Summary
Este artigo descreve um novo modelo animal desenvolvido para estudar a anatomia e histologia da córnea e seus processos de cicatrização. Este novo modelo animal usa o gerbil mongol, que tem uma córnea com muitas semelhanças com a córnea humana.
Abstract
Estudos de cicatrização de feridas na córnea foram realizados por um longo tempo e ajudaram a reduzir o sofrimento e desenvolver tratamentos que contribuem para melhorar a saúde ocular dos pacientes. Historicamente, a cicatrização da córnea tem sido estudada em roedores, como camundongos e ratos, mas esses modelos podem não imitar completamente os distúrbios humanos. No entanto, informações sobre outros roedores, como gerbils mongóis (Meriones unguiculatus) são escassas na pesquisa da córnea.
Aqui, descrevemos uma técnica para desenvolver um novo modelo animal para estudar a cicatrização da córnea após ceratectomia fotorrefrativa. Devido à escassa literatura disponível sobre a córnea de M. unguiculatus, também descrevemos uma análise histológica da córnea normal. Essas técnicas de pesquisa também podem ser empregadas no estudo de doenças oculares devido à semelhança entre as córneas dos gerbos mongóis e dos seres humanos em termos de genética, anatomia e fisiologia.
Introduction
Alguns dos aspectos mais importantes da cicatrização de feridas corneanas, que são as principais preocupações para a cirurgia do segmento anterior, são a integridade da arquitetura epitelial, a manutenção da transparência do estroma corneano e, finalmente, o resultado em termos das propriedades refrativas da córnea1.
A córnea é o tecido claro mais externo na frente do globo ocular e, portanto, é suscetível a traumas, infecções e queimaduras; a cicatrização prejudicada dessas feridas pode comprometer a saúde visual2.
Atualmente, vários modelos animais estão disponíveis para estudar a cicatrização da córnea, e alguns deles são melhores que outros, dependendo da espécie e do tipo de mecanismo a ser estudado1. Existem alguns registros de investigações anteriores sobre a retina de gerbilos2. No entanto, até o momento, não há literatura publicada sobre os processos de cicatrização na córnea desses roedores.
Aqui, apresentamos Meriones unguiculatus (gerbil mongol) como um modelo animal de cicatrização de feridas na córnea. São descritos procedimentos para provocar a cicatrização da córnea após a ceratectomia fotorrefrativa, que nos permitem estudar os diferentes tipos de processos cicatriciais corneanos, compreender a cicatrização de feridas em termos das fases dinâmicas do tecido vivo e, finalmente, planejar tratamentos futuros adequados3. A ceratectomia fototerapêutica é uma técnica altamente reprodutível com a possibilidade de controlar com precisão parâmetros como a profundidade e o diâmetro da lesão corneana4. Além disso, essa técnica não requer procedimentos com instrumentos cirúrgicos ou soluções químicas (por exemplo, solução salina, formalina, álcool, etc.) que possam agregar variáveis específicas aos instrumentos ou ao operador que realiza o procedimento5.
Três gerbilos machos de 6 meses de idade, de tamanhos e pesos semelhantes (aproximadamente 90 g), foram utilizados para o experimento apresentado neste artigo. Os procedimentos foram realizados apenas no olho direito. Um gerbil (referido como gerbil 1 ou controle) não foi submetido à ceratectomia fototerapêutica e foi enucleado para avaliar todas as estruturas oculares normais. A ceratectomia fototerapêutica envolve a entrega controlada de luz ultravioleta gerada por laser de excimer para a córnea e foi desenvolvida para a realização de cirurgia refrativa6. Tem sido usado em outros roedores, como camundongos7. Os outros dois gerbos foram submetidos à ceratectomia fototerapêutica. Um deles foi enucleado às 24 h (referido como gerbil 2) e o outro às 96 h após a cirurgia (referido como gerbil 3).
Para a realização deste experimento, um gerbil selecionado aleatoriamente foi filmado para cada condição a ser estudada, mas este experimento foi previamente realizado com 16 gerbils no total para cada condição. Por razões de edição, optou-se por usar um gerbil selecionado aleatoriamente para cada condição (três gerbils no total) como exemplo.
