Summary
यह लेख कॉर्निया की शारीरिक रचना और हिस्टोलॉजी और इसकी उपचार प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित एक नए पशु मॉडल का वर्णन करता है। यह नया पशु मॉडल मंगोलियाई गेरबिल का उपयोग करता है, जिसमें मानव कॉर्निया के साथ कई समानताएं हैं।
Abstract
कॉर्नियल घाव भरने के अध्ययन लंबे समय से आयोजित किए गए हैं और पीड़ा को कम करने और उपचार विकसित करने में मदद की है जो रोगियों के आंखों के स्वास्थ्य में सुधार करने में योगदान करते हैं। ऐतिहासिक रूप से, चूहों और चूहों जैसे कृन्तकों में कॉर्नियल उपचार का अध्ययन किया गया है, लेकिन ये मॉडल पूरी तरह से मानव विकारों की नकल नहीं कर सकते हैं। हालांकि, अन्य कृन्तकों जैसे मंगोलियाई गेरबिल्स (मेरिओन्स अनगुइकुलस) के बारे में जानकारी कॉर्नियल अनुसंधान में बहुत कम है।
यहां, हम फोटोरेफ्रेक्टिव केराटेक्टॉमी के बाद कॉर्नियल उपचार का अध्ययन करने के लिए एक नया पशु मॉडल विकसित करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। उनुगुइकुलटस के कॉर्निया पर उपलब्ध सीमित साहित्य के कारण, हम सामान्य कॉर्निया के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का भी वर्णन करते हैं। आनुवंशिकी, शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के संदर्भ में मंगोलियाई गेरबिल और मनुष्यों के कॉर्निया के बीच समानता के कारण इन शोध तकनीकों को आंखों के रोगों के अध्ययन में भी नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
कॉर्नियल घाव भरने के कुछ सबसे महत्वपूर्ण पहलू, जो पूर्वकाल खंड सर्जरी के लिए महत्वपूर्ण चिंताएं हैं, उपकला वास्तुकला की अखंडता, कॉर्नियल स्ट्रोमा पारदर्शिता का रखरखाव, और अंत में, कॉर्निया1 के अपवर्तक गुणों के संदर्भ में परिणाम हैं।
कॉर्निया नेत्रगोलक के सामने सबसे बाहरी स्पष्ट ऊतक है और इसलिए, आघात, संक्रमण और जलने के लिए अतिसंवेदनशील है; इन घावों का बिगड़ा हुआ उपचार दृश्य स्वास्थ्य से समझौता करसकता है 2.
वर्तमान में, कॉर्नियल उपचार का अध्ययन करने के लिए कई पशु मॉडल उपलब्ध हैं, और उनमें से कुछ प्रजातियोंऔर अध्ययन किए जाने वाले तंत्र के प्रकार के आधार पर दूसरों की तुलना में बेहतर हैं। गेरबिल्स2 के रेटिना पर पिछली जांच के कुछ रिकॉर्ड हैं। हालांकि, अब तक, इन कृन्तकों के कॉर्निया में स्कारिंग प्रक्रियाओं पर कोई प्रकाशित साहित्य नहीं है।
यहां, हम कॉर्निया में घाव भरने के पशु मॉडल के रूप में मेरिओन्स अनगुइकुलस (मंगोलियाई गेरबिल) को प्रस्तुत करते हैं। फोटोरेफ्रेक्टिव केराटेक्टॉमी के बाद कॉर्नियल उपचार प्राप्त करने की प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है, जो हमें विभिन्न प्रकार की कॉर्नियल स्कारिंग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने, जीवित ऊतक के गतिशील चरणों के संदर्भ में घाव भरने को समझने और अंत में, उपयुक्त भविष्य के उपचार की योजना बनाने की अनुमतिदेता है। फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है जिसमें कॉर्नियल चोट की गहराई और व्यास जैसे मापदंडों को ठीक से नियंत्रित करने की संभावनाहै। इसके अलावा, इस तकनीक को सर्जिकल उपकरणों या रासायनिक समाधानों (जैसे, खारा समाधान, फॉर्मेलिन, अल्कोहल, आदि) के साथ प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है जो उन चर को जोड़ सकते हैं जो उपकरणों के लिए विशिष्ट हैं या प्रक्रिया करने वाले ऑपरेटरके लिए 5।
