Mongolske gerbils som en dyremodell for sårheling

Summary

Denne artikkelen beskriver en ny dyremodell utviklet for å studere anatomi og histologi av hornhinnen og dens helbredende prosesser. Denne nye dyremodellen bruker den mongolske gerbilen, som har en hornhinne med mange likheter med den menneskelige hornhinnen.

Abstract

Kornealsårhelingsstudier har blitt utført i lang tid og har bidratt til å redusere lidelse og utvikle behandlinger som bidrar til å forbedre pasientens øyehelse. Historisk sett har hornhinneheling blitt studert hos gnagere som mus og rotter, men disse modellene kan ikke helt etterligne menneskelige lidelser. Imidlertid er informasjon om andre gnagere som mongolske gerbils (Meriones unguiculatus) lite i hornhinneforskning.

Her beskriver vi en teknikk for å utvikle en ny dyremodell for å studere hornhindehelbredelse etter fotorefraktiv keratektomi. På grunn av den begrensede litteraturen som er tilgjengelig om hornhinnen til M. unguiculatus, beskriver vi også en histologisk analyse av normal hornhinne. Disse forskningsteknikkene kan også brukes i studiet av øyesykdommer på grunn av likheten mellom hornhinnen til mongolske gerbils og mennesker når det gjelder genetikk, anatomi og fysiologi.

Introduction

Noen av de viktigste aspektene ved hornhinnen sårheling, som er viktige bekymringer for fremre segmentkirurgi, er integriteten til epitelarkitekturen, vedlikehold av hornhinnen stroma gjennomsiktighet, og til slutt utfallet når det gjelder brytningsegenskapene til hornhinnen¹.

Hornhinnen er det ytterste klare vevet på forsiden av øyebollet og er derfor utsatt for traumer, infeksjoner og brannskader; Den svekkede helbredelsen av disse sårene kan kompromittere visuell helse².

For tiden er flere dyremodeller tilgjengelige for å studere hornhindehelbredelse, og noen av dem er bedre enn andre, avhengig av arten og typen mekanisme som skal studeres¹. Det er noen få registreringer av tidligere undersøkelser på netthinnen til gerbils². Men så langt er det ingen publisert litteratur om arrdannelsesprosessene i hornhinnen til disse gnagere.

Her presenterer vi Meriones unguiculatus (mongolsk gerbil) som en dyremodell for sårheling i hornhinnen. Prosedyrer for å fremkalle hornhinneheling etter fotorefraktiv keratektomi er beskrevet, noe som gjør at vi kan studere de forskjellige typer hornhinde-arrdannelsesprosesser, forstå sårheling når det gjelder de dynamiske faser av levende vev, og til slutt planlegge passende fremtidige behandlinger³. Fototerapeutisk keratektomi er en svært reproduserbar teknikk med mulighet for nøyaktig å kontrollere parametere som dybden og diameteren av hornhinneskaden⁴. Videre krever denne teknikken ikke prosedyrer med kirurgiske instrumenter eller kjemiske løsninger (f.eks. Saltoppløsning, formalin, alkohol, etc.) som kan legge til variabler som er spesifikke for instrumentene eller for operatøren som utfører prosedyren⁵.

Tre 6 måneder gamle mannlige gerbils av lignende størrelser og vekter (ca. 90 g) ble brukt til eksperimentet som ble presentert i denne artikkelen. Prosedyrene ble bare utført i høyre øyne. En gerbil (referert til som gerbil 1 eller kontroll) gjennomgikk ikke fototerapeutisk keratektomi og ble enukleert for å evaluere alle de normale okulære strukturer. Fototerapeutisk keratektomi innebærer kontrollert levering av excimer lasergenerert ultrafiolett lys til hornhinnen og ble utviklet for å utføre brytningskirurgi⁶. Det har blitt brukt i andre gnagere, for eksempel mus⁷. De to andre gerbils ble utsatt for fototerapeutisk keratektomi. En av dem ble enukleert ved 24 timer (referert til som gerbil 2) og den andre ved 96 timer etter operasjonen (referert til som gerbil 3).

For å utføre dette eksperimentet ble en gerbil valgt tilfeldig filmet for hver tilstand som skulle studeres, men dette eksperimentet ble tidligere utført med 16 gerbils totalt for hver tilstand. Av redigeringsgrunner ble det besluttet å bruke en tilfeldig valgt gerbil for hver tilstand (tre gerbils totalt) som et eksempel.

