Summary
이 기사는 각막의 해부학 및 조직학과 치유 과정을 연구하기 위해 개발 된 새로운 동물 모델을 설명합니다. 이 새로운 동물 모델은 인간의 각막과 많은 유사성을 가진 각막을 가진 몽골 저빌을 사용합니다.
Abstract
각막 상처 치유 연구는 오랫동안 수행되어 왔으며 고통을 줄이고 환자의 눈 건강 개선에 기여하는 치료법을 개발하는 데 도움이되었습니다. 역사적으로 각막 치유는 생쥐와 쥐와 같은 설치류에서 연구되었지만 이러한 모델은 인간의 장애를 완전히 모방하지 못할 수도 있습니다. 그러나 몽골 저빌 (Meriones unguiculatus)과 같은 다른 설치류에 대한 정보는 각막 연구에서 부족합니다.
여기에서는 광굴절 각막 절제술 후 각막 치유를 연구하기 위한 새로운 동물 모델을 개발하는 기술을 설명합니다. M. unguiculatus의 각막에 대한 제한된 문헌으로 인해 정상 각막의 조직 학적 분석도 설명합니다. 이러한 연구 기술은 유전학, 해부학 및 생리학 측면에서 몽골 저빌의 각막과 인간 사이의 유사성 때문에 안과 질환 연구에도 사용될 수 있습니다.
Introduction
전방 분절 수술의 주요 관심사 인 각막 상처 치유의 가장 중요한 측면 중 일부는 상피 구조의 무결성, 각막 간질 투명성의 유지, 그리고 마지막으로 각막 1의 굴절 특성 측면에서의결과입니다.
각막은 안구 앞쪽의 가장 바깥 쪽 투명한 조직이므로 외상, 감염 및 화상에 취약합니다. 이러한 상처의 치유 장애는 시각 건강을 손상시킬 수 있습니다2.
현재 각막 치유를 연구하기 위해 여러 동물 모델을 사용할 수 있으며, 그 중 일부는 연구 할 메커니즘의 종과 유형에 따라 다른 모델보다 낫습니다1. 저빌2의 망막에 대한 이전 조사에 대한 몇 가지 기록이 있습니다. 그러나 지금까지이 설치류의 각막에있는 흉터 과정에 대한 출판 된 문헌은 없습니다.
여기에서는 각막의 상처 치유의 동물 모델로 Meriones unguiculatus (몽골 저빌)를 제시합니다. 광굴절 각막 절제술 후 각막 치유를 유도하는 절차가 설명되어 다양한 유형의 각막 흉터 과정을 연구하고, 생체 조직의 동적 단계 측면에서 상처 치유를 이해하고, 마지막으로 적절한 향후 치료를 계획할 수 있습니다3. 광선 요법 각막 절제술은 각막 손상의 깊이와 직경과 같은 매개 변수를 정확하게 제어 할 수있는 재현성이 높은 기술입니다4. 더욱이, 이 기술은 기구 또는 시술을 수행하는 조작자에게 특정한 변수를 추가할 수 있는 수술 기구 또는 화학 용액(예를 들어, 식염수, 포르말린, 알코올 등)을 사용한 시술을 필요로 하지 않는다(5).
비슷한 크기와 무게 (약 90g)의 6 개월 된 수컷 저빌 3 개가이 기사에 제시된 실험에 사용되었습니다. 절차는 오른쪽 눈에서만 수행되었습니다. 하나의 저빌 (저빌 1 또는 대조군으로 지칭됨)은 광선치료 각막 절제술을 받지 않았고, 모든 정상 안구 구조를 평가하기 위해 핵 제거되었다. 광선 치료 각막 절제술은 엑시머 레이저 생성 자외선을 각막에 제어하여 전달하는 것을 포함하며 굴절 수술을 수행하기 위해 개발되었습니다6. 마우스7과 같은 다른 설치류에서 사용되었습니다. 다른 두 개의 저빌은 광선 요법 각막 절제술을 받았다. 그 중 하나는 수술 후 24 시간 (저빌 2라고 함)에 핵 제거되었고 다른 하나는 수술 후 96 시간 (저빌 3이라고 함)에 핵이 제거되었습니다.