इस लेख में प्रस्तुत प्रयोग के लिए समान आकार और वजन (लगभग 90 ग्राम) के तीन 6 महीने के पुरुष गेरबिल का उपयोग किया गया था। प्रक्रियाओं को केवल दाईं आंखों में किया गया था। एक गेरबिल (जिसे गेरबिल 1 या नियंत्रण के रूप में संदर्भित किया जाता है) फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी से नहीं गुजरा और सभी सामान्य ओकुलर संरचनाओं का मूल्यांकन करने के लिए एन्यूक्लिएटेड किया गया। फोटोथेरेप्यूटिक केराटेक्टॉमी में कॉर्निया को एक्सिमर लेजर-जनित पराबैंगनी प्रकाश का नियंत्रित वितरण शामिल है और अपवर्तक सर्जरी करने के लिए विकसितकिया गया था। इसका उपयोग अन्य कृन्तकों में किया गया है, जैसे कि चूहे7. अन्य दो गेरबिल्स को फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी के अधीन किया गया था। उनमें से एक को 24 घंटे (गेरबिल 2 के रूप में संदर्भित) और दूसरे को सर्जरी के बाद 96 घंटे (जिसे गेरबिल 3 के रूप में संदर्भित किया जाता है) पर एन्यूक्लिएटेड किया गया था।
इस प्रयोग को करने के लिए, यादृच्छिक रूप से चुने गए एक गेरबिल को प्रत्येक स्थिति का अध्ययन करने के लिए फिल्माया गया था, लेकिन यह प्रयोग पहले प्रत्येक स्थिति के लिए कुल मिलाकर 16 गेरबिल के साथ किया गया था। संपादन कारणों के लिए, एक उदाहरण के रूप में प्रत्येक स्थिति (कुल मिलाकर तीन गेरबिल) के लिए यादृच्छिक रूप से चयनित गेरबिल का उपयोग करने का निर्णय लिया गया था।
इस शोध का मुख्य उद्देश्य उपलब्ध सर्वोत्तम पशु मॉडल का पता लगाना है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी प्रजातियों में मानव आंख8 के समान आंखों की विशेषताएं नहीं हैं। यह लेख मेरिओन्स अनगुइकुलटस के कॉर्निया का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति और कॉर्नियल चोट उत्पन्न करने के लिए की गई प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो हमें उपचार प्रक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी शोध प्रक्रियाओं को Universidad Católica de Cordoba के "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत आयोग" द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद गाइड का पालन किया गया था। इन प्रक्रियाओं को यूनिवर्सिड कैटोलिका डी कॉर्डोबा और "इंस्टीट्यूटो डी ला विज़ियन सेरो" के "संकाय डी सिएनसियास डी ला सलूद" के अधिकारियों द्वारा भी अनुमोदित किया गया था।
1. गेरबिल हैंडलिंग और एनेस्थीसिया
नोट: सभी जानवर विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसएफपी) नर मंगोलियाई गेरबिल थे और उन्हें सेंटर फॉर रिसर्च एंड डेवलपमेंट इन इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शियस डिजीज (सीआईडीआईई) सुविधाओं (कॉर्डोबा, अर्जेंटीना) में रखा गया था। वे Universidad de La Plata (ब्यूनस आयर्स, अर्जेंटीना) से प्राप्त किए गए थे।
- कॉर्नकोब बिस्तर के साथ बिस्तर वाले पॉलीसल्फोन पिंजरों में गेरबिल को सामाजिक रूप से रखें। लिबिटम के लिए पानी की बोतलों में भोजन और फ़िल्टर किया हुआ नल का पानी प्रदान करें। सुनिश्चित करें कि कमरे का तापमान सीमा 18 डिग्री सेल्सियस से 24 डिग्री सेल्सियस है और 12: 12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र का उपयोग किया जाता है।
- प्रत्येक गेरबिल को अलग से तौलें, और भ्रम से बचने के लिए प्रत्येक की पहचान करें। गेरबिल की पूंछ के आधार पर एक अमिट स्याही मार्कर के साथ एक निशान बनाएं। गेरबिल के कान को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें और कृंतक के कान पर अमिट मार्कर का उपयोग करके निशान बनाएं। यदि एक प्रयोगशाला और एक बड़ा बायोथेरियम उपलब्ध है, तो संबंधित पहचान के साथ प्रत्येक कृंतक के लिए एक अद्वितीय पिंजरा असाइन करें।