Hovedmålet med denne forskningen er å utforske den beste dyremodellen som er tilgjengelig. Det er imidlertid viktig å merke seg at ikke alle arter har øyeegenskaper som ligner på det menneskelige øye⁸. Denne artikkelen beskriver metoden som brukes til å studere hornhinnen til Meriones unguiculatus og prosedyren som utføres for å generere hornhinneskaden, noe som gjør at vi kan studere helingsprosessen.

Protocol

Alle forskningsprosedyrer ble godkjent av "Institutional Commission for the Care and Use of Laboratory Animals" ved Universidad Católica de Córdoba og fulgte National Research Council Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Disse prosedyrene ble også godkjent av myndighetene i "Facultad de Ciencias de la Salud" ved Universidad Católica de Córdoba og "Instituto de la Visión Cerro".

1. Gerbil håndtering og anestesi

MERK: Alle dyrene var spesifikke patogenfrie (SFP) mannlige mongolske gerbils og ble holdt i Senter for forskning og utvikling i immunologi og smittsomme sykdommer (CIDIE) fasiliteter (Córdoba, Argentina). De ble hentet fra Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentina).

1. Hus gerbils sosialt i polysulfon bur bedded med corncob sengetøy. Gi mat og filtrert vann fra springen i vannflasker ad libitum. Forsikre deg om at romtemperaturområdet er 18 °C til 24 °C, og at en 12:12 h lys-mørk syklus brukes.
2. Vei hver gerbil separat, og identifiser hver enkelt for å unngå forvirring. Lag et merke med en uutslettelig blekkmarkør på undersiden av gerbilens hale. Bruk pinsett for å holde gerbilens øre og lage et merke ved hjelp av den uutslettelige markøren på gnagerens øre. Hvis et laboratorium og et stort biotherium er tilgjengelig, tilordne et unikt bur for hver gnager med tilsvarende identifikasjon.
3. Desinfiser den laminære strømningshetten med 70% etanoloppløsning. Plasser alle kirurgiske og engangsinstrumenter, inkludert nåler, sprøyter og stativer, i arbeidsområdet inne i hetten. Plasser et engangs kirurgisk skum i hetten også.
4. Bruk en liten åpen plastbeholder for å holde gnageren på presisjonsbalansen for å lette målingen.
5. Bruk tre 6 måneder gamle mannlige mongolske gerbils av lignende størrelser og vekter (~ 80 g) for dette eksperimentet. En om gangen, plasser hvert bur med gnageren inne i den laminære strømningshetten. Åpne burene, identifiser hver av gerbilene, og vei dem på skalaen.
   MERK: Gerbils er ufarlige, men delikate dyr. Bruk engangshansker når du håndterer gerbils.
6. Ta tak i gerbilen med den ikke-dominerende hånden for å holde den fast i halen. Bruk den dominerende hånden, med tommelen og pekefingeren bak ørene, for å holde dyret med ventralområdet vendt oppover. Bruk lillefingeren til å holde halen.
7. Fyll en sprøyte med en 30 G kanyle med 1 ml ketamin og xylazin. Administrer anestesien intraperitonealt i gnageren (50-100 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazin)⁹ med den dominerende hånden. Varigheten av effekten vil være ca. 20-50 min (variasjoner kan forekomme).
8. For å sikre at gerbilen er fullstendig bedøvet, sjekk med en tåklemme, haleklemme og hornhinderefleksjon, etc., før du gjør snitt i hornhinnen.
   MERK: Utfør alle prosedyrene bare i høyre øye.

2. Optisk koherens tomografi (OCT) av hornhinnen

1. Plasser sterile kirurgiske gardiner for å beskytte utstyret mot sekreter eller dyrehår.
2. Forsikre deg om at en av operatørene holder dyret mens en annen operatør tar bildene. Operatøren skal hvile hendene på utstyret mens han holder gerbilen, slik at gerbilens øye er så stabilt og fortsatt som mulig å bli studert. Hvil hånden som holder gerbilen på hakestøtten..
3. Start programvaren som styrer OCT, og trykk Ta bilde og deretter Lagre ønsket bilde. Utfør flere sagittale og koronale skiver av hornhinnen. Avbilde øyet under OCT, og lag flere skiver for å se det fremre segmentet av gnagerhornhinnen.
   MERK: Hvis det oppnådde bildet ikke er skarpt og øyet har beveget seg litt, gjenta prosedyren flere ganger for å få nok bilder.
4. Bruk OCT-programvaren til å utføre pakymetriske målinger av de sentrale og perifere regionene. I hovedskjermbildet til programvaren trykker du på Ta bilde, og deretter trykker du på Lagre ønsket bilde-knappen .
5. Utfør målinger på det normale eller kontrolløyet og umiddelbart etter fototerapeutisk keratektomi på de andre gnagerøynene.