O principal objetivo desta pesquisa é explorar o melhor modelo animal disponível. No entanto, é importante ressaltar que nem todas as espécies apresentam características oculares semelhantes às do olho humano8. Este artigo descreve a metodologia utilizada para estudar a córnea de Meriones unguiculatus e o procedimento realizado para gerar a lesão corneana, que nos permitem estudar o processo de cicatrização.
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Protocol
Todos os procedimentos de pesquisa foram aprovados pela "Comissão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" da Universidade Católica de Córdoba e seguiram o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o cuidado e uso de animais de laboratório. Estes procedimentos também foram aprovados pelas autoridades da "Facultad de Ciencias de la Salud" da Universidad Católica de Córdoba e do "Instituto de la Visión Cerro".
1. Manipulação e anestesia de Gerbil
NOTA: Todos os animais eram gerbos mongóis machos livres de patógenos específicos (SFP) e foram mantidos nas instalações do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Imunologia e Doenças Infecciosas (CIDIE) (Córdoba, Argentina). Eles foram obtidos da Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentina).
- Abrigar os gerbils socialmente em gaiolas de polissulfona acamadas com cama de espiga de milho. Forneça alimentos e água da torneira filtrada em garrafas de água ad libitum. Certifique-se de que a faixa de temperatura ambiente seja de 18 °C a 24 °C e que seja usado um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
- Pese cada gerbil separadamente e identifique cada um para evitar confusão. Faça uma marca com um marcador de tinta indelével na base da cauda do gerbil. Use uma pinça para segurar a orelha do gerbil e fazer uma marca usando o marcador indelével na orelha do roedor. Se um laboratório e um grande biotério estiverem disponíveis, atribua uma gaiola única para cada roedor com a identificação correspondente.
- Desinfete o exaustor de fluxo laminar com solução de etanol a 70%. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos e descartáveis, incluindo agulhas, seringas e racks na área de trabalho dentro do exaustor. Coloque uma espuma cirúrgica descartável no exaustor também.
- Use um pequeno recipiente de plástico aberto para manter o roedor na balança de precisão para facilitar a medição.
- Use três gerbilos mongóis machos de 6 meses de idade de tamanhos e pesos semelhantes (~ 80 g) para este experimento. Um de cada vez, coloque cada gaiola com o roedor dentro do exaustor de fluxo laminar. Abra as gaiolas, identifique cada um dos gerbos e pese-os na balança.
NOTA: Gerbils são animais inofensivos, mas delicados. Use luvas descartáveis ao manusear os gerbos. - Segure o gerbil com a mão não dominante para segurá-lo firmemente pela cauda. Use a mão dominante, com o polegar e o dedo indicador atrás das orelhas, para segurar o animal com a região ventral voltada para cima. Use o dedo mínimo para segurar a cauda.
- Encha uma seringa com uma agulha 30 G com 1 ml de cetamina e xilazina. Administrar a anestesia por via intraperitoneal no roedor (50-100 mg/kg de cetamina e 2 mg/kg de xilazina)9 com a mão dominante. A duração do efeito será de aproximadamente 20-50 min (variações podem ocorrer).
- Para garantir que o gerbil esteja totalmente anestesiado, verifique com uma pitada no dedo do pé, uma pitada na cauda e a reflexão da córnea, etc., antes de fazer incisões na córnea.
NOTA: Execute todos os procedimentos apenas no olho direito.
2. Tomografia de coerência óptica (OCT) da córnea
- Coloque cortinas cirúrgicas estéreis para proteger o equipamento de secreções ou pelos de animais.
- Certifique-se de que um dos operadores segura o animal enquanto outro operador tira as imagens. O operador deve apoiar as mãos no equipamento enquanto segura o gerbil para que o olho do gerbil seja o mais estável e ainda possível para ser estudado. Descanse a mão segurando o gerbil no queixo descanse.
- Inicie o software que controla a OCT, pressione Tirar Imagem e Salvar Imagem Desejada. Realize várias fatias sagitais e coronais da córnea. Fotografe o olho sob a OCT e faça várias fatias para visualizar o segmento anterior da córnea do roedor.
NOTA: Se a imagem obtida não estiver nítida e o olho tiver se movido ligeiramente, repita o procedimento várias vezes para obter imagens suficientes. - Utilizando o software OCT, realizar medições paquimétricas das regiões central e periférica. Na tela principal do software, pressione Take Image ( Tirar imagem) e pressione o botão Save Desired Image (Salvar imagem desejada ).