이 실험을 수행하기 위해 무작위로 선택된 저빌을 연구 할 각 조건에 대해 촬영했지만,이 실험은 이전에 각 조건에 대해 총 16 개의 저빌로 수행되었습니다. 편집상의 이유로 각 조건(총 3개의 저빌)에 대해 무작위로 선택된 저빌을 예로 사용하기로 결정했습니다.
이 연구의 주요 목적은 이용 가능한 최고의 동물 모델을 탐구하는 것입니다. 그러나 모든 종이 인간의 눈과 유사한 눈 특성을 갖는 것은 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다8. 이 기사에서는 Meriones unguiculatus 의 각막을 연구하는 데 사용되는 방법론과 각막 손상을 생성하기 위해 수행 된 절차에 대해 설명하여 치유 과정을 연구 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 연구 절차는 코르도바 카톨리카 대학교의 "실험실 동물 관리 및 사용을위한 기관위원회"의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 연구위원회 가이드를 따랐습니다. 이 절차는 또한 코르도바 카톨리카 대학교의 "Facultad de Ciencias de la Salud"와 "Instituto de la Visión Cerro"의 당국에 의해 승인되었습니다.
1. 저빌 취급 및 마취
참고: 모든 동물은 특정 병원체가 없는(SFP) 수컷 몽골 저빌이었고 면역학 및 전염병 연구 개발 센터(CIDIE) 시설(아르헨티나 코르도바)에 보관되었습니다. 그들은 Universidad de La Plata (아르헨티나 부에노스 아이레스)에서 얻었습니다.
- 옥수수 속대 침구가 깔린 폴리 설폰 케이지에 사회적으로 저빌을 수용하십시오. 음식과 여과 된 수돗물을 물병에 자유롭게 제공하십시오. 실내 온도 범위가 18 °C에서 24 °C이고 12:12 h 명암 사이클이 사용되는지 확인하십시오.
- 각 저빌의 무게를 개별적으로 측정하고 혼동을 피하기 위해 각각을 식별하십시오. 저빌의 꼬리 바닥에 지울 수없는 잉크 마커로 표시하십시오. 핀셋을 사용하여 저빌의 귀를 잡고 설치류의 귀에 지울 수없는 마커를 사용하여 표시하십시오. 실험실과 대형 바이오 테리움을 사용할 수있는 경우 해당 식별과 함께 각 설치류에 대해 고유 한 케이지를 지정하십시오.
- 층류 후드를 70 % 에탄올 용액으로 소독하십시오. 바늘, 주사기 및 랙을 포함한 모든 수술 및 일회용 도구를 후드 내부의 작업 영역에 놓습니다. 후드에도 일회용 수술용 폼을 놓습니다.
- 작은 열린 플라스틱 용기를 사용하여 설치류를 정밀 저울에 유지하여 측정을 용이하게하십시오.
- 이 실험에는 비슷한 크기와 무게(~80g)의 6개월 된 수컷 몽골 저빌 3개를 사용하십시오. 한 번에 하나씩 설치류가있는 각 케이지를 층류 후드 안에 놓습니다. 새장을 열고 각 저빌을 식별하고 저울에서 무게를 잰다.
알림: 저빌은 무해하지만 섬세한 동물입니다. 저빌을 다룰 때는 일회용 장갑을 착용하십시오. - 지배적이지 않은 손으로 저빌을 잡고 꼬리를 단단히 잡습니다. 엄지와 검지를 귀 뒤에 대고 주로 사용하는 손을 사용하여 복부 부위가 위쪽을 향하도록 동물을 잡습니다. 새끼 손가락을 사용하여 꼬리를 잡으십시오.
