Summary
Este artículo describe un nuevo modelo animal desarrollado para estudiar la anatomía e histología de la córnea y sus procesos de curación. Este nuevo modelo animal utiliza el jerbo mongol, que tiene una córnea con muchas similitudes con la córnea humana.
Abstract
Los estudios de cicatrización de heridas corneales se han realizado durante mucho tiempo y han ayudado a reducir el sufrimiento y desarrollar tratamientos que contribuyen a mejorar la salud ocular de los pacientes. Históricamente, la curación corneal se ha estudiado en roedores como ratones y ratas, pero estos modelos podrían no imitar completamente los trastornos humanos. Sin embargo, la información sobre otros roedores como el jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es escasa en la investigación corneal.
Aquí, describimos una técnica para desarrollar un nuevo modelo animal para estudiar la curación corneal después de la queratectomía fotorrefractiva. Debido a la limitada literatura disponible sobre la córnea de M. unguiculatus, también describimos un análisis histológico de la córnea normal. Estas técnicas de investigación también se pueden emplear en el estudio de enfermedades oculares debido a la similitud entre las córneas de los jerbos mongoles y los humanos en términos de genética, anatomía y fisiología.
Introduction
Algunos de los aspectos más importantes de la cicatrización de heridas corneales, que son preocupaciones clave para la cirugía del segmento anterior, son la integridad de la arquitectura epitelial, el mantenimiento de la transparencia del estroma corneal y, finalmente, el resultado en términos de las propiedades refractivas de la córnea1.
La córnea es el tejido transparente más externo en la parte frontal del globo ocular y, por lo tanto, es susceptible a traumatismos, infecciones y quemaduras; El deterioro de la cicatrización de estas heridas puede comprometer la salud visual2.
En la actualidad, se dispone de varios modelos animales para estudiar la curación corneal, y algunos de ellos son mejores que otros, dependiendo de la especie y del tipo de mecanismo a estudiar1. Hay algunos registros de investigaciones previas sobre la retina de jerbos2. Sin embargo, hasta el momento, no hay literatura publicada sobre los procesos de cicatrización en la córnea de estos roedores.
Aquí, presentamos Meriones unguiculatus (jerbo mongol) como un modelo animal de cicatrización de heridas en la córnea. Se describen los procedimientos para obtener la cicatrización corneal después de la queratectomía fotorrefractiva, que nos permiten estudiar los diferentes tipos de procesos de cicatrización corneal, comprender la cicatrización de heridas en términos de las fases dinámicas del tejido vivo y, finalmente, planificar tratamientos futuros apropiados3. La queratectomía fototerapéutica es una técnica altamente reproducible con la posibilidad de controlar con precisión parámetros como la profundidad y el diámetro de la lesión corneal4. Además, esta técnica no requiere procedimientos con instrumentos quirúrgicos o soluciones químicas (por ejemplo, solución salina, formalina, alcohol, etc.) que puedan agregar variables específicas de los instrumentos o del operador que realiza el procedimiento5.
Tres jerbos machos de 6 meses de edad de tamaños y pesos similares (aproximadamente 90 g) se utilizaron para el experimento presentado en este artículo. Los procedimientos solo se realizaron en los ojos derechos. Un jerbo (denominado jerbo 1 o control) no se sometió a queratectomía fototerapéutica y se enucleó para evaluar todas las estructuras oculares normales. La queratectomía fototerapéutica consiste en la administración controlada de luz ultravioleta generada por láser excimer a la córnea y fue desarrollada para realizar cirugía refractiva6. Se ha utilizado en otros roedores, como ratones7. Los otros dos jerbos fueron sometidos a queratectomía fototerapéutica. Uno de ellos fue enucleado a las 24 h (denominado jerbo 2) y el otro a las 96 h después de la cirugía (denominado jerbo 3).
Para realizar este experimento, se filmó un jerbo seleccionado al azar para cada condición a estudiar, pero este experimento se realizó previamente con 16 jerbos en total para cada condición. Por razones de edición, se decidió usar un jerbo seleccionado al azar para cada condición (tres jerbos en total) como ejemplo.
El objetivo principal de esta investigación es explorar el mejor modelo animal disponible. Sin embargo, es importante señalar que no todas las especies tienen características oculares similares a las del ojo humano8. Este artículo describe la metodología utilizada para estudiar la córnea de Meriones unguiculatus y el procedimiento realizado para generar la lesión corneal, que nos permite estudiar el proceso de cicatrización.
