Summary
この記事では、角膜の解剖学と組織学、およびその治癒過程を研究するために開発された新しい動物モデルについて説明します。この新しい動物モデルは、ヒトの角膜と多くの類似点を持つ角膜を持つモンゴルスナネズミを使用しています。
Abstract
角膜創傷治癒研究は長い間行われており、苦痛を軽減し、患者の目の健康を改善するのに役立つ治療法を開発するのに役立ちました。歴史的に、角膜治癒はマウスやラットなどのげっ歯類で研究されてきましたが、これらのモデルは人間の障害を完全に模倣していない可能性があります。しかし、モンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)などの他のげっ歯類に関する情報は、角膜研究では乏しい。
ここでは、フォトリフラクティブ角膜切除術後の角膜治癒を研究するための新規動物モデルを開発する技術について述べる。 M. unguiculatusの角膜に関する文献が限られているため、正常な角膜の組織学的分析についても説明します。これらの研究技術は、遺伝学、解剖学、生理学の点でモンゴルスナネズミと人間の角膜が類似しているため、眼疾患の研究にも採用できます。
Introduction
前眼部手術の重要な関心事である角膜創傷治癒の最も重要な側面のいくつかは、上皮構造の完全性、角膜間質の透明性の維持、そして最後に角膜の屈折特性の観点からの結果です1。
角膜は眼球の前面にある最も外側の透明な組織であるため、外傷、感染症、火傷の影響を受けやすいです。これらの創傷の治癒障害は、視覚の健康を損なう可能性があります2。
現在、角膜治癒を研究するためにいくつかの動物モデルが利用可能であり、それらのいくつかは、研究される種およびメカニズムの種類に応じて、他のものよりも優れています1。スナネズミ2の網膜に関する以前の調査の記録がいくつかあります。しかし、これまでのところ、これらのげっ歯類の角膜の瘢痕化プロセスに関する発表された文献はありません。
本稿では,角膜創傷治癒の動物モデルとしてメ リオネス・ウンギキュラトゥ ス(モンゴルスナネズミ)を紹介する.フォトリフラクティブ角膜切除術後に角膜治癒を誘発する手順を説明し、さまざまな種類の角膜瘢痕化プロセスを研究し、生体組織の動的段階の観点から創傷治癒を理解し、最後に適切な将来の治療を計画することができます3。光線療法用角膜切除術は再現性の高い技術であり、角膜損傷の深さや直径などのパラメータを正確に制御できる可能性があります4。さらに、この技術は、器具または処置を行うオペレータに特有の変数を追加し得る手術器具または化学溶液(例えば、生理食塩水、ホルマリン、アルコールなど)を用いた処置を必要としない5。
この記事で紹介した実験には、同様のサイズと体重(約90 g)の生後6か月のオスのスナネズミ3匹を使用しました。手順は右目でのみ行われました。1匹のスナネズミ(スナネズミ1またはコントロールと呼ばれる)は光線療法の角膜切除術を受けておらず、すべての正常な眼構造を評価するために除核されました。光線療法用角膜切除術は、エキシマレーザーで生成された紫外線を角膜に制御して送達することを含み、屈折矯正手術を行うために開発されました6。マウス7などの他のげっ歯類に使用されています。他の2匹のスナネズミは光線療法の角膜切除術を受けました。そのうちの1人は手術後24時間で除核され(スナネズミ2と呼ばれる)、もう1人は手術後96時間で除核されました(スナネズミ3と呼ばれます)。
この実験を行うため、研究する条件ごとに無作為に選抜したスナネズミを撮影したが、この実験は予め各条件につき合計16匹のスナネズミで行った。編集上の理由から、例として各条件(合計3匹のスナネズミ)にランダムに選択されたスナネズミを使用することが決定されました。
この研究の主な目的は、利用可能な最良の動物モデルを探索することです。ただし、すべての種が人間の目と同様の目の特徴を持っているわけではないことに注意することが重要です8。この記事では、 Meriones unguiculatus の角膜を研究するために使用される方法論と、角膜損傷を生成するために実行される手順について説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての研究手順は、コルドバカトリカ大学の「実験動物の世話と使用のための機関委員会」によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立研究評議会のガイドに従いました。これらの手続きは、コルドバ・カトリカ大学の「サルード科学部」と「セロ・ビシオン研究所」の当局によっても承認されました。
1.スナネズミの取り扱いと麻酔
注:すべての動物は特定の病原体を含まない(SFP)オスのモンゴルスナネズミであり、免疫学および感染症研究開発センター(CIDIE)施設(アルゼンチン、コルドバ)で飼育されていました。それらはラプラタ大学(アルゼンチン、ブエノスアイレス)から入手しました。
