Summary
Questo articolo descrive un nuovo modello animale sviluppato per studiare l'anatomia e l'istologia della cornea e dei suoi processi di guarigione. Questo nuovo modello animale utilizza il gerbillo mongolo, che ha una cornea con molte somiglianze con la cornea umana.
Abstract
Gli studi sulla guarigione delle ferite corneali sono stati condotti per lungo tempo e hanno contribuito a ridurre la sofferenza e sviluppare trattamenti che contribuiscono a migliorare la salute degli occhi dei pazienti. Storicamente, la guarigione corneale è stata studiata in roditori come topi e ratti, ma questi modelli potrebbero non imitare completamente i disturbi umani. Tuttavia, le informazioni su altri roditori come i gerbilli mongoli (Meriones unguiculatus) sono scarse nella ricerca corneale.
Qui, descriviamo una tecnica per sviluppare un nuovo modello animale per studiare la guarigione corneale dopo cheratectomia fotorefrattiva. A causa della limitata letteratura disponibile sulla cornea di M. unguiculatus, descriviamo anche un'analisi istologica della cornea normale. Queste tecniche di ricerca possono anche essere impiegate nello studio delle malattie degli occhi a causa della somiglianza tra le cornee dei gerbilli mongoli e gli esseri umani in termini di genetica, anatomia e fisiologia.
Introduction
Alcuni degli aspetti più importanti della guarigione delle ferite corneali, che sono preoccupazioni chiave per la chirurgia del segmento anteriore, sono l'integrità dell'architettura epiteliale, il mantenimento della trasparenza dello stroma corneale e, infine, il risultato in termini di proprietà refrattive della cornea1.
La cornea è il tessuto chiaro più esterno nella parte anteriore del bulbo oculare ed è, quindi, suscettibile di traumi, infezioni e ustioni; La guarigione compromessa di queste ferite può compromettere la salute visiva2.
Allo stato attuale, sono disponibili diversi modelli animali per studiare la guarigione corneale, e alcuni di essi sono migliori di altri, a seconda della specie e del tipo di meccanismo da studiare1. Ci sono alcune registrazioni di precedenti indagini sulla retina dei gerbilli2. Tuttavia, finora, non esiste letteratura pubblicata sui processi cicatriziali nella cornea di questi roditori.
Qui, presentiamo Meriones unguiculatus (gerbillo mongolo) come modello animale di guarigione delle ferite nella cornea. Vengono descritte le procedure per ottenere la guarigione corneale dopo cheratectomia fotorefrattiva, che ci permettono di studiare i diversi tipi di processi cicatriziali corneali, comprendere la guarigione delle ferite in termini di fasi dinamiche del tessuto vivente e, infine, pianificare appropriati trattamenti futuri3. La cheratectomia fototerapeutica è una tecnica altamente riproducibile con la possibilità di controllare con precisione parametri come la profondità e il diametro della lesione corneale4. Inoltre, questa tecnica non richiede procedure con strumenti chirurgici o soluzioni chimiche (ad esempio, soluzione salina, formalina, alcool, ecc.) che possono aggiungere variabili specifiche agli strumenti o all'operatore che esegue la procedura5.
Tre gerbilli maschi di 6 mesi di dimensioni e pesi simili (circa 90 g) sono stati utilizzati per l'esperimento presentato in questo articolo. Le procedure sono state eseguite solo con l'occhio destro. Un gerbillo (indicato come gerbillo 1 o controllo) non è stato sottoposto a cheratectomia fototerapeutica ed è stato enucleato per valutare tutte le normali strutture oculari. La cheratectomia fototerapeutica comporta l'erogazione controllata di luce ultravioletta generata dal laser ad eccimeri alla cornea ed è stata sviluppata per eseguire la chirurgia refrattiva6. È stato utilizzato in altri roditori, come i topi7. Gli altri due gerbilli sono stati sottoposti a cheratectomia fototerapeutica. Uno di questi è stato enucleato a 24 ore (indicato come gerbillo 2) e l'altro a 96 ore dopo l'intervento chirurgico (indicato come gerbillo 3).
Per eseguire questo esperimento, è stato filmato un gerbillo selezionato a caso per ogni condizione da studiare, ma questo esperimento è stato precedentemente eseguito con 16 gerbilli in totale per ogni condizione. Per motivi di editing, è stato deciso di utilizzare un gerbillo selezionato casualmente per ogni condizione (tre gerbilli in totale) come esempio.