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Protocol
Todos los procedimientos de investigación fueron aprobados por la "Comisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" de la Universidad Católica de Córdoba y siguieron la Guía del Consejo Nacional de Investigaciones para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Estos procedimientos también fueron aprobados por las autoridades de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Católica de Córdoba y el Instituto de la Visión Cerro.
1. Manejo de jerbos y anestesia
NOTA: Todos los animales eran jerbos mongoles machos libres de patógenos específicos (SFP) y se mantuvieron en las instalaciones del Centro de Investigación y Desarrollo en Inmunología y Enfermedades Infecciosas (CIDIE) (Córdoba, Argentina). Se obtuvieron de la Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentina).
- Aloja a los jerbos socialmente en jaulas de polisulfona con cama de mazorca de maíz. Proporcione alimentos y agua del grifo filtrada en botellas de agua ad libitum. Asegúrese de que el rango de temperatura ambiente sea de 18 °C a 24 °C y que se utilice un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
- Pesa cada jerbo por separado e identifica cada uno para evitar confusiones. Haga una marca con un marcador de tinta indeleble en la base de la cola del jerbo. Use pinzas para sostener la oreja del jerbo y haga una marca usando el marcador indeleble en la oreja del roedor. Si hay un laboratorio y un biotherium grande disponibles, asigne una jaula única para cada roedor con la identificación correspondiente.
- Desinfecte la campana de flujo laminar con una solución de etanol al 70%. Coloque todos los instrumentos quirúrgicos y desechables, incluidas agujas, jeringas y bastidores, en el área de trabajo dentro de la capucha. Coloque una espuma quirúrgica desechable en la capucha también.
- Use un pequeño recipiente de plástico abierto para mantener al roedor en la balanza de precisión para facilitar la medición.
- Utilice tres jerbos mongoles machos de 6 meses de edad de tamaños y pesos similares (~ 80 g) para este experimento. Uno a la vez, coloque cada jaula con el roedor dentro de la campana de flujo laminar. Abra las jaulas, identifique cada uno de los jerbos y péselos en la báscula.
NOTA: Los jerbos son animales inofensivos pero delicados. Use guantes desechables cuando manipule los jerbos. - Agarra el jerbo con la mano no dominante para sostenerlo firmemente por la cola. Use la mano dominante, con el pulgar y el índice detrás de las orejas, para sostener al animal con la región ventral hacia arriba. Use el dedo meñique para sostener la cola.
- Llene una jeringa con una aguja de 30 G con 1 ml de ketamina y xilazina. Administrar la anestesia por vía intraperitoneal en el roedor (50-100 mg/kg de ketamina y 2 mg/kg de xilazina)9 utilizando la mano dominante. La duración del efecto será de aproximadamente 20-50 min (pueden ocurrir variaciones).
- Para asegurarse de que el jerbo esté completamente anestesiado, verifique con un pellizco en el dedo del pie, pinzamiento de la cola y reflexión corneal, etc., antes de hacer incisiones en la córnea.
NOTA: Realice todos los procedimientos solo en el ojo derecho.
2. Tomografía de coherencia óptica (OCT) de la córnea
- Coloque cortinas quirúrgicas estériles para proteger el equipo de secreciones o pelos de animales.
- Asegúrese de que uno de los operadores sostenga al animal mientras otro operador toma las imágenes. El operador debe apoyar sus manos sobre el equipo mientras sostiene el jerbo para que el ojo del jerbo sea lo más estable y quieto posible para ser estudiado. Descanse la mano sosteniendo el jerbo en el mentón descanse.
- Inicie el software que controla la OCT, presione Tomar imagen y, a continuación, Guardar imagen deseada. Realizar múltiples cortes sagitales y coronales de la córnea. Imagine el ojo debajo de la OCT y haga múltiples cortes para ver el segmento anterior de la córnea del roedor.
NOTA: Si la imagen obtenida no es nítida y el ojo se ha movido ligeramente, repita el procedimiento varias veces para obtener suficientes imágenes. - Utilizando el software OCT, realice mediciones paquimétricas de las regiones central y periférica. En la pantalla principal del software, presione Tomar imagen y luego presione el botón Guardar imagen deseada .
