Summary
本文介绍了一种新的动物模型，用于研究角膜的解剖学和组织学及其愈合过程。这种新的动物模型使用蒙古沙鼠，其角膜与人类角膜有许多相似之处。
Abstract
角膜伤口愈合研究已经进行了很长时间，有助于减少痛苦并开发有助于改善患者眼睛健康的治疗方法。从历史上看，已经在小鼠和大鼠等啮齿动物中研究了角膜愈合，但这些模型可能无法完全模仿人类疾病。然而，关于其他啮齿动物如蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）的信息在角膜研究中很少。
在这里，我们描述了一种开发用于研究光屈光性角膜切除术后角膜愈合的新型动物模型的技术。由于关于 无柄分枝杆菌角膜的文献有限，我们还描述了正常角膜的组织学分析。这些研究技术也可以用于眼部疾病的研究，因为蒙古沙鼠的角膜与人类在遗传学、解剖学和生理学方面具有相似性。
Introduction
角膜伤口愈合的一些最重要的方面是上皮结构的完整性，角膜基质透明度的维持，最后是角膜折射特性的结果1。
角膜是眼球前部最外层的透明组织，因此容易受到创伤、感染和烧伤;这些伤口愈合受损会损害视力健康2。
目前，有几种动物模型可用于研究角膜愈合，其中一些比其他模型更好，这取决于要研究的物种和机制的类型1。以前对沙鼠2视网膜的调查有一些记录。然而，到目前为止，还没有关于这些啮齿动物角膜瘢痕形成过程的已发表文献。
在这里，我们将 Meriones unguiculatus （蒙古沙鼠）作为角膜伤口愈合的动物模型。描述了光屈光性角膜切除术后引发角膜愈合的程序，这使我们能够研究不同类型的角膜瘢痕形成过程，根据活组织的动态阶段了解伤口愈合，最后，计划适当的未来治疗3。光疗角膜切除术是一种高度可重复的技术，可以精确控制角膜损伤的深度和直径等参数4。此外，该技术不需要使用手术器械或化学溶液（例如，盐水溶液、福尔马林、酒精等）进行手术，这些手术器械或化学溶液可能会添加特定于器械或执行手术的操作员的变量5。
本文介绍的实验使用了三只大小和重量相似的6个月大的雄性沙鼠（约90克）。这些程序仅在右眼中进行。一只沙鼠（称为沙鼠1或对照）没有进行光疗性角膜切除术，并被摘除以评估所有正常的眼部结构。光疗角膜切除术涉及将准分子激光产生的紫外线控制地输送到角膜，是为了进行屈光手术而开发的6。它已被用于其他啮齿动物，如小鼠7。另外两只沙鼠接受了光疗性角膜切除术。其中一个在手术后24小时（称为沙鼠2）进行剜除，另一个在手术后96小时（称为沙鼠3）进行剜除。
为了进行这个实验，为每个要研究的条件拍摄随机选择的沙鼠，但这个实验以前是用每个条件总共16只沙鼠进行的。出于编辑原因，决定为每个条件使用随机选择的沙鼠（总共三只沙鼠）作为示例。
这项研究的主要目的是探索可用的最佳动物模型。然而，重要的是要注意，并非所有物种都具有与人眼相似的眼睛特征8。本文介绍了用于研究 无柄Mericulatus 角膜的方法以及产生角膜损伤的程序，这使我们能够研究愈合过程。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有研究程序均由科尔多瓦天主教大学的“实验动物护理和使用机构委员会”批准，并遵循国家研究委员会关于实验动物护理和使用指南。这些程序也得到了科尔多瓦天主教大学“健康科学学院”和“塞罗健康研究所”当局的批准。
1. 沙鼠处理和麻醉
注意：所有动物都是特异性无病原体（SFP）雄性蒙古沙鼠，并保存在免疫学和传染病研究与发展中心（CIDIE）设施（阿根廷科尔多瓦）。它们是从拉普拉塔大学（阿根廷布宜诺斯艾利斯）获得的。
- 将沙鼠社交地安置在多砜笼中，笼子上铺有玉米芯床上用品。 随意提供装在水瓶中的食物和过滤自来水。确保室温范围为18°C至24°C，并使用12：12小时的明暗循环。
- 分别称量每只沙鼠，并确定每只沙鼠以避免混淆。在沙鼠尾巴的底部用不可磨灭的墨水记号笔做一个标记。用镊子握住沙鼠的耳朵，并使用啮齿动物耳朵上不可磨灭的记号笔做标记。如果有实验室和大型生物馆，请为每只啮齿动物分配一个独特的笼子，并附上相应的标识。