- Realizar medições no olho normal ou controle e imediatamente após a ceratectomia fototerapêutica nos outros olhos de roedores.
3. Ceratectomia fototerapêutica a laser Excimer (PTK)
- Coloque cortinas cirúrgicas estéreis no dispositivo laser excimer para proteger o equipamento de secreções ou pelos de animais.
- Instilar uma gota de cloridrato tópico de proparacaína (0,5%) no olho a ser tratado 5 min antes do procedimento cirúrgico.
- Use a mão não dominante para segurar o gerbil com firmeza. Com a mão dominante, abra as pálpebras do animal para que as imagens possam ser capturadas adequadamente. Para poder focar e obter uma imagem nítida, certifique-se de que as mãos da pessoa que segura o gerbil repousam na cabeça do equipamento. Coloque as mãos segurando o animal onde um paciente colocaria o pescoço.
- Realizar ablação PTK no olho direito. Use os seguintes parâmetros: uma ablação entre 60 μm e 62 μm de espessura, uma zona óptica de 3 mm, uma duração de 4 s e um total de 1.867 pulsos.
NOTA: PTK é realizado apenas em gerbil 2 e gerbil 3. Nesta etapa, o segundo operador prepara e ativa o laser para ablar o tecido corneano. - Imediatamente após o procedimento, tire fotografias e realize análises OCT para registrar e documentar as mudanças de superfície nos olhos tratados.
- Uma vez concluído o procedimento, coloque o roedor de volta na gaiola, monitore os sinais vitais (frequência cardíaca: 360 batimentos por minuto; temperatura retal: 37-38,5 °C; frequência respiratória: 90 respirações por minuto) e deixe o animal se recuperar da anestesia.
4. Despertar dos gerbos após PTK corneano
- Administrar buprenorfina (0,1mg/kg a 0,05mg/kg) e atipamezol (0,1-1 mg/kg) através de injeções intraperitoneais.
- Coloque cada gerbil em sua respectiva gaiola doméstica e monitore os sinais vitais para o despertar normal (a temperatura corporal normal é de 37-39 °C).
- Aplique uma pomada de eritromicina para manter a superfície limpa e prevenir a infecção. Realize este procedimento duas vezes por dia.
- Administrar buprenorfina (a cada 6-12 h) por via subcutânea (0,01-0,05 mL) para analgesia e pomada ocular em dois dias consecutivos após a PTK.
5. Método da eutanásia
- Realizar a eutanásia na gaiola doméstica sempre que possível.
- Introduza gás dióxido de carbono comprimido (CO2) na gaiola doméstica. Uma taxa de enchimento de 30%-70% do volume da câmara por minuto com CO2 adicionado ao ar existente na gaiola doméstica é adequada para alcançar uma mistura que atenda ao objetivo (para uma câmara de volume de 10 L, use uma taxa de fluxo de 3-7 L / min). Use a luxação cervical (como um método secundário de eutanásia) para garantir a morte do roedor.
- Às 24 h e 96 h após a cirurgia para gerbil 2 e gerbil 3, respectivamente, retirar o animal da gaiola domiciliar para realizar a enucleação do globo ocular (tanto o globo ocular normal quanto o submetido à cirurgia) para observar a cicatrização da córnea.
- Coloque o animal na mesa de operação e verifique a ausência de batimentos cardíacos por aproximadamente 1 min.
6. Cirurgia ocular
- Remova as pálpebras superiores e inferiores para obter acesso ao globo ocular. Use pinça cirúrgica e tesoura para remover as pálpebras. O tamanho da área de trabalho é tão pequeno e delicado que a remoção das pálpebras permite que o globo ocular seja enucleado sem danificá-lo.
- Para enuclear o globo ocular, faça uma incisão no canto externo e guie a tesoura em uma direção posterior. Repita este procedimento a partir do canto interno, separando o globo ocular da órbita.
- Seção do nervo óptico na parte de trás do globo ocular. Deve-se esclarecer que o plexo orbitário posterior geralmente gera leve sangramento ao realizar essa técnica, o que dificulta o trabalho.
