Summary
Cet article décrit un nouveau modèle animal développé pour étudier l’anatomie et l’histologie de la cornée et ses processus de guérison. Ce nouveau modèle animal utilise la gerbille de Mongolie, qui a une cornée présentant de nombreuses similitudes avec la cornée humaine.
Abstract
Les études sur la cicatrisation des plaies cornéennes sont menées depuis longtemps et ont permis de réduire la souffrance et de développer des traitements qui contribuent à améliorer la santé oculaire des patients. Historiquement, la guérison cornéenne a été étudiée chez des rongeurs tels que les souris et les rats, mais ces modèles pourraient ne pas imiter complètement les troubles humains. Cependant, les informations sur d’autres rongeurs tels que les gerbilles de Mongolie (Meriones unguiculatus) sont rares dans la recherche cornéenne.
Ici, nous décrivons une technique pour développer un nouveau modèle animal pour étudier la cicatrisation cornéenne après une kératectomie photoréfractive. En raison de la littérature limitée disponible sur la cornée de M. unguiculatus, nous décrivons également une analyse histologique de la cornée normale. Ces techniques de recherche peuvent également être utilisées dans l’étude des maladies oculaires en raison de la similitude entre les cornées des gerbilles mongoles et les humains en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie.
Introduction
Certains des aspects les plus importants de la cicatrisation des plaies cornéennes, qui sont des préoccupations clés pour la chirurgie du segment antérieur, sont l’intégrité de l’architecture épithéliale, le maintien de la transparence du stroma cornéen et, enfin, le résultat en termes de propriétés réfractives de la cornée1.
La cornée est le tissu clair le plus externe à l’avant du globe oculaire et est donc sensible aux traumatismes, aux infections et aux brûlures; L’altération de la cicatrisation de ces plaies peut compromettre la santé visuelle2.
À l’heure actuelle, plusieurs modèles animaux sont disponibles pour étudier la cicatrisation cornéenne, et certains d’entre eux sont meilleurs que d’autres, selon les espèces et le type de mécanisme à étudier1. Il existe quelques enregistrements d’investigations antérieures sur la rétine des gerbilles2. Cependant, jusqu’à présent, il n’existe aucune littérature publiée sur les processus de cicatrisation dans la cornée de ces rongeurs.
Ici, nous présentons Meriones unguiculatus (gerbille de Mongolie) comme un modèle animal de cicatrisation des plaies dans la cornée. Les procédures pour provoquer la cicatrisation cornéenne après la kératectomie photoréfractive sont décrites, ce qui nous permet d’étudier les différents types de processus de cicatrisation cornéenne, de comprendre la cicatrisation des plaies en termes de phases dynamiques des tissus vivants et, enfin, de planifier les traitements futurs appropriés3. La kératectomie photothérapeutique est une technique hautement reproductible avec la possibilité de contrôler avec précision des paramètres tels que la profondeur et le diamètre de la lésion cornéenne4. De plus, cette technique ne nécessite pas de procédures avec des instruments chirurgicaux ou des solutions chimiques (par exemple, solution saline, formol, alcool, etc.) qui peuvent ajouter des variables spécifiques aux instruments ou à l’opérateur effectuant l’intervention5.
Trois gerbilles mâles de 6 mois de tailles et de poids similaires (environ 90 g) ont été utilisées pour l’expérience présentée dans cet article. Les procédures n’ont été effectuées que dans les yeux droits. Une gerbille (appelée gerbille 1 ou témoin) n’a pas subi de kératectomie photothérapeutique et a été énucléée pour évaluer toutes les structures oculaires normales. La kératectomie photothérapeutique implique l’administration contrôlée de la lumière ultraviolette excimère générée par laser à la cornée et a été développée afin d’effectuer une chirurgie réfractive6. Il a été utilisé chez d’autres rongeurs, tels que les souris7. Les deux autres gerbilles ont subi une kératectomie photothérapeutique. L’un d’eux a été énucléé à 24 h (appelé gerbille 2) et l’autre à 96 h après la chirurgie (appelé gerbille 3).
Pour réaliser cette expérience, une gerbille sélectionnée au hasard a été filmée pour chaque condition à étudier, mais cette expérience a déjà été réalisée avec 16 gerbilles au total pour chaque condition. Pour des raisons d’édition, il a été décidé d’utiliser une gerbille choisie au hasard pour chaque condition (trois gerbilles au total) comme exemple.
