi är också markör för naiva T-celler. CD45RBhi CD25- CD4+ T-celler används ofta som naiva T-celler av vilda icke-TCR transgena T-celler23. Därför är teknikerna för sortering av celler och intravenös injektion av T-cellerna i mottagarmössen viktiga. Att konfigurera gating-protokollet som en mall är användbart för att påskynda experimenten med färre fel. För att undvika celldöd bör cellerna alltid hållas på is. Dessutom rekommenderas färgning av celler med DAPI för att utesluta döda celler eftersom DAPI inte kan passera över intakta cellmembran, vilket gör det till en utmärkt död cell sond24. Uppvärmning av mössen för att stimulera utvidgning av svansvenerna ger bättre vensynlighet för intravenös injektion. Alla procedurer rekommenderas att utföras av utbildade forskare.
Många faktorer kan påverka resultatet av kolitmodellerna, som måste uppmärksammas. Först ska mottagaren Rag1-/- möss vara ålders- och könsmatchade. I CELLÖVERFÖRINGSMODELLEN CD45RBhi T kan T-celler från manliga och kvinnliga donatorer överföras till manliga Rag-/- mottagare, medan endast kvinnliga donatorer kan användas vid användning av kvinnliga mottagare23. Vi ser dock ingen signifikant skillnad mellan manliga och kvinnliga mottagare. Mottagarmössen kan vara antingen honor eller hanar, och T-celler från manliga donatorer kan också inducera kolit hos kvinnliga mottagare. Eftersom viktförändring är en värdefull indikator på kolitprogression rekommenderas att använda mottagarmössen mellan 8-12 veckor för att presentera en stabil viktlinje. Dessa mottagarmöss bör födas upp och hållas i samma rum i djuranläggningen eftersom mikrobiota är avgörande för att reglera kolitutveckling25. Tiden att utveckla kolit varierar när man överför olika antal CBir1 TCR Tg naiva CD4 T-celler. Som förväntat kräver färre celler en längre tid för induktion av kolit, och ett högre antal celler kräver kortare tid för induktion av kolit. Användning av 1 x 106 celler per mottagarmus rekommenderas eftersom de mottagande mössen visar kliniska tecken på kolit ~ 2-3 veckor efter cellöverföring och utvecklar relativt svår kolit ~ 6 veckor efter cellöverföring. Dessutom, jämfört med intraperitoneal injektion, intravenös injektion av celler i svansvenen inducerar mer konsekvent kolit. För isolering av colonic lamina propria celler får kolonvävnaderna inte bli torra; Annars skulle det minska cellernas avkastning och livskraft. Ett av de särskilda farhågorna är att kolitens varaktighet skulle ändras om de mottagande mössen överförs med genetiskt modifierade CBir1 TCR Tg T-celler eller behandlas med läkemedel26. Dessutom inducerar CBir1 TCR Tg T-celler också tarminflammation hos andra immunbrist möss, såsom TCRβ/δ-/- möss, som saknar T-celler27.
Som ackumulerande bevis indikerar en avgörande roll av gut bakteriell antigen-specifika reaktiva T-celler i patogenesen vid IBD, med hjälp av T-celler som är specifika för en definierad gut bakteriell antigen kommer att ge insikter om hur gut bakteriell antigen inducera T cell svar för att inducera kolit. Gut microbiota antigen CBir1 flagellin är rikligt i mag-tarmkanalen, som är relaterad till patogenesen vid IBD8,9. Denna kolit modell liknar flera kritiska egenskaper hos IBD, inklusive diarré, viktminskning, histopatologiska konstaterande och onormal intestinala immunsvar. Därför är denna kolitmodell användbar för att studera mekanismerna hos mänsklig IBD och ger ett verktyg för att utvärdera behandlingarna för IBD. Intressant nog visade det senaste arbetet av Chiaranunt et al. att T-cells specificitet till microbiota CBir 1 antigen ensam kanske inte är tillräckligt för att inducera T-cellsaktivering och kolit. Detta framgår av de vilda CBir1 TCR Tg T-cellerna inducerad kolit hos Rag-/- mottagare, medan Rag-/- CBir1 T-celler inte inducerade kolit i sin djuranläggning, vilket tyder på att tarm T-celler som svarar på specifika tarmbakterieantigen kan kräva att andra relaterade kommensala bakterier, till exempel Helicobacter spp, fungerar som en adjuvant28 . En spännande aspekt av denna modell är att olika T-cellsundergrupper, nämligen Th1-, Th17- och Treg-celler, finns i lamina propria av colitiska mottagarmöss, vilket ger en unik möjlighet att undersöka rollerna för inte bara effector T-celler utan också Tregs i patogenesen vid kolit29.
Men eftersom denna kolit modell medieras av tarmfloran-specifika T-celler, en begränsning för denna kolit modell är att varaktigheten av induktion av kolit kan variera i olika djuranläggningar beroende på tarmfloran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga författare har motstridiga ekonomiska, professionella eller personliga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health grants DK125011, AI150210 och DK124132, University of Texas System STARs award (Y.C.) och James W. McLaughlin Fellowship Fund från University of Texas Medical Branch i Galveston (W.Y.). Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