- 70% इथेनॉल समाधान के साथ लैमिनार प्रवाह हुड को कीटाणुरहित करें। हुड के अंदर कार्य क्षेत्र में सुइयों, सिरिंज और रैक सहित सभी सर्जिकल और डिस्पोजेबल उपकरण रखें। हुड में एक डिस्पोजेबल सर्जिकल फोम भी रखें।
- माप की सुविधा के लिए कृंतक को सटीक संतुलन पर रखने के लिए एक छोटे खुले प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग करें।
- इस प्रयोग के लिए समान आकार और वजन (~ 80 ग्राम) के तीन 6 महीने के पुरुष मंगोलियाई गेरबिल का उपयोग करें। एक बार में, प्रत्येक पिंजरे को कृंतक के साथ लामिनार प्रवाह हुड के अंदर रखें। पिंजरों को खोलें, प्रत्येक गेरबिल की पहचान करें, और उन्हें पैमाने पर तौलें।
नोट: गेरबिल हानिरहित लेकिन नाजुक जानवर हैं। गेरबिल को संभालते समय डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें। - गेरबिल को पूंछ से मजबूती से पकड़ने के लिए गैर-प्रमुख हाथ से पकड़ें। कान के पीछे अंगूठे और तर्जनी उंगली के साथ प्रमुख हाथ का उपयोग करें, ताकि उदर क्षेत्र को ऊपर की ओर रखते हुए जानवर को पकड़ सकें। पूंछ को पकड़ने के लिए छोटी उंगली का उपयोग करें।
- एक सिरिंज को 30 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल केटामाइन और ज़ाइलज़िन के साथ भरें। प्रमुख हाथ का उपयोग करके कृंतक (50-100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 2 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन) 9 में एनेस्थीसिया इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित करें। प्रभाव की अवधि लगभग 20-50 मिनट होगी (भिन्नताएं हो सकती हैं)।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि गेर्बिल पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, कॉर्निया में चीरे लगाने से पहले पैर की अंगुली चुटकी, पूंछ चुटकी और कॉर्नियल प्रतिबिंब आदि से जांच करें।
नोट: सभी प्रक्रियाओं को केवल दाईं आंख में करें।
2. कॉर्निया के ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी)
- उपकरण को स्राव या जानवरों के बालों से बचाने के लिए बाँझ सर्जिकल ड्रेप रखें।
- सुनिश्चित करें कि ऑपरेटरों में से एक जानवर को रखता है जबकि दूसरा ऑपरेटर छवियां लेता है। ऑपरेटर को गेरबिल को पकड़ते समय उपकरण पर अपने हाथ रखने चाहिए ताकि गेरबिल की आंख स्थिर हो और अभी भी अध्ययन किया जा सके। ठोड़ी पर गेरबिल को पकड़े हुए हाथ को आराम दें ..
- OCT को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर को प्रारंभ करें, और छवि लें दबाएँ और तब इच्छित छवि सहेजें. कॉर्निया के कई कोरोनल स्लाइस करें। ओसीटी के नीचे आंख की छवि बनाएं, और कृंतक कॉर्निया के पूर्ववर्ती खंड को देखने के लिए कई स्लाइस बनाएं।
नोट: यदि प्राप्त छवि तेज नहीं है और आंख थोड़ी हिल गई है, तो पर्याप्त छवियां प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को कई बार दोहराएं। - ओसीटी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, केंद्रीय और परिधीय क्षेत्रों के पाचीमेट्रिक माप करें। सॉफ़्टवेयर की मुख्य स्क्रीन में, छवि लें दबाएँ, और तब इच्छित छवि सहेजें बटन दबाएँ ।
- सामान्य या नियंत्रित आंख पर माप करें और अन्य कृंतक आंखों पर फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी के तुरंत बाद।
3. एक्सीमर लेजर फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी (पीटीके)
- उपकरण को स्राव या जानवरों के बालों से बचाने के लिए एक्सीमर लेजर डिवाइस पर बाँझ सर्जिकल ड्रेप्स रखें।
- सर्जिकल प्रक्रिया से 5 मिनट पहले इलाज के लिए आंख में सामयिक प्रोपैराकेन हाइड्रोक्लोराइड (0.5%) की एक बूंद डालें।