- 30G 바늘로 주사기에 1mL의 케타민과 자일 라진을 채 웁니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 설치류 (50-100mg/kg 케타민 및 2mg/kg 자일라진)9에 마취를 복강 내 투여합니다. 효과의 지속 시간은 약 20-50 분입니다 (변형이 발생할 수 있음).
- 저빌이 완전히 마취되었는지 확인하려면 각막을 절개하기 전에 발가락 꼬집음, 꼬리 꼬집음, 각막 반사 등으로 확인하십시오.
참고: 모든 절차는 오른쪽 눈에만 수행하십시오.
2. 각막의 광학 간섭 단층 촬영 (OCT)
- 분비물이나 동물의 털로부터 장비를 보호하기 위해 멸균 수술용 커튼을 놓습니다.
- 작업자 중 한 명이 동물을 잡고 다른 작업자가 이미지를 찍는지 확인합니다. 작업자는 저빌의 눈이 가능한 한 안정적이고 여전히 연구 할 수 있도록 저빌을 잡은 상태에서 장비에 손을 얹어야합니다. 턱걸이에 저빌을 잡고 손을 얹습니다..
- OCT를 제어하는 소프트웨어를 시작하고 이미지 촬영 을 누른 다음 원하는 이미지 저장을 누릅니다. 각막의 여러 시상과 관상 동맥 조각을 수행하십시오. OCT 아래의 눈을 이미지화하고 설치류 각막의 앞쪽 부분을 보기 위해 여러 조각을 만듭니다.
참고: 획득한 이미지가 선명하지 않고 눈이 약간 움직인 경우 이 절차를 여러 번 반복하여 충분한 이미지를 얻으십시오. - OCT 소프트웨어를 사용하여 중앙 및 주변 영역의 파키메트릭 측정을 수행합니다. 소프트웨어의 메인 화면에서 이미지 찍기를 누른 다음 원하는 이미지 저장 단추.
- 정상 또는 대조군 눈과 다른 설치류 눈에 대한 광선 요법 각막 절제술 직후에 측정을 수행하십시오.
3. 엑시머 레이저 광선 치료 각막 절제술 (PTK)
- 분비물이나 동물의 털로부터 장비를 보호하기 위해 엑시머 레이저 장치에 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.
- 수술 5 분 전에 치료할 눈에 국소 프로 파라카인 염산염 (0.5 %)을 떨어 뜨립니다.
- 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 저빌을 단단히 잡으십시오. 주로 사용하는 손으로 동물의 눈꺼풀을 열어 이미지를 제대로 캡처 할 수 있습니다. 초점을 맞추고 선명한 이미지를 얻으려면 저빌을 잡고있는 사람의 손이 장비 머리에 놓여 있는지 확인하십시오. 환자가 목을 놓을 위치에 동물을 잡고있는 손을 놓습니다.
- 오른쪽 눈에 PTK 절제를 수행하십시오. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 60 μm에서 62 μm 두께 사이의 제거, 3 mm의 광학 영역, 4 초의 지속 시간 및 총 1,867 펄스.
참고: PTK는 저빌 2 및 저빌 3에서만 수행됩니다. 이 단계에서 두 번째 작업자는 각막 조직을 제거하기 위해 레이저를 준비하고 활성화합니다. - 시술 직후 사진을 찍고 OCT 분석을 수행하여 치료받은 눈의 표면 변화를 기록하고 문서화합니다.
- 절차가 완료되면 설치류를 새장에 다시 넣고 활력 징후 (심박수 : 분당 360 회, 직장 온도 : 37-38.5 ° C, 호흡 수 : 분당 90 회 호흡)를 모니터링하고 동물이 마취에서 회복되도록합니다.
4. 각막 PTK 후 저빌의 각성
- 복강 주사 를 통해 부 프레 노르 핀 (0.1mg / kg에서 0.05mg / kg)과 아티 파메 졸 (0.1-1mg / kg)을 투여하십시오.