- Realizar mediciones en el ojo normal o control e inmediatamente después de la queratectomía fototerapéutica en los otros ojos de roedores.
3. Queratectomía fototerapéutica con láser excimer (PTK)
- Coloque cortinas quirúrgicas estériles en el dispositivo láser excimer para proteger el equipo de secreciones o pelo de animales.
- Instilar una gota de clorhidrato de proparacaína tópica (0,5%) en el ojo para ser tratado 5 min antes del procedimiento quirúrgico.
- Use la mano no dominante para sostener el jerbo firmemente. Con la mano dominante, abra los párpados del animal para que las imágenes puedan capturarse correctamente. Para poder enfocar y obtener una imagen nítida, asegúrese de que las manos de la persona que sostiene el jerbo descansen sobre la cabeza del equipo. Coloque las manos que sostienen al animal donde un paciente colocaría su cuello.
- Realizar la ablación con PTK en el ojo derecho. Utilice los siguientes parámetros: una ablación entre 60 μm y 62 μm de espesor, una zona óptica de 3 mm, una duración de 4 s y un total de 1.867 pulsos.
NOTA: PTK se realiza solo en jerbo 2 y jerbo 3. En este paso, el segundo operador prepara y activa el láser para extirpar el tejido corneal. - Inmediatamente después del procedimiento, tome fotografías y realice análisis de OCT para registrar y documentar los cambios en la superficie de los ojos tratados.
- Una vez completado el procedimiento, vuelva a colocar al roedor en la jaula, controle los signos vitales (frecuencia cardíaca: 360 latidos por minuto; temperatura rectal: 37-38.5 ° C; frecuencia respiratoria: 90 respiraciones por minuto) y deje que el animal se recupere de la anestesia.
4. Despertar de los jerbos después de PTK corneal
- Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg a 0,05 mg/kg) y atipamezol (0,1-1 mg/kg) mediante inyecciones intraperitoneales.
- Coloque cada jerbo en su respectiva jaula doméstica y controle los signos vitales para el despertar normal (la temperatura corporal normal es de 37-39 ° C).
- Aplique un ungüento de eritromicina para mantener la superficie limpia y prevenir infecciones. Realice este procedimiento dos veces al día.
- Administrar buprenorfina (cada 6-12 h) por vía subcutánea (0,01-0,05 ml) para analgesia y pomada ocular en dos días consecutivos después de PTK.
5. Método de la eutanasia
- Realice la eutanasia en la jaula del hogar siempre que sea posible.
- Introduzca gas de dióxido de carbono comprimido (CO2) en la jaula doméstica. Una tasa de llenado del 30%-70% del volumen de la cámara por minuto conCO2 añadido al aire existente en la jaula doméstica es adecuada para lograr una mezcla que cumpla con el objetivo (para una cámara de volumen de 10 L, utilice un caudal de 3-7 L/min). Utilizar la luxación cervical (como método secundario de eutanasia) para asegurar la muerte del roedor.
- A las 24 h y 96 h después de la cirugía para el jerbo 2 y el jerbo 3, respectivamente, retirar al animal de la jaula domiciliaria para realizar la enucleación del globo ocular (tanto el globo ocular normal como el que se somete a cirugía) para observar la cicatrización corneal.
- Coloque al animal en la mesa de operaciones y verifique la ausencia de latidos cardíacos durante aproximadamente 1 minuto.
6. Cirugía ocular
- Retire los párpados superiores e inferiores para acceder al globo ocular. Use fórceps quirúrgicos y tijeras para quitar los párpados. El tamaño del área de trabajo es tan pequeño y delicado que la eliminación de los párpados permite que el globo ocular se enuclee sin dañarlo.
- Para enuclear el globo ocular, haga una incisión en el canto externo y guíe las tijeras en dirección posterior. Repita este procedimiento desde el canto interno separando el globo ocular de la órbita.
- Seccionar el nervio óptico en la parte posterior del globo ocular. Cabe aclarar que el plexo orbitario posterior suele generar un ligero sangrado al realizar esta técnica, lo que dificulta el trabajo.
- Introducir el globo ocular en un tubo de microcentrífuga con solución salina estéril durante 30 s a 1 minuto para lavar cualquier sangre residual.
- Coloque el globo ocular en un tubo de microcentrífuga que contenga un 10% de formaldehído para su posterior análisis anatomopatológico como se describe a continuación. Toma múltiples imágenes y fotografías.