- 用70%乙醇溶液消毒层流罩。将所有手术和一次性器械（包括针头、注射器和架子）放在引擎盖内的工作区域。在头罩中也放置一次性手术泡沫。
- 使用一个小的开放式塑料容器将啮齿动物保持在精密天平上，以方便测量。
- 使用三只大小和重量相似（~80克）的6个月大的雄性蒙古沙鼠进行本实验。一次一个，将每个笼子和啮齿动物放在层流罩内。打开笼子，识别每只沙鼠，并在秤上称重。
注意：沙鼠是无害但娇弱的动物。处理沙鼠时戴上一次性手套。 - 用非惯用手抓住沙鼠，用尾巴牢牢抓住它。使用惯用手，将拇指和食指放在耳朵后面，握住动物，腹侧区域朝上。用小指握住尾巴。
- 用30 G针头填充注射器，其中含有1mL氯胺酮和甲苯噻嗪。使用惯用手腹膜内将麻醉注入啮齿动物（50-100 mg / kg氯胺酮和2mg / kg甲苯噻嗪）9 。效果的持续时间约为20-50分钟（可能会发生变化）。
- 为确保沙鼠完全麻醉，在角膜切口之前，请先用脚趾捏、尾巴捏和角膜反射等进行检查。
注：仅在右眼中执行所有程序。
2. 角膜光学相干断层扫描（OCT）
- 放置无菌手术单以保护设备免受分泌物或动物毛发的侵害。
- 确保其中一名操作员在另一名操作员拍摄图像时握住动物。操作员在握住沙鼠时应将手放在设备上，以使沙鼠的眼睛尽可能稳定且静止以进行研究。将握着沙鼠的手放在下巴托上。
- 启动控制OCT的软件，然后按 “拍摄 图像”，然后 按“保存所需图像”。对角膜进行多次矢状和冠状切片。在OCT下对眼睛进行成像，并制作多个切片以查看啮齿动物角膜的前段。
注意：如果获得的图像不清晰并且眼睛轻微移动，请重复该过程几次以获得足够的图像。 - 使用OCT软件，对中心和外围区域进行测厚测量。在软件的主屏幕中，按 拍摄图像，然后按 保存所需图像 按钮。
- 对正常或对照眼进行测量，并在另一只啮齿动物眼睛进行光疗角膜切除术后立即进行测量。
3. 准分子激光光疗角膜切除术 （PTK）
- 将无菌手术单放在准分子激光设备上，以保护设备免受分泌物或动物毛发的侵害。
- 在手术前5分钟将一滴局部盐酸丙帕卡因（0.5%）滴入眼睛进行治疗。
- 用非惯用手牢牢握住沙鼠。用惯用手打开动物的眼睑，以便正确捕获图像。为了能够聚焦并获得清晰的图像，请确保握住沙鼠的人的手放在设备的头部。将握着动物的手放在患者放置脖子的地方。
- 对右眼进行PTK消融术。使用以下参数：60 μm 和 62 μm 厚的烧蚀、3 mm 的光学区域、4 s 的持续时间和总共 1，867 个脉冲。
注意：PTK 仅在沙鼠 2 和沙鼠 3 上进行。在此步骤中，第二名操作员准备并激活激光以消融角膜组织。 - 手术后，立即拍照并进行OCT分析，以记录和记录治疗眼睛的表面变化。
- 手术完成后，将啮齿动物放回笼子中，监测生命体征（心率：每分钟360次;直肠温度：37-38.5°C;呼吸频率：每分钟90次呼吸），并让动物从麻醉中恢复。
4.角膜PTK后沙鼠的觉醒
- 通过腹腔注射 给予 丁丙诺啡（0.1mg / kg至0.05mg / kg）和阿替美唑（0.1-1mg / kg）。
- 将每只沙鼠放在各自的笼子里，并监测正常觉醒的生命体征（正常体温为37-39°C）。
- 涂抹红霉素软膏以保持表面清洁并防止感染。每天执行两次此过程。
- PTK后连续两天皮下注射丁丙诺啡（每6-12小时一次）（0.01-0.05mL）用于镇痛和眼膏。
5.安乐死法
- 尽可能在笼子里实施安乐死。
- 将压缩的二氧化碳 （CO2） 气体引入家庭笼子。每分钟腔室体积的 30%-70% 的填充速率，将 CO2 添加到主笼中的现有空气中，足以实现满足目标的混合物（对于 10 L 容积的腔室，使用 3-7 L/min 的流速）。使用颈椎脱位（作为安乐死的次要方法）来确保啮齿动物的死亡。