- 각 저빌을 각각의 홈 케이지에 넣고 정상적인 각성에 대한 활력 징후를 모니터링하십시오 (정상 체온은 37-39 ° C).
- 표면을 깨끗하게 유지하고 감염을 예방하기 위해 에리스로 마이신 연고를 바르십시오. 이 절차를 하루에 두 번 수행하십시오.
- PTK 후 2 일 연속으로 진통 및 눈 연고를 위해 부 프레 노르 핀 (6-12 시간마다)을 피하 (0.01-0.05 mL)로 투여하십시오.
5. 안락사 방법
- 가능할 때마다 홈 케이지에서 안락사를 수행하십시오.
- 압축 된 이산화탄소 (CO2) 가스를 홈 케이지에 도입하십시오. 홈 케이지의 기존 공기에CO2 를 첨가하여 분당 챔버 부피의 30%-70%의 충전 속도는 목표를 충족하는 혼합물을 달성하기에 충분합니다(10L 부피 챔버의 경우 3-7L/min의 유속 사용). 설치류의 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 탈구 (안락사의 2 차 방법으로)를 사용하십시오.
- 저빌 2 및 저빌 3 수술 후 각각 24 시간 및 96 시간에 동물을 홈 케이지에서 제거하여 안구 (정상 안구와 수술중인 안구 모두)의 핵 제거를 수행하여 각막 치유를 관찰합니다.
- 동물을 수술대에 놓고 약 1 분 동안 심장 박동이 없는지 확인하십시오.
6. 눈 수술
- 안구에 접근하기 위해 위 눈꺼풀과 아래 눈꺼풀을 제거하십시오. 수술 용 집게와 가위를 사용하여 눈꺼풀을 제거하십시오. 작업 영역의 크기가 너무 작고 섬세하여 눈꺼풀을 제거하면 안구를 손상시키지 않고 핵을 제거 할 수 있습니다.
- 안구를 핵을 제거하려면 외부 캔서스를 절개하고 가위를 뒤쪽 방향으로 안내하십시오. 안구를 궤도에서 분리하여 내부 캔서스에서이 절차를 반복하십시오.
- 안구 뒤쪽의 시신경을 절제하십시오. 후부 안와 신경총은이 기술을 수행 할 때 일반적으로 약간의 출혈을 일으켜 작업을 어렵게 만든다는 점을 분명히해야합니다.
- 안구를 멸균 식염수가 담긴 미세 원심분리기 튜브에 30초에서 1분 동안 삽입하여 잔류 혈액을 씻어냅니다.
- 아래 설명된 대로 후속 해부병리학적 분석을 위해 10% 포름알데히드가 포함된 미세 원심분리 튜브에 안구를 놓습니다. 여러 이미지와 사진을 찍습니다.
7. 해부학 병리학 적 분석
- 눈 전체를 10 % 완충 포르말린에 6-24 시간 동안 삽입하십시오.
- 마이크로톰을 사용하여 조직을 자릅니다. 절단 된 조직의 두께가 3mm 인 지 확인하십시오.
- 조직을 96 % 알코올에 30-90 분 동안 담그고이 절차를 두 번 반복하십시오.
- 조직을 이소프로필 알코올에 30-90분 동안 넣고 이 절차를 두 번 반복합니다.
- 조직을 크실렌 또는 크실렌 대체물에 1-3시간 동안 넣습니다.
- 최소 1시간 동안 액체 등유에 조직을 삽입합니다.
- 블록을 사용하여 조직을 배치하고 액체 파라핀에 삽입하십시오. 굳어지도록(추운 곳에 두고) 자릅니다.
- 제조업체의 지침에 따라 절단을 위해 마이크로톰을 준비하십시오.
- 이어서, 헤 마톡 실린 및 에오신과 같은 얼룩을 사용하십시오.
- 현미경에 카메라를 추가하여 사진을 얻습니다.