- गेर्बिल को मजबूती से पकड़ने के लिए गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग करें। प्रमुख हाथ से, जानवर की पलकें खोलें ताकि छवियों को ठीक से कैप्चर किया जा सके। ध्यान केंद्रित करने और एक तेज छवि प्राप्त करने में सक्षम होने के लिए, सुनिश्चित करें कि गेरबिल पकड़ने वाले व्यक्ति के हाथ उपकरण के सिर पर आराम करते हैं। जानवर को पकड़ने वाले हाथों को रखें जहां एक रोगी अपनी गर्दन रखेगा।
- दाईं आंख पर पीटीके एब्लेशन करें। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 60 μm और 62 μm मोटी, 3 मिमी का ऑप्टिकल क्षेत्र, 4 सेकंड की अवधि और कुल 1,867 दालों के बीच एक पृथक्करण।
नोट: पीटीके केवल गेरबिल 2 और गेरबिल 3 पर किया जाता है। इस चरण में, दूसरा ऑपरेटर कॉर्नियल ऊतक को हटाने के लिए लेजर तैयार करता है और सक्रिय करता है। - प्रक्रिया के तुरंत बाद, तस्वीरें लें और इलाज की गई आंखों में सतह परिवर्तनों को रिकॉर्ड और दस्तावेज करने के लिए ओसीटी विश्लेषण करें।
- एक बार प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, कृंतक को पिंजरे में वापस रखें, महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी करें (हृदय गति: 360 बीट प्रति मिनट; मलाशय का तापमान: 37-38.5 डिग्री सेल्सियस; श्वसन दर: 90 सांस प्रति मिनट), और जानवर को संज्ञाहरण से ठीक होने दें।
4. कॉर्नियल पीटीके के बाद गेरबिल्स का जागरण
- इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा से 0.05 मिलीग्राम / किग्रा) और एटिपामेज़ोल (0.1-1 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रबंधन करें।
- प्रत्येक गेरबिल को अपने संबंधित घर के पिंजरे में रखें, और सामान्य जागृति के लिए महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी करें (सामान्य शरीर का तापमान 37-39 डिग्री सेल्सियस है)।
- सतह को साफ रखने और संक्रमण को रोकने के लिए एरिथ्रोमाइसिन मलहम लागू करें। इस प्रक्रिया को दिन में दो बार करें।
- पीटीके के बाद लगातार दो दिनों में एनाल्जेसिया और आंखों के मलहम के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन (हर 6-12 घंटे) को चमड़े के नीचे (0.01-0.05 एमएल) प्रशासित करें।
5. इच्छामृत्यु विधि
- जब भी संभव हो घर के पिंजरे में इच्छामृत्यु करें।
- घर के पिंजरे में संपीड़ित कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) गैस पेश करें। घर के पिंजरे में मौजूदा हवा में जोड़े गए सीओ2 के साथ प्रति मिनट कक्ष मात्रा का 30% -70% की भरने की दर एक मिश्रण को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है जो उद्देश्य को पूरा करती है (10 एल वॉल्यूम चैंबर के लिए, 3-7 एल / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें)। कृंतक की मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए ग्रीवा अव्यवस्था (इच्छामृत्यु की द्वितीयक विधि के रूप में) का उपयोग करें।
- गेरबिल 2 और गेरबिल 3 के लिए सर्जरी के बाद क्रमशः 24 घंटे और 96 घंटे पर, कॉर्नियल उपचार का निरीक्षण करने के लिए नेत्रगोलक (सामान्य नेत्रगोलक और सर्जरी से गुजरने वाले दोनों) के न्यूक्लियेशन का प्रदर्शन करने के लिए जानवर को घर के पिंजरे से हटा दें।
- जानवर को ऑपरेटिंग टेबल पर रखें, और लगभग 1 मिनट के लिए दिल की धड़कन की अनुपस्थिति की जांच करें।
6. आंखों की सर्जरी
- नेत्रगोलक तक पहुंच प्राप्त करने के लिए ऊपरी और निचली पलकें हटा दें। पलकों को हटाने के लिए सर्जिकल फोर्स और कैंची का उपयोग करें। कार्य क्षेत्र का आकार इतना छोटा और नाजुक है कि पलकों को हटाने से नेत्रगोलक को नुकसान पहुंचाए बिना एन्यूक्लिएटेड किया जा सकता है।