7. Análisis anatomopatológico
- Incrustar todo el ojo en formalina tamponada al 10% durante 6-24 h.
- Corte el tejido con un micrótomo. Asegúrese de que el tejido cortado tenga un grosor de 3 mm.
- Remoje el tejido en alcohol al 96% durante 30-90 minutos y repita este procedimiento dos veces.
- Coloque el tejido en alcohol isopropílico durante 30-90 minutos y repita este procedimiento dos veces.
- Coloque el tejido en xileno o sustituto de xileno durante 1-3 h.
- Incrustar el tejido en queroseno líquido durante 1 h como mínimo.
- Use un bloque para colocar el tejido e incrustarlo en parafina líquida. Deje que se solidifique (colóquelo en un lugar frío) y córtelo.
- Prepare el microtomo para la sección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Posteriormente, utilice tinciones como hematoxilina y eosina.
- Obtenga imágenes con la cámara añadida al microscopio.
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Representative Results
En el presente estudio, toda la estructura corneal fue analizada minuciosamente utilizando técnicas histológicas y estudios complementarios del segmento anterior, como la tomografía de coherencia óptica. El análisis de imagen mediante tomografía de coherencia óptica de las estructuras del segmento anterior muestra un epitelio y estroma normales (Figura 1), con espesores corneales centrales y periféricos de 160 μm y 106 μm ± 2 μm, respectivamente. Otras publicaciones también han demostrado que la córnea de otros roedores se vuelve más delgada hacia la periferia10.
Después de PTK, se observó el desbridamiento del epitelio corneal (Figura 2). También se tomaron imágenes macroscópicas del ojo del jerbo antes y después del tratamiento. Después de realizar PTK, se observó una superficie corneal irregular, que se tiñó instilando una gota de fluoresceína e iluminándola con luz violeta (mostrando la úlcera epitelial) (Figura 3).
En cuanto al análisis histológico, la córnea normal del jerbo no tratado (jerbo 1) mostró las mismas capas que en humanos: el epitelio anterior estratificado con cuatro a seis capas de células, que representa el 28% del grosor total de la córnea, la capa de Bowman, el estroma, que representa el 66% del grosor total de la córnea, la membrana de Descemet, y el endotelio (Figura 4 y Figura 5).
Los cambios observados en el jerbo número 2 (24 h después de PTK) fueron úlcera en la córnea, esfacelación del epitelio anterior adyacente, múltiples manchas de acantólisis epitelial y discheratocitos aislados, infiltrado inflamatorio subepitelial agudo y edema a nivel del estroma (Figura 6).
Los cambios observados en el jerbo número 3 (96 h después de PTK) fueron la presencia de mayor edema que en el jerbo número 2, desagregación de las fibras y células del estroma, regeneración completa del epitelio anterior y ausencia de infiltrado inflamatorio (Figura 7).
En resumen, la tinción histológica demuestra el proceso normal de cicatrización de heridas en el epitelio corneal y estroma superficial, con infiltrado inflamatorio y edema.