L’objectif principal de cette recherche est d’explorer le meilleur modèle animal disponible. Cependant, il est important de noter que toutes les espèces n’ont pas des caractéristiques oculaires similaires à celles de l’œil humain8. Cet article décrit la méthodologie utilisée pour étudier la cornée de Meriones unguiculatus et la procédure effectuée pour générer la lésion cornéenne, ce qui nous permet d’étudier le processus de guérison.
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Protocol
Toutes les procédures de recherche ont été approuvées par la « Commission institutionnelle pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » de l’Universidad Católica de Córdoba et ont suivi le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Ces procédures ont également été approuvées par les autorités de la « Facultad de Ciencias de la Salud » de l’Universidad Católica de Córdoba et de l'"Instituto de la Visión Cerro ».
1. Manipulation des gerbilles et anesthésie
NOTE: Tous les animaux étaient des gerbilles mongoles mâles exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SFP) et étaient gardés dans les installations du Centre de recherche et de développement en immunologie et maladies infectieuses (CIDIE) (Córdoba, Argentine). Ils ont été obtenus de l’Université de La Plata (Buenos Aires, Argentine).
- Abritez les gerbilles socialement dans des cages en polysulfone recouvertes d’une litière en épi de maïs. Fournir de la nourriture et de l’eau du robinet filtrée dans des bouteilles d’eau ad libitum. Assurez-vous que la plage de température ambiante est comprise entre 18 °C et 24 °C et qu’un cycle lumière-obscurité de 12:12 h est utilisé.
- Pesez chaque gerbille séparément et identifiez-les pour éviter toute confusion. Faites une marque avec un marqueur d’encre indélébile sur la base de la queue de la gerbille. Utilisez une pince à épiler pour tenir l’oreille de la gerbille et faites une marque en utilisant le marqueur indélébile sur l’oreille du rongeur. Si un laboratoire et un grand biotherium sont disponibles, attribuer une cage unique à chaque rongeur avec l’identification correspondante.
- Désinfectez la hotte à flux laminaire avec une solution d’éthanol à 70%. Placez tous les instruments chirurgicaux et jetables, y compris les aiguilles, les seringues et les racks, dans la zone de travail à l’intérieur de la hotte. Placez également une mousse chirurgicale jetable dans la cagoule.
- Utilisez un petit récipient en plastique ouvert pour maintenir le rongeur sur la balance de précision afin de faciliter la mesure.
- Utilisez trois gerbilles mongoles mâles de 6 mois de tailles et de poids similaires (~ 80 g) pour cette expérience. Une à la fois, placez chaque cage avec le rongeur à l’intérieur de la hotte à flux laminaire. Ouvrez les cages, identifiez chacune des gerbilles et pesez-les sur la balance.
NOTE: Les gerbilles sont des animaux inoffensifs mais délicats. Portez des gants jetables lorsque vous manipulez les gerbilles. - Saisissez la gerbille avec la main non dominante pour la tenir fermement par la queue. Utilisez la main dominante, avec le pouce et l’index derrière les oreilles, pour tenir l’animal avec la région ventrale tournée vers le haut. Utilisez le petit doigt pour tenir la queue.
- Remplissez une seringue avec une aiguille de 30 G avec 1 mL de kétamine et de xylazine. Administrer l’anesthésie par voie intrapéritonéale au rongeur (50-100 mg/kg de kétamine et 2 mg/kg de xylazine)9 avec la main dominante. La durée de l’effet sera d’environ 20-50 min (des variations peuvent survenir).
- Pour vous assurer que la gerbille est complètement anesthésiée, vérifiez avec un pincement d’orteil, un pincement de la queue et un reflet cornéen, etc., avant de faire des incisions dans la cornée.
REMARQUE: Effectuez toutes les procédures dans l’œil droit uniquement.
2. Tomographie par cohérence optique (TCO) de la cornée
- Placez des champs chirurgicaux stériles pour protéger l’équipement des sécrétions ou des poils d’animaux.
- Assurez-vous que l’un des opérateurs tient l’animal pendant qu’un autre opérateur prend les images. L’opérateur doit reposer ses mains sur l’équipement tout en tenant la gerbille afin que l’œil de la gerbille soit aussi stable et immobile que possible à étudier. Posez la main tenant la gerbille sur le repose-menton.
- Démarrez le logiciel qui contrôle l’OPO, appuyez sur Prendre l’image , puis sur Enregistrer l’image souhaitée. Effectuer plusieurs tranches sagittales et coronales de la cornée. Imagez l’œil sous l’OCT et faites plusieurs tranches pour voir le segment antérieur de la cornée du rongeur.