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Representative Results
본 연구에서는 조직학적 기술과 광학 간섭 단층 촬영과 같은 전방 분절의 보완 연구를 사용하여 전체 각막 구조를 철저히 분석했습니다. 전방 분절 구조의 광학 간섭 단층 촬영을 사용한 이미지 분석은 중앙 및 말초 각막 두께가 각각 160μm 및 106μm ± 2μm인 정상 상피 및 기질(그림 1)을 보여줍니다. 다른 간행물에서도 다른 설치류의 각막이 주변부로 갈수록 얇아지는 것으로 나타났습니다10.
PTK 후, 각막 상피의 괴사조직 제거가 관찰되었다(도 2). 치료 전후의 저빌 눈의 거시적 사진도 촬영되었습니다. PTK를 수행 한 후, 불규칙한 각막 표면이 관찰되었으며, 이는 한 방울의 플루오 레세인을 주입하고 보라색 빛 (상피 궤양을 나타냄)으로 조명하여 염색되었습니다 (그림 3).
조직 학적 분석과 관련하여, 치료되지 않은 저빌 (gerbil 1)의 정상 각막은 인간과 동일한 층을 보였다 : 각막의 전체 두께의 28 %를 차지하는 4-6 개의 세포 층이있는 층화 된 전방 상피, Bowman 's 층, 각막의 전체 두께의 66 %를 차지하는 기질, Descemet의 막, 및 내피 (그림 4 및 그림 5).
저빌 번호 2 (PTK 후 24 시간)에서 관찰 된 변화는 각막의 궤양, 인접한 전방 상피의 파셀화, 상피 acantholysis 및 분리 된 discheratocytes의 여러 반점, 급성 상피 하 염증성 침윤 및 기질 수준의 부종이었습니다 (그림 6).
저빌 번호 3 (PTK 후 96 시간)에서 관찰 된 변화는 저빌 번호 2보다 더 큰 부종의 존재, 기질 섬유 및 세포의 분해, 전방 상피의 완전한 재생 및 염증성 침윤이 없었습니다 (그림 7).
요약하면, 조직 학적 염색은 염증성 침윤 및 부종과 함께 각막 상피 및 표면 간질의 정상적인 상처 치유 과정을 보여줍니다.
그림 1: 정상 각막의 대표적인 OCT 영상. 각막은 전체 크기 (정점에서 두께 측정 160μm, 둘레에서 108μm 및 110μm의 두께 측정)로 볼 수 있으며 전방, 홍채 각막, 홍채 및 결정 수정체 (전방으로 돌출 됨)도 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PTK 전후 각막의 대표적인 OCT 영상 . (A) 정상 각막의 이미지. (B) PTK 후 10 분 동안 각막 이미지. 왼쪽 화살표는 세포 파편이 축적 된 궤양의 가장자리를 보여주고 오른쪽 화살표는 수술의 전형적인 각막 표면의 파편을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 저빌 (오른쪽 눈)의 안구의 대표적인 매크로 사진. (A) 정상 안구의 규칙적인 표면. (B) PTK 수행 후 5분 후에 촬영한 이미지로 각막 표면의 요철을 보여줍니다. (C) LED 광원 (보라색)을 사용하여 0.25 % 플루오 레세인으로 염색 된 각막 궤양의 증거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : H & E로 염색 된 gerbil (40x)의 전체 정상 각막의 대표적인 완전한 조직 학적 섹션 (전방-후방). (A) 주변 및 중앙 조각이 프레임되어 있습니다. 스케일 바는 20 μm입니다. (B-D) 각막의 주변은 층화가 적고 기질 섬유 수가 감소한 더 얇은 상피를 보여줍니다. 그림은 각막 주변에서 약간 분리 된 내피를 보여 주며, 이는 기술의 인공물로 인한 것입니다. 결과적으로, 말초 각막 두께는 중앙 각막 두께보다 얇습니다. (C) 측정된 두께는 OCT 이미지로 계산된 두께와 유사합니다. 상피와 간질 모두 각막 정점 수준에서 더 큰 두께를 보여줍니다. 