L'obiettivo principale di questa ricerca è quello di esplorare il miglior modello animale disponibile. Tuttavia, è importante notare che non tutte le specie hanno caratteristiche oculari simili a quelle dell'occhio umano8. Questo articolo descrive la metodologia utilizzata per studiare la cornea di Meriones unguiculatus e la procedura eseguita per generare la lesione corneale, che ci permettono di studiare il processo di guarigione.
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Protocol
Tutte le procedure di ricerca sono state approvate dalla "Commissione istituzionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" dell'Universidad Católica de Córdoba e hanno seguito la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Queste procedure sono state approvate anche dalle autorità della "Facultad de Ciencias de la Salud" dell'Universidad Católica de Córdoba e dell'"Instituto de la Visión Cerro".
1. Manipolazione del gerbillo e anestesia
NOTA: Tutti gli animali erano specifici gerbilli mongoli maschi privi di patogeni (SFP) e sono stati tenuti nelle strutture del Centro di Ricerca e Sviluppo in Immunologia e Malattie Infettive (CIDIE) (Córdoba, Argentina). Sono stati ottenuti dall'Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentina).
- Ospitare i gerbilli socialmente in gabbie di polisulfone letto con letti di pannocchie. Fornire cibo e acqua di rubinetto filtrata in bottiglie d'acqua ad libitum. Assicurarsi che l'intervallo di temperatura ambiente sia compreso tra 18 °C e 24 °C e che venga utilizzato un ciclo luce-buio di 12:12 ore.
- Pesare ogni gerbillo separatamente e identificare ciascuno per evitare confusione. Fai un segno con un pennarello a inchiostro indelebile sulla base della coda del gerbillo. Usa una pinzetta per tenere l'orecchio del gerbillo e fare un segno usando il pennarello indelebile sull'orecchio del roditore. Se sono disponibili un laboratorio e un grande biotino, assegnare una gabbia unica per ciascun roditore con l'identificazione corrispondente.
- Disinfettare la cappa a flusso laminare con una soluzione di etanolo al 70%. Posizionare tutti gli strumenti chirurgici e monouso, inclusi aghi, siringhe e rastrelliere, nell'area di lavoro all'interno del cappuccio. Posizionare anche una schiuma chirurgica monouso nel cappuccio.
- Utilizzare un piccolo contenitore di plastica aperto per mantenere il roditore sulla bilancia di precisione per facilitare la misurazione.
- Usa tre gerbilli mongoli maschi di 6 mesi di dimensioni e pesi simili (~ 80 g) per questo esperimento. Uno alla volta, posizionare ogni gabbia con il roditore all'interno della cappa a flusso laminare. Apri le gabbie, identifica ciascuno dei gerbilli e pesali sulla bilancia.
NOTA: I gerbilli sono animali innocui ma delicati. Indossare guanti monouso quando si maneggiano i gerbilli. - Afferrare il gerbillo con la mano non dominante per tenerlo saldamente per la coda. Usa la mano dominante, con il pollice e l'indice dietro le orecchie, per tenere l'animale con la regione ventrale rivolta verso l'alto. Usa il mignolo per tenere la coda.
- Riempire una siringa con un ago da 30 G con 1 mL di ketamina e xilazina. Somministrare l'anestesia per via intraperitoneale nel roditore (50-100 mg/kg di ketamina e 2 mg/kg di xilazina)9 usando la mano dominante. La durata dell'effetto sarà di circa 20-50 minuti (possono verificarsi variazioni).
- Per assicurarsi che il gerbillo sia completamente anestetizzato, controllare con un pizzico della punta, un pizzico della coda e un riflesso corneale, ecc., Prima di fare incisioni nella cornea.
NOTA: Eseguire tutte le procedure solo nell'occhio destro.
2. Tomografia a coerenza ottica (OCT) della cornea
- Posizionare teli chirurgici sterili per proteggere l'apparecchiatura da secrezioni o peli di animali.
- Assicurati che uno degli operatori tenga l'animale mentre un altro operatore scatta le immagini. L'operatore deve appoggiare le mani sull'apparecchiatura mentre tiene il gerbillo in modo che l'occhio del gerbillo sia il più stabile e ancora possibile da studiare. Appoggia la mano che tiene il gerbillo sul poggiamento del mento..
- Avviare il software che controlla lo Strumento di personalizzazione di Office, premere Scatta immagine , quindi Salva immagine desiderata. Eseguire più fette sagittali e coronali della cornea. Immagina l'occhio sotto l'OCT e crea più fette per visualizzare il segmento anteriore della cornea del roditore.
NOTA: Se l'immagine ottenuta non è nitida e l'occhio si è leggermente spostato, ripetere la procedura più volte per ottenere immagini sufficienti. - Utilizzando il software OCT, eseguire misure pachimetriche delle regioni centrali e periferiche. Nella schermata principale del software, premere Scatta immagine, quindi premere il pulsante Salva immagine desiderata .