- 分别在沙鼠2和沙鼠3手术后24小时和96小时，将动物从家笼中取出，进行眼球（正常眼球和正在接受手术的眼球）的眼球摘除术以观察角膜愈合。
- 将动物放在手术台上，检查是否没有心跳约1分钟。
6. 眼科手术
- 取下上下眼睑以接近眼球。使用手术镊子和剪刀去除眼睑。工作区域的尺寸非常小而精致，以至于去除眼睑可以去除眼球而不会损坏它。
- 要去除眼球，请在外眦做一个切口，并将剪刀向后方向引导。通过将眼球与眼眶分开，从内眦重复此过程。
- 将眼球后部的视神经切片。应该澄清的是，在执行这种技术时，眶后丛通常会产生轻微出血，这使得工作变得困难。
- 将眼球引入带有无菌盐水溶液的微量离心管中30秒至1分钟，以洗掉任何残留的血液。
- 将眼球放入含有10%甲醛的微量离心管中，以进行如下所述的后续解剖病理学分析。拍摄多张图像和照片。
7. 解剖病理分析
- 将整个眼睛嵌入10%缓冲福尔马林中6-24小时。
- 使用切片机切割组织。确保切割的组织厚度为 3 毫米。
- 将组织浸泡在96%酒精中30-90分钟，然后重复此过程两次。
- 将组织置于异丙醇中30-90分钟，并重复此过程两次。
- 将组织放入二甲苯或二甲苯替代品中1-3小时。
- 将组织嵌入液体煤油中至少1小时。
- 使用块放置组织并将其嵌入液体石蜡中。让它凝固（放在寒冷的地方），然后切割。
- 根据制造商的说明准备切片机进行切片。
- 随后，使用苏木精和伊红等染色剂。
- 使用添加到显微镜的相机获取照片。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在本研究中，使用组织学技术和前段补充研究（例如光学相干断层扫描）对整个角膜结构进行了彻底分析。使用前节结构的光学相干断层扫描的图像分析显示正常的上皮和基质（图1），中央和外周角膜厚度分别为160μm和106μm±2μm。其他出版物也表明，其他啮齿动物的角膜向外围变薄10。
PTK后，观察到角膜上皮的清创（图2）。还拍摄了治疗前后沙鼠眼的宏观照片。进行PTK后，观察到不规则的角膜表面，通过滴注一滴荧光素并用紫光（显示上皮溃疡）照射其染色（图3）。
关于组织学分析，未经处理的沙鼠（沙鼠1）的正常角膜显示出与人类相同的层：分层前上皮具有四到六层细胞，占角膜总厚度的28%，Bowman层，基质，占角膜总厚度的66%，Descemet膜， 和内皮（图4 和 图5）。
在2号沙鼠（PTK后24小时）观察到的变化是角膜溃疡，相邻前上皮相化，上皮棘松解和分离的异细胞多点，急性上皮下炎性浸润和基质水平的水肿（图6）。
在3号沙鼠（PTK后96小时）观察到的变化是存在比2号沙鼠更大的水肿，基质纤维和细胞的分解，前上皮的完全再生，并且没有炎症浸润（图7）。
总之，组织学染色显示角膜上皮和浅表基质的伤口愈合过程正常，伴有炎症浸润和水肿。
图1：正常角膜的代表性OCT成像。 可以看到角膜的全尺寸（顶点的厚度测量值为160μm，外围的厚度测量值为108μm和110μm），还可以看到前房，虹膜角膜角，虹膜和晶状体（突出到前房）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：PTK前后角膜的代表性OCT成像 。 （A）正常角膜的图像。（B）PTK后10分钟角膜图像。左边的箭头显示了溃疡的边缘，细胞碎片堆积，右边的箭头也显示了手术中典型的角膜表面碎片。 请点击此处查看此图的大图。
图3：沙鼠眼球（右眼）的代表性微距照片 。 （A）正常眼球的常规表面。（B）进行PTK后5分钟拍摄的图像，显示角膜表面不规则。（C）使用LED光源（紫色）用0.25%荧光素染色的角膜溃疡的证据。 请点击此处查看此图的大图。