스케일 바는 40 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : H & E (gerbil number 1)로 염색 된 몽골 저빌의 대표적인 정상 각막. 각막의 5 개 층과 손상되지 않은 상피가 관찰됩니다. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 엑시머 레이저 광선 치료 각막 절제술 (PTK) 후 24 시간 (H & E로 염색). 화살표는 각막 궤양 (gerbil 번호 2)의 가장자리를 보여줍니다. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 엑시머 레이저 광요법 각막 절제술(PTK) 후 96시간 후의 대표적인 각막. H & E로 염색; 저빌 번호 3. 재생 된 상피 및 기질 부종이이 그림에서 관찰됩니다. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
각막 상처 치유의 생리학은 조직 재생과 항상성 유지 사이의 균형입니다. 과도한 상처 치유는 섬유증과 흉터로 이어질 수 있으며, 이는 궁극적으로 장기 기능의 상실을 초래할 수 있습니다. 각막 수술 절차의 급속한 발전으로 각막 상처 치유와 관련된 생리적, 병리학적 사건을 이해하는 것의 중요성은 과대평가될 수 없습니다11.
여러 연구 결과에 따르면 저빌은 주로 일주 행동12 과 생쥐 또는 쥐에 비해 우수하고 더 예리한 시력을 포함하여 시력 연구에 유리한 종이되는 많은 감각적 특성을 가지고 있습니다13. 그들의 망막 구조는 인간의 망막 구조와 더 유사합니다14. 이러한 이유로, 이들은 망막 기생충 감염15의 개발, 치료 약물, 유전자 전달 및 망막 생리학 연구를 위한 동물 모델로 사용되어 왔다. 또한 최근에 발표 된 유전자 분석에 따르면 확인 된 저빌 유전자의 대부분 (81 %)이 마우스와 인간 사이에서 공유되는 것으로 나타났습니다16. 또한, 연구는 저빌과 생쥐 및 인간 사이의 유전 적 유사성을 문서화하여 종17에서 중요한 유사점과 차이점을 확인했습니다. 따라서 우리는 PTK 흉터와 관련된 정상적인 각막 구조 및 병리 생리 학적 과정을 연구하기 위해 현재의 저빌 동물 모델을 선택했습니다.
몇몇 연구자들은 PTK가 다른 측면 중에서 세포 사멸 과정, 각질 세포 활력, 세포 이동 및 국소 조직 염증에 대한 연구를 허용하기 때문에 각막 흉터를 연구하는 이상적인 모델이라고 주장합니다18.
이 연구의 중요성은 각막 흉터 및 상처 치유에 대한 연구뿐만 아니라 결과가 이전에 발표 된 다른 모델로 외삽 될 과학적 잠재력을 가진 새로운 동물 모델의 제안과 관련이 있습니다.
이 동물 모델은 인간의 눈의 행동과 유사하고 유사하기 때문에 다른 변종으로 동일한 프로토콜을 재현 할 수 있으며 감염성 각막염 및 각막 신생 혈관 모델과 같은 다른 모델의 개발을위한 선례를 설정합니다.
그러나이 작업과이 동물 모델에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 저빌은 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 널리 퍼진 동물 모델이 아닙니다. 이러한 이유로 원하는만큼 시약이 없을 수 있습니다. 둘째, 저빌의 안과에 관한 문헌도 매우 제한적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
엔지니어 로드리고 드 라 푸엔테의 귀중한 도움과 기술 지원에 감사드립니다. 또한 내레이션에 대해 마리아 유지니아 코르벨라와 인물 판에 대해 프리실라 하즈룬에게 감사드립니다. Hugo Luján은 우리가 면역학 및 전염병 연구 개발 센터 (CIDIE)의 시설을 사용할 수있게 해주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
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