3. Excimer laser fototerapeutisk keratektomi (PTK)

1. Plasser sterile kirurgiske gardiner på excimer laser-enheten for å beskytte utstyret mot sekreter eller dyrehår.
2. Innpode en dråpe aktuell proparakainhydroklorid (0,5%) i øyet som skal behandles 5 minutter før kirurgisk prosedyre.
3. Bruk den ikke-dominerende hånden til å holde gerbilen fast. Med den dominerende hånden åpner du dyrets øyelokk slik at bildene kan fanges riktig. For å kunne fokusere og få et skarpt bilde, må du sørge for at hendene til personen som holder gerbilen hviler på utstyrets hode. Plasser hendene som holder dyret der en pasient vil plassere nakken.
4. Utfør PTK-ablasjon på høyre øye. Bruk følgende parametere: en ablasjon mellom 60 μm og 62 μm tykk, en optisk sone på 3 mm, en varighet på 4 s og totalt 1.867 pulser.
   MERK: PTK utføres kun på gerbil 2 og gerbil 3. I dette trinnet forbereder og aktiverer den andre operatøren laseren for å ablate hornhinnen.
5. Umiddelbart etter prosedyren, ta bilder og utfør OCT-analyse for å registrere og dokumentere overflateendringer i de behandlede øynene.
6. Når prosedyren er fullført, plasser gnageren tilbake i buret, overvåke vitale tegn (hjertefrekvens: 360 slag per minutt, rektal temperatur: 37-38,5 ° C; respirasjonsfrekvens: 90 pust per minutt), og la dyret komme seg fra anestesi.

4. Oppvåkning av gerbils etter hornhinnen PTK

1. Administrer buprenorfin (0,1 mg/kg til 0,05 mg/kg) og atipamezol (0,1-1 mg/kg) via intraperitoneale injeksjoner.
2. Plasser hver gerbil i sitt respektive hjemmebur, og overvåk vitale tegn for normal oppvåkning (normal kroppstemperatur er 37-39 ° C).
3. Påfør en erytromycin salve for å holde overflaten ren og forhindre infeksjon. Utfør denne prosedyren to ganger per dag.
4. Administrer buprenorfin (hver 6-12 timer) subkutant (0,01-0,05 ml) for analgesi og øyesalve to påfølgende dager etter PTK.

5. Eutanasi-metoden

1. Utfør eutanasi i hjemmeburet når det er mulig.
2. Introduser komprimert karbondioksid (CO₂) gass i hjemmemerden. En fyllingshastighet på 30% -70% av kammervolumet per minutt med CO₂ tilsatt den eksisterende luften i hjemmeburet er tilstrekkelig for å oppnå en blanding som oppfyller målet (for et 10 L volumkammer, bruk en strømningshastighet på 3-7 l / min). Bruk cervical dislokasjon (som en sekundær metode for eutanasi) for å sikre gnagerens død.
3. Ved 24 timer og 96 timer etter operasjon for henholdsvis gerbil 2 og gerbil 3, fjern dyret fra hjemmeburet for å utføre enukleasjonen av øyebollet (både det normale øyebollet og det som gjennomgår kirurgi) for å observere hornhindeheling.
4. Plasser dyret på operasjonsbordet, og kontroller at det ikke er hjerteslag i ca. 1 min.

6. Øye kirurgi

1. Fjern øvre og nedre øyelokk for å få tilgang til øyebollet. Bruk kirurgisk tang og saks for å fjerne øyelokkene. Størrelsen på arbeidsområdet er så liten og delikat at fjerning av øyelokkene gjør at øyebollet kan enukleeres uten å skade det.
2. For å enucleate øyebollet, gjør et snitt i den eksterne canthus, og lede saksen i en bakre retning. Gjenta denne prosedyren fra den indre canthus ved å skille øyebollet fra bane.
3. Seksjon optisk nerve på baksiden av øyebollet. Det bør avklares at den bakre orbitale plexus vanligvis genererer liten blødning når du utfører denne teknikken, noe som gjør arbeidet vanskelig.
4. Introduser øyebollet i et mikrosentrifugerør med steril saltoppløsning i 30 s til 1 minutt for å vaske ut restblod.
5. Plasser øyebollet i et mikrosentrifugerør som inneholder 10% formaldehyd for påfølgende anatomo-patologisk analyse som beskrevet nedenfor. Ta flere bilder og fotografier.