图4：用H&E染色的沙鼠整个正常角膜（40x）的代表性完整组织学切片（前后）。 （A）外周和中央碎片被框住。比例尺为20μm。 （B-D）角膜的外围显示较薄的上皮，分层较少，基质纤维数量减少。该图显示了角膜外围的内皮略微脱落，这是由于该技术的伪影造成的。因此，外周角膜厚度比中央角膜厚度薄。（C）测量的厚度与使用OCT图像计算的厚度相似。上皮和基质在角膜顶端水平均显示更大的厚度。比例尺为 40 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：用H&E染色的蒙古沙鼠的代表性正常角膜（沙鼠编号1）。 观察角膜的五层和完整的上皮。比例尺为 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：准分子激光光疗角膜切除术（PTK）（用H&E染色）后24小时代表性角膜。 箭头显示角膜溃疡的边缘（沙鼠编号2）。比例尺为 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图7：准分子激光光疗角膜切除术（PTK）后96小时的代表性角膜。 用H&E染色;沙鼠编号 3.在该图中观察到再生的上皮和基质水肿。比例尺为 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
角膜伤口愈合的生理学是组织再生和维持体内平衡之间的平衡。伤口过度愈合可能导致纤维化和疤痕，最终可能导致器官功能丧失。随着角膜外科手术的快速发展，了解角膜伤口愈合以及所涉及的生理和病理事件的重要性不容小觑11。
多项研究工作声称，沙鼠具有许多感官特征，使它们成为视觉研究的有利物种，主要包括昼夜行为12 以及与小鼠或大鼠相比更优越和更敏锐的视力13。它们的视网膜结构更类似于人类14。出于这个原因，它们已被用作视网膜寄生虫感染15，治疗药物，基因传递和视网膜生理学研究的动物模型。此外，最近发表的遗传分析表明，大多数已鉴定的沙鼠基因（81%）在小鼠和人类之间共享16。此外，研究记录了沙鼠与小鼠和人类之间的遗传相似性，确定了物种之间的重要相似性和差异性17。因此，我们选择了目前的沙鼠动物模型来研究与PTK瘢痕形成相关的正常角膜结构及其病理生理过程。
一些研究人员认为，PTK是研究角膜瘢痕形成的理想模型，因为它可以研究凋亡过程，角质细胞活力，细胞迁移和局部组织炎症等方面18。
这项工作的重要性不仅涉及角膜瘢痕形成和伤口愈合的研究，还涉及一种新的动物模型的提出，该模型具有将结果外推到其他先前发表的模型中的科学潜力。
由于其与人眼行为的相似性和相似性，该动物模型允许复制具有不同变体的相同协议，并为其他模型的开发开创了先例，例如感染性角膜炎和角膜新生血管形成模型等。
但是，这项工作和这种动物模型有一些局限性。首先，沙鼠不是老鼠、大鼠或兔子等广泛传播的动物模型。因此，可能没有所需的试剂数量。其次，关于沙鼠眼科的现有文献也非常有限。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢工程师罗德里戈·德拉富恩特的宝贵帮助和技术支持。我们还要感谢玛丽亚·尤金妮娅·科尔贝拉的叙述和普里西拉·哈兹伦的数字版本。雨果·卢汉（Hugo Luján）允许我们使用免疫学和传染病研究与发展中心（CIDIE）的设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
- Kuo, I. C.
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J.
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W.
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S.
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071 (2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903 (2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