Figura 1: Imagen representativa de la OCT de la córnea normal. La córnea se puede ver en su tamaño completo (con una medida de espesor en su ápice de 160 μm y medidas de espesor de 108 μm y 110 μm en la periferia), y también se puede ver la cámara anterior, el ángulo iridocorneal, el iris y el cristalino (que sobresale en la cámara anterior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen representativa de la OCT de la córnea antes y después de la PTK. (A) Imagen de la córnea normal. (B) Imagen corneal 10 min después de PTK. La flecha de la izquierda muestra el borde de una úlcera con una acumulación de desechos celulares, y la flecha de la derecha también muestra restos en la superficie corneal típicos de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fotografía macro representativa del globo ocular del jerbo (ojo derecho). (A) Superficie regular del globo ocular normal. (B) Imagen tomada 5 min después de la realización de PTK, mostrando irregularidades en la superficie corneal. (C) Evidencia de una úlcera corneal teñida con fluoresceína al 0,25% utilizando una fuente de luz LED (violeta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Sección histológica completa representativa (anterior-posterior) de toda la córnea normal del jerbo (40x) teñida con H&E. (A) Se enmarcan los fragmentos periférico y central. La barra de escala es de 20 μm. (B-D) La periferia de la córnea muestra un epitelio más delgado con menos estratificación y un número disminuido de fibras estromales. La figura muestra un endotelio ligeramente desprendido en la periferia de la córnea, que se debe a un artefacto de la técnica. En consecuencia, el grosor corneal periférico es más delgado que el central. (C) El espesor medido es similar al espesor calculado con las imágenes OCT. Tanto el epitelio como el estroma muestran un mayor grosor a nivel del ápice corneal. La barra de escala es de 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Córnea normal representativa del jerbo mongol teñido con H&E (jerbo número 1). Se observan las cinco capas de la córnea y el epitelio intacto. La barra de escala es de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Córnea representativa 24 h después de la queratectomía fototerapéutica con láser excimer (PTK) (teñida con H&E). La flecha muestra el borde de la úlcera corneal (jerbo número 2). La barra de escala es de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Córnea representativa 96 h después de la queratectomía fototerapéutica con láser excimer (PTK). Teñido con H&E; Jerbo número 3. El epitelio regenerado y el edema estromal se observan en esta figura. La barra de escala es de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La fisiología de la cicatrización de heridas corneales es un equilibrio entre la regeneración de tejidos y el mantenimiento de la homeostasis. La cicatrización excesiva de heridas puede provocar fibrosis y cicatrización, lo que en última instancia puede resultar en la pérdida de la función del órgano. Con la rápida evolución de los procedimientos quirúrgicos corneales, la importancia de comprender la cicatrización de heridas corneales y los eventos fisiológicos y patológicos involucrados no puede ser sobreestimada11.
Múltiples trabajos de investigación afirman que los jerbos tienen muchas características sensoriales que los convierten en una especie favorable para los estudios de la visión, incluyendo principalmente el comportamiento diurno12 y la visión superior y más aguda en comparación con ratones o ratas13. Su estructura retiniana es más análoga a la de los humanos14. Por esta razón, se han utilizado como modelo animal para el desarrollo de infecciones parasitarias retinianas15, fármacos terapéuticos, entrega de genes y para el estudio de la fisiología retiniana. Además, análisis genéticos publicados recientemente han demostrado que la mayoría de los genes de jerbo identificados (81%) son compartidos entre ratones y humanos16. Además, los estudios han documentado las similitudes genéticas entre los jerbos y los ratones y los humanos, identificando importantes similitudes y diferencias entre las especies17. Por lo tanto, elegimos el modelo animal actual de jerbos para estudiar las estructuras corneales normales y sus procesos fisiopatológicos asociados con la cicatrización de PTK.
Varios investigadores sostienen que la PTK es un modelo ideal para estudiar la cicatrización corneal, ya que permite el estudio de los procesos apoptóticos, la vitalidad de los queratocitos, la migración celular y la inflamación local de los tejidos, entre otros aspectos18.
La importancia de este trabajo se relaciona no sólo con el estudio de la cicatrización corneal y la cicatrización de heridas, sino también con la propuesta de un nuevo modelo animal con potencial científico para que los resultados sean extrapolables a otros modelos publicados anteriormente.
Este modelo animal, por su similitud y semejanza con el comportamiento del ojo humano, permite la reproducción de un mismo protocolo con diferentes variantes y sienta un precedente para el desarrollo de otros modelos, como modelos de queratitis infecciosa y neovascularización corneal, entre otros.
Sin embargo, este trabajo y este modelo animal tienen algunas limitaciones. En primer lugar, el jerbo no es un modelo animal muy extendido como ratones, ratas o conejos. Por esta razón, puede que no haya tantos reactivos como se desea. En segundo lugar, la literatura disponible sobre oftalmología en jerbos también es muy limitada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer al ingeniero Rodrigo de la Fuente por su inestimable ayuda y apoyo técnico. También agradecemos a María Eugenia Corbela por la narración y a Priscilla Hazrún por la edición de las figuras. Hugo Luján nos permitió utilizar las instalaciones del Centro de Investigación y Desarrollo en Inmunología y Enfermedades Infecciosas (CIDIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | Tododrogas | ||
| Eppendorf tubes | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Forceps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Gloves | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optical coherence tomography | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Sterile drapes | Soporte hospitalario | ||
| Sterile gauzes | Soporte hospitalario | ||
| Syringes and needles | Tododrogas | ||
| Xylazine | Sigma-Aldrich |
References
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