- Eseguire misurazioni sull'occhio normale o di controllo e immediatamente dopo la cheratectomia fototerapeutica sugli altri occhi dei roditori.
3. Cheratectomia fototerapeutica laser ad eccimeri (PTK)
- Posizionare teli chirurgici sterili sul dispositivo laser ad eccimeri per proteggere l'apparecchiatura da secrezioni o peli di animali.
- Instillare una goccia di proparacaina cloridrato topica (0,5%) nell'occhio da trattare 5 minuti prima della procedura chirurgica.
- Usa la mano non dominante per tenere saldamente il gerbillo. Con la mano dominante, apri le palpebre dell'animale in modo che le immagini possano essere catturate correttamente. Per essere in grado di mettere a fuoco e ottenere un'immagine nitida, assicurarsi che le mani della persona che tiene il gerbillo poggiano sulla testa dell'apparecchiatura. Posizionare le mani che tengono l'animale dove un paziente metterebbe il collo.
- Eseguire l'ablazione PTK sull'occhio destro. Utilizzare i seguenti parametri: un'ablazione tra 60 μm e 62 μm di spessore, una zona ottica di 3 mm, una durata di 4 s e un totale di 1.867 impulsi.
NOTA: PTK viene eseguito solo su gerbillo 2 e gerbillo 3. In questa fase, il secondo operatore prepara e attiva il laser per ablare il tessuto corneale. - Immediatamente dopo la procedura, scattare fotografie ed eseguire analisi OCT per registrare e documentare i cambiamenti superficiali negli occhi trattati.
- Una volta completata la procedura, riposizionare il roditore nella gabbia, monitorare i segni vitali (frequenza cardiaca: 360 battiti al minuto; temperatura rettale: 37-38,5 ° C; frequenza respiratoria: 90 respiri al minuto) e lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia.
4. Risveglio dei gerbilli dopo PTK corneale
- Somministrare buprenorfina (da 0,1 mg/kg a 0,05 mg/kg) e atipamezolo (0,1-1 mg/kg) tramite iniezioni intraperitoneali.
- Posizionare ogni gerbillo nella rispettiva gabbia domestica e monitorare i segni vitali per il normale risveglio (la temperatura corporea normale è 37-39 ° C).
- Applicare un unguento eritromicina per mantenere la superficie pulita e prevenire l'infezione. Eseguire questa procedura due volte al giorno.
- Somministrare buprenorfina (ogni 6-12 ore) per via sottocutanea (0,01-0,05 ml) per analgesia e unguento oculare per due giorni consecutivi dopo PTK.
5. Metodo dell'eutanasia
- Esegui l'eutanasia nella gabbia domestica quando possibile.
- Introdurre anidride carbonica compressa (CO2) nella gabbia domestica. Una velocità di riempimento del 30% -70% del volume della camera al minuto con CO2 aggiunto all'aria esistente nella gabbia domestica è sufficiente per ottenere una miscela che soddisfi l'obiettivo (per una camera di volume da 10 L, utilizzare una portata di 3-7 L / min). Utilizzare la dislocazione cervicale (come metodo secondario di eutanasia) per garantire la morte del roditore.
- A 24 h e 96 h dopo l'intervento chirurgico per gerbillo 2 e gerbillo 3, rispettivamente, rimuovere l'animale dalla gabbia domestica per eseguire l'enucleazione del bulbo oculare (sia il bulbo oculare normale che quello sottoposto a intervento chirurgico) per osservare la guarigione corneale.
- Posizionare l'animale sul tavolo operatorio e verificare l'assenza di battito cardiaco per circa 1 minuto.
6. Chirurgia oculare
- Rimuovere le palpebre superiori e inferiori per accedere al bulbo oculare. Utilizzare pinze chirurgiche e forbici per rimuovere le palpebre. La dimensione dell'area di lavoro è così piccola e delicata che la rimozione delle palpebre consente di enucleare il bulbo oculare senza danneggiarlo.
- Per enucleare il bulbo oculare, praticare un'incisione nel canto esterno e guidare le forbici in direzione posteriore. Ripetere questa procedura dal canto interno separando il bulbo oculare dall'orbita.
- Sezione il nervo ottico nella parte posteriore del bulbo oculare. Va chiarito che il plesso orbitale posteriore di solito genera un leggero sanguinamento quando si esegue questa tecnica, il che rende difficile il lavoro.
- Introdurre il bulbo oculare in un tubo di microcentrifuga con soluzione salina sterile per 30 s a 1 minuto per lavare il sangue residuo.