REMARQUE: Si l’image obtenue n’est pas nette et que l’œil a légèrement bougé, répétez la procédure plusieurs fois pour obtenir suffisamment d’images. - À l’aide du logiciel OCT, effectuer des mesures pachymétriques des régions centrales et périphériques. Dans l’écran principal du logiciel, appuyez sur Prendre l’image, puis appuyez sur le bouton Enregistrer l’image souhaitée.
- Effectuer des mesures sur l’œil normal ou témoin et immédiatement après la kératectomie photothérapeutique sur les autres yeux de rongeurs.
3. Kérérectomie photothérapeutique au laser excimer (PTK)
- Placez des champs chirurgicaux stériles sur le dispositif laser excimer pour protéger l’équipement des sécrétions ou des poils d’animaux.
- Instiller une goutte de chlorhydrate de proparacaïne topique (0,5%) dans l’œil à traiter 5 min avant l’intervention chirurgicale.
- Utilisez la main non dominante pour tenir fermement la gerbille. Avec la main dominante, ouvrez les paupières de l’animal afin que les images puissent être capturées correctement. Pour pouvoir faire la mise au point et obtenir une image nette, assurez-vous que les mains de la personne tenant la gerbille reposent sur la tête de l’équipement. Placez les mains tenant l’animal à l’endroit où un patient placerait son cou.
- Effectuer l’ablation PTK sur l’œil droit. Utilisez les paramètres suivants : une ablation entre 60 μm et 62 μm d’épaisseur, une zone optique de 3 mm, une durée de 4 s et un total de 1 867 impulsions.
REMARQUE: PTK est effectué uniquement sur gerbille 2 et gerbille 3. Dans cette étape, le deuxième opérateur prépare et active le laser pour ablater le tissu cornéen. - Immédiatement après l’intervention, prendre des photos et effectuer une analyse OCT pour enregistrer et documenter les changements de surface dans les yeux traités.
- Une fois la procédure terminée, replacez le rongeur dans la cage, surveillez les signes vitaux (fréquence cardiaque : 360 battements par minute ; température rectale : 37-38,5 °C ; fréquence respiratoire : 90 respirations par minute) et laissez l’animal se remettre de l’anesthésie.
4. Réveil des gerbilles après PTK cornéenne
- Administrer de la buprénorphine (0,1 mg / kg à 0,05 mg / kg) et de l’atipamézole (0,1-1 mg / kg) par injections intrapéritonéales.
- Placez chaque gerbille dans sa cage respective et surveillez les signes vitaux pour un réveil normal (la température corporelle normale est de 37-39 ° C).
- Appliquez une pommade à l’érythromycine pour garder la surface propre et prévenir l’infection. Effectuez cette procédure deux fois par jour.
- Administrer la buprénorphine (toutes les 6 à 12 h) par voie sous-cutanée (0,01 à 0,05 mL) pour l’analgésie et la pommade oculaire deux jours consécutifs après la PTK.
5. Méthode d’euthanasie
- Pratiquez l’euthanasie dans la cage familiale dans la mesure du possible.
- Introduisez du dioxyde de carbone comprimé (CO2) dans la cage domestique. Un taux de remplissage de 30 % à 70 % du volume de la chambre par minute avec du CO2 ajouté à l’air existant dans la cage domestique est suffisant pour obtenir un mélange qui répond à l’objectif (pour une chambre de volume de 10 L, utiliser un débit de 3-7 L/min). Utilisez la luxation cervicale (comme méthode secondaire d’euthanasie) pour assurer la mort du rongeur.
- À 24 h et 96 h après la chirurgie de la gerbille 2 et de la gerbille 3, respectivement, retirez l’animal de la cage domestique pour effectuer l’énucléation du globe oculaire (à la fois le globe oculaire normal et celui subissant une intervention chirurgicale) pour observer la cicatrisation cornéenne.
- Placez l’animal sur la table d’opération et vérifiez l’absence de battement de cœur pendant environ 1 min.
6. Chirurgie oculaire
- Retirez les paupières supérieures et inférieures pour accéder au globe oculaire. Utilisez des pinces chirurgicales et des ciseaux pour enlever les paupières. La taille de la zone de travail est si petite et délicate que l’élimination des paupières permet d’énucléer le globe oculaire sans l’endommager.
- Pour énucléer le globe oculaire, faites une incision dans le canthus externe et guidez les ciseaux dans une direction postérieure. Répétez cette procédure à partir du canthus interne en séparant le globe oculaire de l’orbite.
- Section du nerf optique à l’arrière du globe oculaire. Il convient de préciser que le plexus orbitaire postérieur génère généralement de légers saignements lors de l’exécution de cette technique, ce qui rend le travail difficile.