- スナネズミをトウモロコシの穂軸の寝具で寝かせたポリスルホンケージに社会的に収容します。食品とろ過された水道水を水筒に入れて 自由に提供します。室温範囲が18°C〜24°Cであり、12:12時間の明暗サイクルが使用されていることを確認してください。
- 各スナネズミの体重を別々に量り、混乱を避けるためにそれぞれを特定します。スナネズミの尾の付け根に消えないインクマーカーで印を付けます。ピンセットを使用してスナネズミの耳を保持し、げっ歯類の耳に消えないマーカーを使用してマークを付けます。実験室と大きなバイオテリウムが利用可能な場合は、対応する識別情報とともにげっ歯類ごとに一意のケージを割り当てます。
- 層流フードを70%エタノール溶液で消毒します。針、注射器、ラックを含むすべての外科用および使い捨て器具をフード内の作業領域に置きます。フードにも使い捨ての外科用フォームを置きます。
- 小さな開いたプラスチック容器を使用して、げっ歯類を精密天びんに保ち、測定を容易にします。
- この実験には、同様のサイズと体重(~80 g)の生後6か月のオスのモンゴルスナネズミ3匹を使用します。一度に1つずつ、げっ歯類と一緒に各ケージを層流フードの中に置きます。ケージを開き、スナネズミのそれぞれを特定し、体重計で体重を量ります。
注:スナネズミは無害ですが繊細な動物です。スナネズミを扱うときは使い捨て手袋を着用してください。 - 利き手ではない手でスナネズミをつかみ、尻尾でしっかりと保持します。親指と人差し指を耳の後ろに置いて利き手を使用して、腹側領域を上に向けて動物を保持します。小指を使って尾を持ちます。
- シリンジに1 mLのケタミンとキシラジンを入れた30 Gの針を入れます。利き手を使用して、げっ歯類に腹腔内麻酔を投与します(50-100 mg / kgケタミンと2 mg / kgキシラジン)9 。.効果の持続時間は約20〜50分です(変動が発生する可能性があります)。
- スナネズミが完全に麻酔されていることを確認するには、角膜を切開する前に、つま先をつまむ、尾をつまむ、角膜の反射などで確認します。
注意: すべての手順は右目だけで実行してください。
2.角膜の光干渉断層撮影(OCT)
- 分泌物や動物の毛から機器を保護するために、滅菌外科用ドレープを配置します。
- オペレーターの1人が動物を持ち、別のオペレーターが画像を撮影していることを確認します。オペレーターは、スナネズミの目ができるだけ安定し、研究できるように、スナネズミを持ちながら機器に手を置く必要があります。スナネズミを持っている手をあご当てに置きます。
- OCT を制御するソフトウェアを起動し、[イメージの撮影]、[目的のイメージの保存] の順にクリックします。角膜の複数の矢状および冠状スライスを実行します。OCTの下の目を画像化し、複数のスライスを作成して、げっ歯類の角膜の前部を表示します。
注意: 取得した画像が鮮明ではなく、目がわずかに動いた場合は、手順を数回繰り返して十分な画像を取得してください。 - OCTソフトウェアを使用して、中央および周辺領域のパキメトリック測定を実行します。ソフトウェアのメイン画面で、[ 画像の撮影]を押してから、[ 目的の画像を保存 ]ボタンを押します。
- 正常または対照眼、および他のげっ歯類の眼の光線療法角膜切除術の直後に測定を実行します。
3.エキシマレーザー光線療法角膜切除術(PTK)
- エキシマレーザー装置に滅菌外科用ドレープを置き、分泌物や動物の毛から装置を保護します。
- 外科的処置の5分前に治療される眼に局所塩酸プロパラカイン(0.5%)を一滴注入する。
- 利き手ではない手を使ってスナネズミをしっかりと握ります。利き手で動物のまぶたを開き、画像を適切にキャプチャできるようにします。焦点を合わせて鮮明な画像を取得できるようにするには、スナネズミを持っている人の手が機器の頭にかかっていることを確認してください。患者が首を置く場所に動物を持っている手を置きます。
- 右目にPTKアブレーションを行います。次のパラメータを使用します:厚さ60μm〜62μmのアブレーション、3mmの光学ゾーン、4秒の持続時間、および合計1,867パルス。
注:PTKはスナネズミ2とスナネズミ3でのみ実行されます。このステップでは、第2のオペレータは、角膜組織を切除するためにレーザーを準備して活性化する。 - 手順の直後に、写真を撮り、OCT分析を実行して、治療された目の表面変化を記録および記録します。
- 手順が完了したら、げっ歯類をケージに戻し、バイタルサインを監視し(心拍数:毎分360拍、直腸温度:37〜38.5°C、呼吸数:毎分90呼吸)、動物を麻酔から回復させます。
4.角膜PTK後のスナネズミの目覚め
- ブプレノルフィン(0.1mg / kgから0.05mg / kg)とアチパメゾール(0.1-1 mg / kg)を腹腔内注射 で 投与します。.