7. Anatomo-patologisk analyse

1. Bygg hele øyet i 10% bufret formalin i 6-24 timer.
2. Klipp vevet ved hjelp av en mikrotom. Sørg for at kuttvevet har en tykkelse på 3 mm.
3. Soak vevet i 96% alkohol i 30-90 minutter, og gjenta denne prosedyren to ganger.
4. Plasser vevet i isopropylalkohol i 30-90 minutter, og gjenta denne prosedyren to ganger.
5. Sett vevet i xylen- eller xylensubstitutt i 1-3 timer.
6. Bygg vevet i flytende petroleum i minst 1 time.
7. Bruk en blokk for å plassere vevet og legg det inn i flytende parafin. La den stivne (plasser den på et kaldt sted), og kutt den.
8. Forbered mikrotomet for seksjonering i henhold til produsentens instruksjoner.
9. Deretter bruker flekker som hematoxylin og eosin.
10. Få bilder med kameraet lagt til mikroskopet.

Representative Results

I denne studien ble hele hornhinnestrukturen grundig analysert ved hjelp av histologiske teknikker og komplementære studier av det fremre segmentet, for eksempel optisk koherenstomografi. Bildeanalysen ved hjelp av optisk koherenstomografi av de fremre segmentstrukturene viser et normalt epitel og stroma (figur 1), med henholdsvis sentrale og perifere hornhinnetykkelser på henholdsvis 160 μm og 106 μm ± 2 μm. Andre publikasjoner har også vist at hornhinnen til andre gnagere blir tynnere mot periferien¹⁰.

Etter PTK ble debridement av hornhinneepitelet observert (figur 2). Makroskopiske bilder av ørkenrotteøyet før og etter behandling ble også tatt. Etter å ha utført PTK ble det observert en uregelmessig hornhinneoverflate, som ble farget ved å innpode en dråpe fluorescein og belyse den med fiolett lys (som viser epitelsåret) (figur 3).

Når det gjelder histologisk analyse, viste den normale hornhinnen til den ubehandlede gerbilen (gerbil 1) de samme lagene som hos mennesker: det stratifiserte fremre epitelet med fire til seks lag med celler, som representerte 28% av den totale tykkelsen av hornhinnen, Bowmans lag, stroma, som representerte 66% av den totale tykkelsen på hornhinnen, Descemets membran, og endotelet (figur 4 og figur 5).

Forandringene som ble observert i ørkenrotte nummer 2 (24 timer etter PTK) var sår i hornhinnen, utfasning av tilstøtende fremre epitel, multiple epitelial akantholyse og isolerte discheratocytter, akutt subepitelial inflammatorisk infiltrat og ødem i stromanivå (figur 6).

Forandringene observert i ørkenrotte nummer 3 (96 timer etter PTK) var tilstedeværelse av større ødem enn i ørkenrotte nummer 2, disaggregering av stromale fibre og celler, fullstendig regenerering av fremre epitel og ingen inflammatorisk infiltrat (figur 7).

Oppsummert demonstrerer histologisk farging den normale sårhelingsprosessen i hornhinneepitelet og overfladisk stroma, med inflammatorisk infiltrat og ødem.