- Introduisez le globe oculaire dans un tube microcentrifuge avec une solution saline stérile pendant 30 s à 1 min pour éliminer tout sang résiduel.
- Placer le globe oculaire dans un tube microcentrifuge contenant 10% de formaldéhyde pour une analyse anatomo-pathologique ultérieure comme décrit ci-dessous. Prenez plusieurs images et photographies.
7. Analyse anatomo-pathologique
- Incorporer l’œil entier dans du formol tamponné à 10% pendant 6-24 h.
- Couper le tissu à l’aide d’un microtome. Assurez-vous que le tissu coupé a une épaisseur de 3 mm.
- Trempez le tissu dans de l’alcool à 96% pendant 30-90 min, et répétez cette procédure deux fois.
- Placez le tissu dans de l’alcool isopropylique pendant 30-90 min, et répétez cette procédure deux fois.
- Mettez le tissu dans du xylène ou un substitut de xylène pendant 1-3 h.
- Encastrer le tissu dans du kérosène liquide pendant 1 h minimum.
- Utilisez un bloc pour placer le tissu et l’incorporer dans de la paraffine liquide. Laissez-le se solidifier (placez-le dans un endroit froid) et coupez-le.
- Préparer le microtome pour la section selon les instructions du fabricant.
- Par la suite, utilisez des colorants tels que l’hématoxyline et l’éosine.
- Obtenez des images avec l’appareil photo ajouté au microscope.
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Representative Results
Dans la présente étude, toute la structure cornéenne a été analysée en profondeur à l’aide de techniques histologiques et d’études complémentaires du segment antérieur, telles que la tomographie par cohérence optique. L’analyse d’images par tomographie par cohérence optique des structures du segment antérieur montre un épithélium et un stroma normaux (Figure 1), avec des épaisseurs cornéennes centrale et périphérique de 160 μm et 106 μm ± 2 μm, respectivement. D’autres publications ont également montré que la cornée des autres rongeurs devient plus mince vers la périphérie10.
Après PTK, le débridement de l’épithélium cornéen a été observé (Figure 2). Des photos macroscopiques de l’œil de gerbille avant et après le traitement ont également été prises. Après avoir effectué une PTK, une surface cornéenne irrégulière a été observée, qui a été colorée en instillant une goutte de fluorescéine et en l’éclairant de lumière violette (montrant l’ulcère épithélial) (Figure 3).
Concernant l’analyse histologique, la cornée normale de la gerbille non traitée (gerbille 1) présentait les mêmes couches que chez l’homme : l’épithélium antérieur stratifié avec quatre à six couches de cellules, représentant 28% de l’épaisseur totale de la cornée, la couche de Bowman, le stroma, représentant 66% de l’épaisseur totale de la cornée, la membrane de Descemet, et l’endothélium (Figure 4 et Figure 5).
Les changements observés dans la gerbille numéro 2 (24 h après PTK) étaient un ulcère de la cornée, une sphacelation de l’épithélium antérieur adjacent, de multiples taches d’acantholyse épithéliale et de dischématocytes isolés, un infiltrat inflammatoire sous-épithélial aigu et un œdème au niveau du stroma (Figure 6).
Les changements observés dans la gerbille numéro 3 (96 h après PTK) étaient la présence d’un œdème plus important que chez la gerbille numéro 2, la désagrégation des fibres et des cellules stromales, la régénération complète de l’épithélium antérieur et l’absence d’infiltrat inflammatoire (Figure 7).
En résumé, la coloration histologique démontre le processus normal de cicatrisation des plaies dans l’épithélium cornéen et le stroma superficiel, avec infiltrat inflammatoire et œdème.