- 各スナネズミをそれぞれのホームケージに入れ、バイタルサインを監視して正常な目覚めを確認します(通常の体温は37〜39°Cです)。
- エリスロマイシン軟膏を塗布して、表面を清潔に保ち、感染を防ぎます。この手順を1日2回実行してください。
- PTK後2日間連続して、鎮痛と眼軟膏のためにブプレノルフィン(6〜12時間ごと)を皮下(0.01〜0.05 mL)投与します。.
5.安楽死法
- 可能な限り、ホームケージで安楽死を行います。
- 圧縮二酸化炭素(CO2)ガスをホームケージに導入します。ホームケージ内の既存の空気にCO2 を添加したチャンバー容積の30%〜70%の充填率は、目的を満たす混合物を達成するのに十分です(10 L容量のチャンバーの場合、3〜7 L / minの流量を使用します)。げっ歯類の死を確実にするために(安楽死の二次的な方法として)頸部脱臼を使用してください。
- スナネズミ2とスナネズミ3の手術後24時間後と96時間で、動物をホームケージから取り出して眼球(正常な眼球と手術中の眼球の両方)の除核を行い、角膜治癒を観察します。
- 動物を手術台に置き、約1分間心拍がないことを確認します。
6.眼科手術
- 上まぶたと下まぶたを取り除き、眼球にアクセスできるようにします。外科用鉗子とはさみを使用してまぶたを取り除きます。作業領域のサイズは非常に小さくて繊細なので、まぶたを取り除くことで眼球を傷つけることなく摘出することができます。
- 眼球を摘出するには、外眼窩を切開し、ハサミを後方向に導きます。眼球を軌道から分離することにより、内部カンサスからこの手順を繰り返します。
- 眼球の後ろにある視神経を切片化します。この技術を実行するとき、後部眼窩神経叢は通常わずかな出血を引き起こし、それが作業を困難にすることを明確にすべきである。
- 眼球を滅菌生理食塩水を入れた微小遠心チューブに30秒から1分間導入して、残留血液を洗い流します。
- 眼球を10%ホルムアルデヒドを含む微小遠心チューブに入れて、以下に説明するように解剖病理学的分析を行います。複数の画像や写真を撮ります。
7.解剖病理学分析
- 目全体を10%緩衝ホルマリンに6〜24時間埋め込みます。
- ミクロトームを使用して組織を切断します。切断組織の厚さが3 mmであることを確認してください。
- 組織を96%アルコールに30〜90分間浸し、この手順を2回繰り返します。
- 組織をイソプロピルアルコールに30〜90分間入れ、この手順を2回繰り返します。
- 組織をキシレンまたはキシレン代用物に1〜3時間入れます。
- 組織を液体灯油に最低1時間埋め込みます。
- ブロックを使用してティッシュを配置し、流動パラフィンに埋め込みます。固まらせて(冷たい場所に置いて)、切ります。
- 製造元の指示に従って、切片作成用のミクロトームを準備します。
- その後、ヘマトキシリンやエオシンなどの染色剤を使用してください。
- 顕微鏡にカメラを追加して写真を取得します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本研究では、組織学的手法と光干渉断層撮影などの前部セグメントの補完的研究を使用して、角膜構造全体を徹底的に分析しました。前部構造の光干渉断層撮影による画像解析では、上皮と間質が正常であり(図1)、角膜の中心厚さは160 μm、末梢の厚さはそれぞれ106 μm±2 μmです。他の刊行物も、他のげっ歯類の角膜が周辺10に向かって薄くなることを示している。
PTK後、角膜上皮の創面切除が観察された(図2)。治療前後のスナネズミの目の肉眼写真も撮影しました。PTKを行った後、不規則な角膜表面が観察され、フルオレセインを1滴注入し、紫色光で照射することによって染色されました(上皮性潰瘍を示す)(図3)。
組織学的分析に関して、未治療のスナネズミ(スナネズミ1)の正常な角膜はヒトと同じ層を示した:角膜の全厚さの28%を占める4〜6層の細胞を有する層状前上皮、ボーマン層、角膜の総厚さの66%を表す間質、デスメ膜、 および内皮(図4 および 図5)。
スナネズミ数2(PTK後24時間)で観察された変化は、角膜の潰瘍、隣接する前上皮の食衰、上皮表皮溶解および孤立した失調細胞の複数のスポット、急性上皮下炎症浸潤、および間質レベルの浮腫でした(図6)。
スナネズミ数3(PTK後96時間)で観察された変化は、スナネズミ数2よりも大きな浮腫の存在、間質線維と細胞の脱凝集、前上皮の完全な再生、および炎症性浸潤なしでした(図7)。
要約すると、組織学的染色は、炎症性浸潤および浮腫を伴う角膜上皮および表在性間質における正常な創傷治癒過程を示す。
図1:正常角膜の代表的なOCTイメージング。 角膜はフルサイズ(頂点160μmの厚さ測定、周辺108μmと110μmの厚さ測定値)で見ることができ、前房、虹彩角膜角、虹彩、水晶体(前房に突出している)も見ることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PTK前後の角膜の代表的なOCTイメージング 。 (A)正常な角膜の画像。(B)PTKの10分後の角膜画像。左側の矢印は、細胞の破片が蓄積した潰瘍の端を示し、右側の矢印は、手術に典型的な角膜表面の破片も示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スナネズミの眼球(右目)の代表的なマクロ写真 。 (A)正常な眼球の規則的な表面。