- Posizionare il bulbo oculare in una provetta da microcentrifuga contenente il 10% di formaldeide per successive analisi anatomo-patologiche come descritto di seguito. Scatta più immagini e fotografie.
7. Analisi anatomo-patologica
- Incorporare l'intero occhio in formalina tamponata al 10% per 6-24 ore.
- Tagliare il tessuto usando un microtomo. Assicurarsi che il tessuto tagliato abbia uno spessore di 3 mm.
- Immergere il tessuto in alcool al 96% per 30-90 minuti e ripetere questa procedura due volte.
- Mettere il tessuto in alcool isopropilico per 30-90 minuti e ripetere questa procedura due volte.
- Metti il tessuto in xilene o sostituto dello xilene per 1-3 ore.
- Incorporare il tessuto in cherosene liquido per almeno 1 ora.
- Utilizzare un blocco per posizionare il tessuto e incorporarlo in paraffina liquida. Lasciarlo solidificare (metterlo in un luogo freddo) e tagliarlo.
- Preparare il microtomo per il sezionamento secondo le istruzioni del produttore.
- Successivamente, utilizzare macchie come l'ematossilina e l'eosina.
- Ottenere immagini con la fotocamera aggiunta al microscopio.
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Representative Results
Nel presente studio, l'intera struttura corneale è stata accuratamente analizzata utilizzando tecniche istologiche e studi complementari del segmento anteriore, come la tomografia a coerenza ottica. L'analisi delle immagini mediante tomografia a coerenza ottica delle strutture del segmento anteriore mostra un epitelio e uno stroma normali (Figura 1), con spessori corneali centrali e periferici rispettivamente di 160 μm e 106 μm ± 2 μm. Altre pubblicazioni hanno anche dimostrato che la cornea di altri roditori diventa più sottile verso la periferia10.
Dopo PTK, è stato osservato lo sbrigliamento dell'epitelio corneale (Figura 2). Sono state anche scattate immagini macroscopiche dell'occhio di gerbillo prima e dopo il trattamento. Dopo aver eseguito PTK, è stata osservata una superficie corneale irregolare, che è stata macchiata instillando una goccia di fluoresceina e illuminandola con luce viola (che mostra l'ulcera epiteliale) (Figura 3).
Per quanto riguarda l'analisi istologica, la cornea normale del gerbillo non trattato (gerbillo 1) ha mostrato gli stessi strati dell'uomo: l'epitelio anteriore stratificato con da quattro a sei strati di cellule, che rappresentano il 28% dello spessore totale della cornea, lo strato di Bowman, lo stroma, che rappresenta il 66% dello spessore totale della cornea, la membrana di Descemet, e l'endotelio (Figura 4 e Figura 5).
I cambiamenti osservati nel gerbillo numero 2 (24 ore dopo PTK) sono stati un'ulcera nella cornea, sfaculazione dell'epitelio anteriore adiacente, macchie multiple di acantolisi epiteliale e discheratocytes isolati, infiltrato infiammatorio subepiteliale acuto ed edema a livello dello stroma (Figura 6).
I cambiamenti osservati nel gerbillo numero 3 (96 ore dopo PTK) sono stati la presenza di edema maggiore rispetto al gerbillo numero 2, disaggregazione delle fibre e delle cellule stromali, completa rigenerazione dell'epitelio anteriore e nessun infiltrato infiammatorio (Figura 7).
In sintesi, la colorazione istologica dimostra il normale processo di guarigione della ferita nell'epitelio corneale e nello stroma superficiale, con infiltrato infiammatorio ed edema.