Figure 1 : Imagerie OCT représentative de la cornée normale. La cornée peut être vue dans sa taille réelle (avec une mesure d’épaisseur à son sommet de 160 μm et des mesures d’épaisseur de 108 μm et 110 μm à la périphérie), et la chambre antérieure, l’angle irido-cornéen, l’iris et le cristallin (dépassant dans la chambre antérieure) peuvent également être vus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie OCT représentative de la cornée avant et après PTK. (A) Image de la cornée normale. (B) Image cornéenne 10 min après PTK. La flèche à gauche montre le bord d’un ulcère avec une accumulation de débris cellulaires, et la flèche à droite montre également des débris sur la surface cornéenne typiques de la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Photographie macro représentative du globe oculaire de la gerbille (œil droit). (A) Surface régulière du globe oculaire normal. (B) Image prise 5 minutes après la réalisation du PTK, montrant des irrégularités sur la surface cornéenne. (C) Preuve d’un ulcère cornéen coloré avec 0,25% de fluorescéine à l’aide d’une source lumineuse LED (violet). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coupe histologique complète représentative (antéro-postérieure) de toute la cornée normale de la gerbille (40x) colorée au H&E. (A) Les fragments périphériques et centraux sont encadrés. La barre d’échelle est de 20 μm. (B-D) La périphérie de la cornée montre un épithélium plus mince avec moins de stratification et un nombre réduit de fibres stromales. La figure montre un endothélium légèrement détaché à la périphérie de la cornée, ce qui est dû à un artefact de la technique. Par conséquent, l’épaisseur cornéenne périphérique est plus mince que l’épaisseur centrale. (C) L’épaisseur mesurée est similaire à l’épaisseur calculée avec les images OCT. L’épithélium et le stroma montrent une plus grande épaisseur au niveau de l’apex cornéen. La barre d’échelle est de 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cornée normale représentative de la gerbille mongole colorée H&E (gerbille numéro 1). Les cinq couches de la cornée et l’épithélium intact sont observées. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Cornée représentative 24 h après kératectomie photothérapeutique au laser excimer (PTK) (colorée avec H&E). La flèche montre le bord de l’ulcère cornéen (gerbille numéro 2). La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Cornée représentative 96 h après kératectomie photothérapeutique au laser excimer (PTK). Taché de H & E; Gerbille numéro 3. L’épithélium régénéré et l’œdème stromal sont observés sur cette figure. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La physiologie de la cicatrisation des plaies cornéennes est un équilibre entre la régénération tissulaire et le maintien de l’homéostasie. Une cicatrisation excessive des plaies peut entraîner une fibrose et des cicatrices, ce qui peut finalement entraîner la perte de la fonction des organes. Avec l’évolution rapide des interventions chirurgicales cornéennes, l’importance de comprendre la cicatrisation des plaies cornéennes et les événements physiologiques et pathologiques impliqués ne peut être surestimée11.
De nombreux travaux de recherche affirment que les gerbilles ont de nombreuses caractéristiques sensorielles qui en font une espèce favorable pour les études de vision, y compris principalement le comportement diurne12 et une vision supérieure et plus aiguë par rapport aux souris ou aux rats13. Leur structure rétinienne est plus analogue à celle des humains14. Pour cette raison, ils ont été utilisés comme modèle animal pour le développement d’infections parasitaires rétiniennes15, de médicaments thérapeutiques, d’administration de gènes et d’étude de la physiologie rétinienne. De plus, des analyses génétiques publiées récemment ont montré que la plupart des gènes de gerbilles identifiés (81%) sont partagés entre les souris et les humains16. De plus, des études ont documenté les similitudes génétiques entre les gerbilles et les souris et les humains, identifiant des similitudes et des différences importantes entre les espèces17. Par conséquent, nous avons choisi le modèle animal actuel de gerbilles pour étudier les structures cornéennes normales et leurs processus physiopathologiques associés à la cicatrisation PTK.
Plusieurs chercheurs soutiennent que PTK est un modèle idéal pour étudier la cicatrisation cornéenne car il permet l’étude des processus apoptotiques, de la vitalité des kératopocytes, de la migration cellulaire et de l’inflammation tissulaire locale, entre autres aspects18.
L’importance de ce travail concerne non seulement l’étude de la cicatrisation cornéenne et de la cicatrisation des plaies, mais aussi la proposition d’un nouveau modèle animal ayant le potentiel scientifique d’extrapoler les résultats à d’autres modèles publiés précédemment.
Ce modèle animal, en raison de sa similitude et de sa ressemblance avec le comportement de l’œil humain, permet la reproduction du même protocole avec différentes variantes et crée un précédent pour le développement d’autres modèles, tels que les modèles de kératite infectieuse et de néovascularisation cornéenne, entre autres.
Cependant, ce travail et ce modèle animal ont certaines limites. Premièrement, la gerbille n’est pas un modèle animal répandu comme les souris, les rats ou les lapins. Pour cette raison, il se peut qu’il n’y ait pas autant de réactifs que souhaité. Deuxièmement, la littérature disponible sur l’ophtalmologie chez les gerbilles est également très limitée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier l’ingénieur Rodrigo de la Fuente pour son aide précieuse et son soutien technique. Nous remercions également María Eugenia Corbela pour la narration et Priscilla Hazrún pour l’édition des figures. Hugo Luján nous a permis d’utiliser les installations du Centre de recherche et de développement en immunologie et maladies infectieuses (CIDIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
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