- नेत्रगोलक को अलग करने के लिए, बाहरी कैंथस में एक चीरा लगाएं, और कैंची को पीछे की दिशा में मार्गदर्शन करें। नेत्रगोलक को कक्षा से अलग करके आंतरिक कैंथस से इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- नेत्रगोलक के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका को वर्गीकृत करें। यह स्पष्ट किया जाना चाहिए कि इस तकनीक को करते समय पश्चवर्ती कक्षीय जाल आमतौर पर मामूली रक्तस्राव उत्पन्न करता है, जिससे काम मुश्किल हो जाता है।
- किसी भी अवशिष्ट रक्त को धोने के लिए 30 सेकंड से 1 मिनट के लिए बाँझ खारा घोल के साथ नेत्रगोलक को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पेश करें।
- नेत्रगोलक को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें बाद में एनाटोमो-पैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए 10% फॉर्मलाडेहाइड होता है जैसा कि नीचे वर्णित है। कई चित्र और तस्वीरें लें।
7. एनाटोमो-पैथोलॉजिकल विश्लेषण
- 6-24 घंटे के लिए पूरी आंख को 10% बफर फॉर्मेलिन में एम्बेड करें।
- माइक्रोटोम का उपयोग करके ऊतक को काटें। सुनिश्चित करें कि कटे हुए ऊतक की मोटाई 3 मिमी है।
- ऊतक को 30-90 मिनट के लिए 96% अल्कोहल में भिगोएं, और इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
- ऊतक को आइसोप्रोपिल अल्कोहल में 30-90 मिनट के लिए रखें, और इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
- ऊतक को 1-3 घंटे के लिए जाइलीन या जाइलीन विकल्प में रखें।
- ऊतक को तरल मिट्टी के तेल में न्यूनतम 1 घंटे के लिए एम्बेड करें।
- ऊतक को रखने के लिए एक ब्लॉक का उपयोग करें और इसे तरल पैराफिन में एम्बेड करें। इसे जमने दें (इसे ठंडे स्थान पर रखें), और इसे काट लें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेक्शनिंग के लिए माइक्रोटोम तैयार करें।
- इसके बाद, हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन जैसे दाग का उपयोग करें।
- माइक्रोस्कोप में जोड़े गए कैमरे के साथ चित्र प्राप्त करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
वर्तमान अध्ययन में, पूरे कॉर्नियल संरचना का हिस्टोलॉजिकल तकनीकों और पूर्ववर्ती खंड के पूरक अध्ययनों का उपयोग करके पूरी तरह से विश्लेषण किया गया था, जैसे ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी। पूर्ववर्ती खंड संरचनाओं के ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी का उपयोग करके छवि विश्लेषण एक सामान्य उपकला और स्ट्रोमा (चित्रा 1) दिखाता है, जिसमें केंद्रीय और परिधीय कॉर्नियल मोटाई क्रमशः 160 μm और 106 μm ± 2 μm होती है। अन्य प्रकाशनों से यह भी पता चला है कि अन्य कृन्तकों का कॉर्निया परिधि10 की ओर पतला हो जाता है।
पीटीके के बाद, कॉर्नियल एपिथेलियम का विघटन देखा गया (चित्रा 2)। उपचार से पहले और बाद में गेर्बिल आंख की मैक्रोस्कोपिक तस्वीरें भी ली गईं। पीटीके करने के बाद, एक अनियमित कॉर्नियल सतह देखी गई, जिसे फ्लोरेसिन की एक बूंद डालकर और इसे बैंगनी प्रकाश (उपकला अल्सर दिखाते हुए) के साथ रोशन करके दाग दिया गया था (चित्रा 3)।
हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के संबंध में, अनुपचारित गेरबिल (गेरबिल 1) के सामान्य कॉर्निया ने मनुष्यों के समान परतें दिखाईं: कोशिकाओं की चार से छह परतों के साथ स्तरीकृत पूर्ववर्ती उपकला, कॉर्निया की कुल मोटाई का 28% प्रतिनिधित्व करती है, बोमन की परत, स्ट्रोमा, कॉर्निया की कुल मोटाई का 66% प्रतिनिधित्व करती है। और एंडोथेलियम (चित्रा 4 और चित्रा 5)।