Figura 1: Imaging rappresentativo OCT della cornea normale. La cornea può essere vista nella sua dimensione completa (con una misurazione dello spessore al suo apice di 160 μm e misure di spessore di 108 μm e 110 μm nella periferia), e la camera anteriore, l'angolo iridocorneale, l'iride e il cristallino (sporgente nella camera anteriore) possono anche essere visti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Imaging rappresentativo dell'OCT della cornea prima e dopo la PTK . (A) Immagine della cornea normale. (B) Immagine corneale 10 minuti dopo PTK. La freccia a sinistra mostra il bordo di un'ulcera con un accumulo di detriti cellulari, e la freccia a destra mostra anche detriti sulla superficie corneale tipici dell'intervento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Macrofotografia rappresentativa del bulbo oculare del gerbillo (occhio destro). (A) Superficie regolare del bulbo oculare normale. (B) Immagine scattata 5 minuti dopo l'esecuzione della PTK, che mostra irregolarità sulla superficie corneale. (C) Evidenza di un'ulcera corneale colorata con fluoresceina allo 0,25% utilizzando una sorgente luminosa a LED (viola). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Sezione istologica completa rappresentativa (antero-posteriore) dell'intera cornea normale del gerbillo (40x) colorata con H&E. (A) I frammenti periferici e centrali sono incorniciati. La barra della scala è di 20 μm. (B-D) La periferia della cornea mostra un epitelio più sottile con meno stratificazione e un numero ridotto di fibre stromali. La figura mostra un endotelio leggermente distaccato nella periferia della cornea, che è dovuto a un artefatto della tecnica. Di conseguenza, lo spessore corneale periferico è più sottile di quello centrale. (C) Lo spessore misurato è simile allo spessore calcolato con le immagini dello PTOM Sia l'epitelio che lo stroma mostrano uno spessore maggiore a livello dell'apice corneale. La barra della scala è di 40 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Cornea normale rappresentativa del gerbillo mongolo colorato con H&E (gerbillo numero 1). Si osservano i cinque strati della cornea e l'epitelio intatto. La barra della scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Cornea rappresentativa 24 ore dopo cheratectomia fototerapeutica laser ad eccimeri (PTK) (colorata con H&E). La freccia mostra il bordo dell'ulcera corneale (gerbillo numero 2). La barra della scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Cornea rappresentativa 96 ore dopo cheratectomia fototerapeutica laser ad eccimeri (PTK). Colorato con H & E; Gerbillo numero 3. L'epitelio rigenerato e l'edema stromale sono osservati in questa figura. La barra della scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La fisiologia della guarigione delle ferite corneali è un equilibrio tra la rigenerazione dei tessuti e il mantenimento dell'omeostasi. Un'eccessiva guarigione delle ferite può portare a fibrosi e cicatrici, che alla fine possono comportare la perdita della funzione degli organi. Con la rapida evoluzione delle procedure chirurgiche corneali, l'importanza di comprendere la guarigione delle ferite corneali e gli eventi fisiologici e patologici coinvolti non può essere sopravvalutata11.
Diversi lavori di ricerca affermano che i gerbilli hanno molte caratteristiche sensoriali che li rendono una specie favorevole per gli studi sulla visione, tra cui principalmente il comportamento diurno12 e la visione superiore e più acuta rispetto ai topi o ai ratti13. La loro struttura retinica è più analoga a quella degli esseri umani14. Per questo motivo, sono stati utilizzati come modello animale per lo sviluppo di infezioni parassitarie retiniche15, farmaci terapeutici, rilascio genico e per lo studio della fisiologia retinica. Inoltre, recenti analisi genetiche pubblicate hanno dimostrato che la maggior parte dei geni del gerbillo identificati (81%) sono condivisi tra topi e umani16. Inoltre, gli studi hanno documentato le somiglianze genetiche tra i gerbilli e topi e gli esseri umani, identificando importanti somiglianze e differenze tra le specie17. Pertanto, abbiamo scelto l'attuale modello animale di gerbilli per studiare le normali strutture corneali e i loro processi fisiopatologici associati alle cicatrici PTK.
Diversi ricercatori sostengono che il PTK è un modello ideale per studiare le cicatrici corneali perché consente lo studio dei processi apoptotici, della vitalità dei cheratociti, della migrazione cellulare e dell'infiammazione dei tessuti locali, tra gli altri aspetti18.
L'importanza di questo lavoro riguarda non solo lo studio delle cicatrici corneali e la guarigione delle ferite, ma anche la proposta di un nuovo modello animale con il potenziale scientifico per i risultati da estrapolare ad altri modelli precedentemente pubblicati.
Questo modello animale, grazie alla sua somiglianza e somiglianza con il comportamento dell'occhio umano, consente la riproduzione dello stesso protocollo con diverse varianti e stabilisce un precedente per lo sviluppo di altri modelli, come modelli di cheratite infettiva e neovascolarizzazione corneale, tra gli altri.
Tuttavia, questo lavoro e questo modello animale hanno alcune limitazioni. Innanzitutto, il gerbillo non è un modello animale diffuso come topi, ratti o conigli. Per questo motivo, potrebbero non esserci tutti i reagenti desiderati. In secondo luogo, anche la letteratura disponibile sull'oftalmologia nei gerbilli è molto limitata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare l'ingegnere Rodrigo de la Fuente per il suo prezioso aiuto e supporto tecnico. Ringraziamo anche María Eugenia Corbela per la narrazione e Priscilla Hazrún per l'edizione delle figure. Hugo Luján ci ha permesso di utilizzare le strutture del Centro di ricerca e sviluppo in immunologia e malattie infettive (CIDIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
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