(B)PTK実施5分後に撮影した、角膜表面の凹凸を示す画像。(C)LED光源(紫)を用いて0.25%フルオレセインで染色した角膜潰瘍の証拠。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:H&Eで染色されたスナネズミの正常な角膜全体の代表的な完全な組織学的切片(前後)(40倍)(A)末梢および中央の断片が囲まれている。スケールバーは20μmです。 (B-D)角膜の周辺は、層別化が少なく、間質線維の数が減少した薄い上皮を示します。図は、角膜の周辺にわずかに剥離した内皮を示していますが、これは技術のアーティファクトによるものです。その結果、末梢の角膜の厚さは中心のものよりも薄くなります。(C)測定された厚さは、OCT画像で計算された厚さと同様です。上皮および間質の両方が角膜頂点のレベルでより大きな厚さを示す。スケールバーは40μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:H&E(スナネズミ番号1)で染色されたモンゴルスナネズミの代表的な正常角膜。 角膜の5つの層と無傷の上皮が観察されます。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:エキシマレーザー光線療法角膜切除術(PTK)の24時間後の代表的な角膜(H&Eで染色)。 矢印は角膜潰瘍(スナネズミ番号2)の縁を示しています。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:エキシマレーザー光線療法角膜切除術(PTK)の96時間後の代表的な角膜。 H&Eで染色;スナネズミ番号3。再生された上皮および間質浮腫がこの図に観察される。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
角膜創傷治癒の生理機能は、組織再生と恒常性の維持との間のバランスである。過度の創傷治癒は線維症や瘢痕化につながる可能性があり、最終的には臓器機能が失われる可能性があります。角膜外科手術の急速な進化に伴い、角膜創傷治癒とそれに伴う生理学的および病理学的事象を理解することの重要性を過大評価することはできません11。
複数の研究成果によると、スナネズミは、主に日中の行動12 や、マウスやラットと比較して優れた急性視力など、視力研究に適した種となる多くの感覚特性を持っています13。それらの網膜構造は、人間のそれにより類似しています14。このため、網膜寄生虫感染症15の発症、治療薬、遺伝子送達、網膜生理学の研究のための動物モデルとして使用されている。さらに、最近発表された遺伝子分析では、同定されたスナネズミ遺伝子のほとんど(81%)がマウスとヒトの間で共有されていることが示されています16。さらに、研究では、スナネズミとマウスとヒトの両方の遺伝的類似性を文書化し、種間の重要な類似点と相違点を特定しています17。そこで、現在のスナネズミの動物モデルを選択して、正常な角膜構造とPTK瘢痕化に関連するそれらの病態生理学的プロセスを研究しました。
何人かの研究者は、PTKはアポトーシスプロセス、角質細胞の活力、細胞移動、および局所組織炎症などの側面の研究を可能にするため、角膜瘢痕を研究するための理想的なモデルであると主張しています18。
この研究の重要性は、角膜瘢痕化と創傷治癒の研究だけでなく、結果が以前に発表された他のモデルに外挿される科学的可能性を備えた新しい動物モデルの提案にも関連しています。
この動物モデルは、人間の目の行動との類似性と類似性のために、異なる変異体で同じプロトコルを再現することを可能にし、感染性角膜炎や角膜新生血管のモデルなどの他のモデルの開発の先例を設定します。
ただし、この作業とこの動物モデルにはいくつかの制限があります。まず、スナネズミは、マウス、ラット、ウサギなどの広範な動物モデルではありません。このため、必要な数の試薬がない場合があります。第二に、スナネズミの眼科に関する入手可能な文献も非常に限られています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
エンジニアのロドリゴ・デ・ラ・フエンテの貴重な支援と技術サポートに感謝します。また、ナレーションを提供してくれたマリア・ユージニア・コルベラと、フィギュアのエディションを提供してくれたプリシラ・ハズルンにも感謝します。ヒューゴ・ルハンは、免疫学および感染症研究開発センター(CIDIE)の施設の使用を許可してくれました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
- Kuo, I. C.
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J.
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W.
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S.
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071 (2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903 (2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