- Introduza o globo ocular em um tubo de microcentrífuga com solução salina estéril por 30 s a 1 min para lavar qualquer sangue residual.
- Coloque o globo ocular em um tubo de microcentrífuga contendo 10% de formaldeído para posterior análise anatomopatológica, conforme descrito abaixo. Tire várias imagens e fotografias.
7. Análise anatomopatológica
- Incorpore todo o olho em formalina tamponada a 10% por 6-24 h.
- Corte o tecido usando um micrótomo. Certifique-se de que o tecido cortado tenha uma espessura de 3 mm.
- Mergulhe o tecido em álcool a 96% por 30-90 minutos e repita este procedimento duas vezes.
- Coloque o tecido em álcool isopropílico por 30-90 min e repita este procedimento duas vezes.
- Coloque o tecido em xileno ou substituto do xileno por 1-3 h.
- Incorpore o tecido em querosene líquido por 1 h no mínimo.
- Use um bloco para colocar o tecido e incorporá-lo em parafina líquida. Deixe-o solidificar (coloque-o em um lugar frio) e corte-o.
- Prepare o micrótomo para seccionamento de acordo com as instruções do fabricante.
- Posteriormente, use manchas como hematoxilina e eosina.
- Obtenha imagens com a câmera adicionada ao microscópio.
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Representative Results
No presente estudo, toda a estrutura corneana foi minuciosamente analisada por meio de técnicas histológicas e estudos complementares do segmento anterior, como a tomografia de coerência óptica. A análise da imagem por meio da tomografia de coerência óptica das estruturas do segmento anterior mostra epitélio e estroma normais (Figura 1), com espessuras corneanas centrais e periféricas de 160 μm e 106 μm ± 2 μm, respectivamente. Outras publicações também mostraram que a córnea de outros roedores se torna mais fina em direção à periferia10.
Após a PTK, observou-se o desbridamento do epitélio corneano (Figura 2). Imagens macroscópicas do olho de gerbil antes e após o tratamento também foram tiradas. Após a realização da PTK, observou-se uma superfície corneana irregular, que foi corada por instilação de uma gota de fluoresceína e iluminando-a com luz violeta (mostrando a úlcera epitelial) (Figura 3).
Em relação à análise histológica, a córnea normal do gerbil não tratado (gerbil 1) apresentou as mesmas camadas que nos humanos: o epitélio anterior estratificado com quatro a seis camadas de células, representando 28% da espessura total da córnea, a camada de Bowman, o estroma, representando 66% da espessura total da córnea, a membrana de Descemet, e o endotélio (Figura 4 e Figura 5).
As alterações observadas no gerbil número 2 (24 h após a PTK) foram úlcera na córnea, esfacelação do epitélio anterior adjacente, múltiplas manchas de acantólise epitelial e disqueratócitos isolados, infiltrado inflamatório subepitelial agudo e edema ao nível do estroma (Figura 6).
As alterações observadas no gerbil número 3 (96 h após a PTK) foram a presença de maior edema do que no gerbil número 2, desagregação das fibras e células estromais, regeneração completa do epitélio anterior e ausência de infiltrado inflamatório (Figura 7).
Em resumo, a coloração histológica demonstra o processo normal de cicatrização de feridas no epitélio corneano e estroma superficial, com infiltrado inflamatório e edema.