गेरबिल संख्या 2 (पीटीके के 24 घंटे बाद) में देखे गए परिवर्तन कॉर्निया में अल्सर, आसन्न पूर्ववर्ती उपकला का स्फेसेलेशन, उपकला एकैंथोलिसिस और पृथक डिस्केराटोसाइट्स के कई धब्बे, तीव्र उपउपकला भड़काऊ घुसपैठ, और स्ट्रोमा के स्तर पर एडिमा थे (चित्रा 6)।
गेरबिल संख्या 3 (पीटीके के 96 घंटे बाद) में देखे गए परिवर्तन गेरबिल नंबर 2 की तुलना में अधिक एडिमा की उपस्थिति, स्ट्रोमल फाइबर और कोशिकाओं का विघटन, पूर्ववर्ती उपकला का पूर्ण उत्थान, और कोई भड़काऊ घुसपैठ नहीं थी (चित्रा 7)।
सारांश में, हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन भड़काऊ घुसपैठ और एडिमा के साथ कॉर्नियल एपिथेलियम और सतही स्ट्रोमा में सामान्य घाव भरने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है।
चित्रा 1: सामान्य कॉर्निया की प्रतिनिधि ओसीटी इमेजिंग। कॉर्निया को इसके पूर्ण आकार में देखा जा सकता है (इसके शीर्ष पर 160 μm की मोटाई माप और परिधि में 108 μm और 110 μm की मोटाई माप के साथ), और पूर्ववर्ती कक्ष, इरिडोकॉर्नियल कोण, आईरिस, और क्रिस्टलीय लेंस (पूर्ववर्ती कक्ष में फैला हुआ) भी देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: कॉर्निया के पूर्व और बाद के पीटीके की प्रतिनिधि ओसीटी इमेजिंग। (बी) पीटीके के 10 मिनट बाद कॉर्नियल छवि। बाईं ओर तीर सेलुलर मलबे के संचय के साथ एक अल्सर के किनारे को दर्शाता है, और दाईं ओर तीर सर्जरी के विशिष्ट कॉर्नियल सतह पर मलबे को भी दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: गेर्बिल (दाईं आंख) के नेत्रगोलक की प्रतिनिधि मैक्रो तस्वीर। (ए) सामान्य नेत्रगोलक की नियमित सतह। (बी) पीटीके प्रदर्शन के 5 मिनट बाद ली गई छवि, कॉर्नियल सतह पर अनियमितताओं को दर्शाती है। (सी) एलईडी प्रकाश स्रोत (बैंगनी) का उपयोग करके 0.25% फ्लोरेसिन के साथ सना हुआ कॉर्नियल अल्सर का सबूत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: एच एंड ई से सना गेरबिल (40x) के पूरे सामान्य कॉर्निया का प्रतिनिधि पूर्ण हिस्टोलॉजिकल खंड (पूर्ववर्ती-पीछे) (ए) परिधीय और केंद्रीय टुकड़े तैयार किए जाते हैं। (बी-डी) कॉर्निया की परिधि कम स्तरीकरण और स्ट्रोमल फाइबर की कम संख्या के साथ एक पतली उपकला दिखाती है। आंकड़ा कॉर्निया की परिधि में थोड़ा अलग एंडोथेलियम दिखाता है, जो तकनीक की एक कलाकृति के कारण है। नतीजतन, परिधीय कॉर्नियल मोटाई केंद्रीय की तुलना में पतली है। (सी) मापी गई मोटाई ओसीटी छवियों के साथ गणना की गई मोटाई के समान है। एपिथेलियम और स्ट्रोमा दोनों कॉर्नियल एपेक्स के स्तर पर अधिक मोटाई दिखाते हैं। स्केल पट्टी 40 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: मंगोलियाई गेरबिल के प्रतिनिधि सामान्य कॉर्निया एच एंड ई (गेरबिल नंबर 1) से सना हुआ है। कॉर्निया की पांच परतें और बरकरार उपकला देखी जाती हैं। स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: एक्सीमर लेजर फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी (पीटीके) (एच एंड ई के साथ सना हुआ) के 24 घंटे बाद प्रतिनिधि कॉर्निया। तीर कॉर्नियल अल्सर (गेरबिल नंबर 2) के किनारे को दर्शाता है। स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: एक्सीमर लेजर फोटोथेराप्यूटिक केराटेक्टॉमी (पीटीके) के बाद प्रतिनिधि कॉर्निया 96 घंटे। एच एंड ई से सना हुआ; गेरबिल नंबर 3. इस आंकड़े में पुनर्जीवित उपकला और स्ट्रोमल एडिमा देखी जाती है। स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कॉर्नियल घाव भरने का शरीर विज्ञान ऊतक पुनर्जनन और होमियोस्टेसिस के रखरखाव के बीच एक संतुलन है। अत्यधिक घाव भरने से फाइब्रोसिस और निशान हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः अंग समारोह का नुकसान हो सकता है। कॉर्नियल सर्जिकल प्रक्रियाओं के तेजी से विकास के साथ, कॉर्नियल घाव भरने और इसमें शामिल शारीरिक और रोग संबंधी घटनाओं को समझने केमहत्व को कम करके नहीं आंका जा सकता है।