Figur 1: Representativ OCT-avbildning av normal hornhinne. Hornhinnen kan ses i full størrelse (med en tykkelsesmåling ved toppunktet på 160 μm og tykkelsesmålinger på 108 μm og 110 μm i periferien), og det fremre kammeret, iridocornealvinkelen, iris og den krystallinske linsen (som stikker ut i det fremre kammeret) kan også ses. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Representativ OCT-avbildning av hornhinnen før og etter PTK . (A) Bilde av normal hornhinne. (B) Hornhinnebilde 10 min etter PTK. Pilen til venstre viser kanten av et sår med akkumulering av cellulært rusk, og pilen til høyre viser også rusk på hornhinnens overflate som er typisk for operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Representativt makrofotografi av ørkenrotten i ørkenrotten (høyre øye). (A) Regelmessig overflate av det normale øyeeplet. (B) Bilde tatt 5 min etter at PTK ble utført, som viser uregelmessigheter på hornhinnen. (C) Tegn på hornhinnenesår farget med 0,25% fluorescein ved bruk av en LED-lyskilde (fiolett). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Representativt komplett histologisk snitt (fremre-bakre) av hele normal hornhinne i ørkenrotten (40x) farget med H&E. (A) De perifere og sentrale fragmentene er innrammet. Skalastangen er 20 μm. (B-D) Periferien av hornhinnen viser et tynnere epitel med mindre stratifisering og et redusert antall stromale fibre. Figuren viser et litt frittliggende endotel i periferien av hornhinnen, noe som skyldes en artefakt av teknikken. Følgelig er den perifere hornhinnetykkelsen tynnere enn den sentrale. (C) Tykkelsen som måles er lik tykkelsen beregnet med OCT-bildene. Både epitelet og stroma viser en større tykkelse på nivået av hornhinnen. Skalaen er 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Representativ normal hornhinne i den mongolske gerbilen farget med H&E (ørkenrotte nummer 1). De fem lagene i hornhinnen og det intakte epitelet observeres. Skalaen er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Representativ hornhinne 24 timer etter excimer laser fototerapeutisk keratektomi (PTK) (farget med H&E). Pilen viser kanten av hornhinnenesåret (ørkenrotte nummer 2). Skalaen er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Representativ hornhinne 96 timer etter excimer laser fototerapeutisk keratektomi (PTK). Farget med H&E; Gerbil nummer 3. Det regenererte epitelet og stromal ødem observeres i denne figuren. Skalaen er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Fysiologien til hornhinnen sårheling er en balanse mellom vevregenerering og vedlikehold av homeostase. Overdreven sårheling kan føre til fibrose og arrdannelse, noe som til slutt kan føre til tap av organfunksjon. Med den raske utviklingen av hornhinnekirurgiske prosedyrer, kan viktigheten av å forstå hornhinnesårheling og de fysiologiske og patologiske hendelsene som er involvert, ikke overvurderes¹¹.

Flere forskningsarbeid hevder at gerbils har mange sensoriske egenskaper som gjør dem til en gunstig art for visjonsstudier, inkludert hovedsakelig daglig oppførsel¹² og overlegen og mer akutt syn sammenlignet med mus eller rotter¹³. Deres retinale struktur er mer analog med den hos mennesker¹⁴. Av denne grunn har de blitt brukt som en dyremodell for utvikling av retinale parasittinfeksjoner¹⁵, terapeutiske legemidler, genlevering og for å studere retinal fysiologi. I tillegg har nylig publiserte genetiske analyser vist at de fleste av de identifiserte gerbilgenene (81%) deles mellom mus og mennesker¹⁶. Videre har studier dokumentert de genetiske likhetene mellom ørkenrotter og både mus og mennesker, og identifisert viktige likheter og forskjeller på tvers av arter¹⁷. Derfor valgte vi den nåværende dyremodellen av gerbils for å studere de normale hornhinnestrukturene og deres patofysiologiske prosesser forbundet med PTK-arrdannelse.

Flere forskere hevder at PTK er en ideell modell for å studere hornhinnen arrdannelse fordi det tillater studier av apoptotiske prosesser, keratocytt vitalitet, cellemigrasjon og lokal vevsbetennelse, blant annet¹⁸.

Betydningen av dette arbeidet relaterer seg ikke bare til studiet av hornhinnen arrdannelse og sårheling, men også til forslaget om en ny dyremodell med det vitenskapelige potensialet for resultatene som skal ekstrapoleres til andre tidligere publiserte modeller.

Denne dyremodellen, på grunn av dens likhet og likhet med oppførselen til det menneskelige øye, tillater reproduksjon av samme protokoll med forskjellige varianter og setter presedens for utvikling av andre modeller, for eksempel modeller av smittsom keratitt og hornhinde neovaskularisering, blant andre.

Dette arbeidet og denne dyremodellen har imidlertid noen begrensninger. For det første er gerbilen ikke en utbredt dyremodell som mus, rotter eller kaniner. Av denne grunn kan det ikke være så mange reagenser som ønsket. For det andre er den tilgjengelige litteraturen om oftalmologi hos ørkenrotter også svært begrenset.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia	Tododrogas
Eppendorf tubes	Tododrogas
Excimer Laser	Technolas	2022445
Fluorescein	Poen
Forceps	Ofcor	3339
Formaldehyde	Tododrogas
Gloves	Tododrogas
Ketamine	Sigma-Aldrich
Optical coherence tomography	Optovue	659007
Proparacaine	Poen
Scisors	Ofcor	3336
Sterile drapes	Soporte hospitalario
Sterile gauzes	Soporte hospitalario
Syringes and needles	Tododrogas
Xylazine	Sigma-Aldrich