Figura 1: Imagens OCT representativas da córnea normal. A córnea pode ser vista em seu tamanho total (com uma medida de espessura em seu ápice de 160 μm e medidas de espessura de 108 μm e 110 μm na periferia), e a câmara anterior, o ângulo iridocorneano, a íris e o cristalino (projetando-se para a câmara anterior) também podem ser vistos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem OCT representativa da córnea pré e pós-PTK. (A) Imagem da córnea normal. (B) Imagem da córnea 10 min após PTK. A seta à esquerda mostra a borda de uma úlcera com um acúmulo de detritos celulares, e a seta à direita também mostra detritos na superfície da córnea típicos da cirurgia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fotografia macro representativa do globo ocular do gerbil (olho direito). (A) Superfície regular do globo ocular normal. (B) Imagem obtida 5 min após a realização da PTK, mostrando irregularidades na superfície corneana. (C) Evidência de úlcera de córnea corada com fluoresceína a 0,25% utilizando uma fonte de luz LED (violeta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Corte histológico completo representativo (anteroposterior) de toda a córnea normal do gerbil (40x) corada com H&E. (A) Os fragmentos periféricos e centrais são enquadrados. A barra de escala é de 20 μm. (B-D) A periferia da córnea apresenta um epitélio mais fino com menor estratificação e diminuição do número de fibras estromais. A figura mostra um endotélio ligeiramente destacado na periferia da córnea, o que se deve a um artefato da técnica. Consequentemente, a espessura periférica da córnea é mais fina que a central. (C) A espessura medida é semelhante à espessura calculada com as imagens OCT. Tanto o epitélio quanto o estroma apresentam maior espessura ao nível do ápice corneano. A barra de escala é de 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Córnea normal representativa do gerbil mongol corada com H&E (gerbil número 1). As cinco camadas da córnea e o epitélio intacto são observados. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Córnea representativa 24 h após ceratectomia fototerapêutica a laser excimer (PTK) (corada com H&E). A seta mostra a borda da úlcera de córnea (número de gerbil 2). A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Córnea representativa 96 h após ceratectomia fototerapêutica a laser excimer (PTK). Manchado com H&E; gerbil número 3. O epitélio regenerado e o edema estromal são observados nesta figura. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fisiologia da cicatrização de feridas corneanas é um equilíbrio entre a regeneração tecidual e a manutenção da homeostase. A cicatrização excessiva de feridas pode levar à fibrose e cicatrizes, o que, em última análise, pode resultar na perda da função do órgão. Com a rápida evolução dos procedimentos cirúrgicos corneanos, a importância de compreender a cicatrização das feridas corneanas e os eventos fisiológicos e patológicos envolvidos não pode ser superestimada11.
Múltiplos trabalhos de pesquisa afirmam que os gerbilos têm muitas características sensoriais que os tornam uma espécie favorável para estudos de visão, incluindo principalmente comportamento diurno12 e visão superior e mais aguda em comparação com camundongos ou ratos13. Sua estrutura retiniana é mais análoga à dos humanos14. Por essa razão, eles têm sido utilizados como modelo animal para o desenvolvimento de infecções parasitárias da retina15, drogas terapêuticas, entrega de genes e para o estudo da fisiologia da retina. Além disso, análises genéticas publicadas recentemente mostraram que a maioria dos genes de gerbil identificados (81%) é compartilhada entre camundongos e humanos16. Além disso, estudos documentaram as semelhanças genéticas entre gerbilos e camundongos e humanos, identificando importantes semelhanças e diferenças entre as espécies17. Portanto, escolhemos o modelo animal atual de gerbilos para estudar as estruturas normais da córnea e seus processos fisiopatológicos associados à cicatrização de PTK.
Vários pesquisadores argumentam que a PTK é um modelo ideal para estudar a cicatrização corneana, pois permite o estudo de processos apoptóticos, vitalidade dos ceratócitos, migração celular e inflamação tecidual local, entre outros aspectos18.
A importância deste trabalho relaciona-se não apenas ao estudo da cicatrização corneana e cicatrização de feridas, mas também à proposta de um novo modelo animal com potencial científico para que os resultados sejam extrapolados para outros modelos publicados anteriormente.
Este modelo animal, devido à sua semelhança e semelhança com o comportamento do olho humano, permite a reprodução de um mesmo protocolo com diferentes variantes e abre um precedente para o desenvolvimento de outros modelos, como modelos de ceratite infecciosa e neovascularização corneana, entre outros.
No entanto, este trabalho e este modelo animal têm algumas limitações. Primeiro, o gerbil não é um modelo animal generalizado, como camundongos, ratos ou coelhos. Por esta razão, pode não haver tantos reagentes quanto desejado. Em segundo lugar, a literatura disponível sobre oftalmologia em gerbilos também é muito limitada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao engenheiro Rodrigo de la Fuente por sua inestimável ajuda e suporte técnico. Agradecemos também a María Eugenia Corbela pela narração e a Priscilla Hazrún pela edição das figuras. Hugo Luján permitiu-nos utilizar as instalações do Centro de Investigação e Desenvolvimento em Imunologia e Doenças Infecciosas (CIDIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
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