कई शोध कार्यों का दावा है कि गेरबिल्स में कई संवेदी विशेषताएं हैं जो उन्हें दृष्टि अध्ययन के लिए एक अनुकूल प्रजाति बनाती हैं, जिसमें मुख्य रूप से दैनिक व्यवहार12 और चूहों या चूहों की तुलना में बेहतर और अधिक तीव्र दृष्टि शामिलहै। उनकी रेटिना संरचना मनुष्यों के समान है। इस कारण से, उन्हें रेटिना परजीवी संक्रमण15, चिकित्सीय दवाओं, जीन वितरण और रेटिना शरीर विज्ञान के अध्ययन के विकास के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, हाल ही में प्रकाशित आनुवंशिक विश्लेषणों से पता चला है कि अधिकांश पहचाने गए गेरबिल जीन (81%) चूहों और मनुष्यों के बीच साझा किएजाते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों ने गेरबिल्स और चूहों और मनुष्यों दोनों के बीच आनुवंशिक समानता का दस्तावेजीकरण किया है, प्रजातियों में महत्वपूर्ण समानता और अंतर की पहचान कीहै। इसलिए, हमने सामान्य कॉर्नियल संरचनाओं और पीटीके स्कारिंग से जुड़ी उनकी पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए गेरबिल्स के वर्तमान पशु मॉडल को चुना।
कई शोधकर्ताओं का तर्क है कि पीटीके कॉर्नियल स्कारिंग का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है क्योंकि यह अन्य पहलुओं के बीच एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं, केराटोसाइट जीवन शक्ति, सेल माइग्रेशन और स्थानीय ऊतक सूजन के अध्ययन की अनुमतिदेता है।
इस काम का महत्व न केवल कॉर्नियल स्कारिंग और घाव भरने के अध्ययन से संबंधित है, बल्कि परिणामों को अन्य पहले प्रकाशित मॉडलों में विस्तारित करने के लिए वैज्ञानिक क्षमता के साथ एक नए पशु मॉडल के प्रस्ताव से भी संबंधित है।
यह पशु मॉडल, मानव आंख के व्यवहार के लिए इसकी समानता और समानता के कारण, विभिन्न रूपों के साथ एक ही प्रोटोकॉल के प्रजनन की अनुमति देता है और अन्य मॉडलों के विकास के लिए एक मिसाल स्थापित करता है, जैसे कि संक्रामक केराटाइटिस और कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन के मॉडल।
हालांकि, इस काम और इस पशु मॉडल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, गेरबिल चूहों, चूहों या खरगोशों जैसे व्यापक पशु मॉडल नहीं है। इस कारण से, वांछित रूप से अधिक अभिकर्मक नहीं हो सकते हैं। दूसरे, गेरबिल्स में नेत्र विज्ञान पर उपलब्ध साहित्य भी बहुत सीमित है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम अपनी अमूल्य मदद और तकनीकी सहायता के लिए इंजीनियर रोड्रिगो डी ला फुएंटे को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वर्णन के लिए मारिया यूजेनिया कोरबेला और आंकड़ों के संस्करण के लिए प्रिसिला हाज़रून को भी धन्यवाद देते हैं। ह्यूगो लुजान ने हमें इम्यूनोलॉजी और संक्रामक रोगों (सीआईडीआईई) में अनुसंधान और विकास केंद्र में सुविधाओं का उपयोग करने की अनुमति दी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
- Kuo, I. C.
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J.
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W.
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S.
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071 (2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903 (2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
