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Cancer Research

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63346
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

ERRATUM NOTICE

Summary

これらのプロトコルは、タツノオトシゴの細胞外フラックス分析を使用して、3Dがん細胞株由来スフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を調べるのに役立ちます。

Abstract

スフェロイドと呼ばれる三次元(3D)細胞凝集体は、近年、 in vitro 細胞培養の最前線となっている。細胞を2次元の単一細胞単層(2D培養)として培養するのとは対照的に、スフェロイド細胞培養は、細胞外マトリックスタンパク質の発現、細胞シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質産生、分化、および増殖を含む、 生体内に存在する生理学的細胞アーキテクチャおよび特性を促進し、調節し、サポートする。3D培養の重要性は、腫瘍学、糖尿病、幹細胞生物学、組織工学など、多くの研究分野で認識されています。過去10年間で、スフェロイドを産生し、その代謝機能と運命を評価するための改良された方法が開発されました。

細胞外フラックス(XF)分析装置は、XF24膵島捕捉プレートまたはXFe96スフェロイドマイクロプレートのいずれかを使用して、スフェロイドなどの3Dマイクロ組織におけるミトコンドリア機能を探索するために使用されてきました。しかしながら、XF技術を用いたスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝のプロービングの明確なプロトコルおよび最適化は、詳細には記載されていない。この論文では、XFe96 XFアナライザーを搭載したスフェロイドマイクロプレートを使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。異なるがん細胞株を使用して、XF技術は、異なるサイズだけでなく、異なる体積、細胞数、DNA含量およびタイプの3Dスフェロイドにおける細胞呼吸を区別できることが実証されている。

オリゴマイシン、BAM15、ロテノン、およびアンチマイシンAの最適なミトコンドリアエフェクター化合物濃度は、3Dスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝の特異的パラメータをプローブするために使用される。この論文では、回転楕円体から得られたデータを正規化する方法についても説明し、XF技術を使用して回転楕円体代謝を探索する際に考慮すべき多くの考慮事項について説明します。このプロトコルは、高度な in vitro スフェロイドモデルの研究を促進するのに役立ちます。

Introduction

生物学的研究におけるin vitroモデルの進歩は、過去20年間で急速に進歩しました。このようなモデルには、臓器オンチップモダリティ、オルガノイド、および3Dマイクロ組織スフェロイドが含まれ、これらはすべて、in vitroおよびin vivo研究間の翻訳を改善するための共通の焦点となっている。高度なin vitroモデル、特にスフェロイドの使用は、組織工学、幹細胞研究、癌、および疾患生物学1,2,3,4,5,6,7、および遺伝毒物学8,9,10、ナノ材料毒物学11を含む安全性試験を含むいくつかの研究分野にまたがり、 12、13、14、および薬物安全性および有効性試験8、15、16、17、18、19。

正常な細胞形態は、生物学的表現型および活性にとって重要である。細胞を3Dマイクロティッシュスフェロイドに培養することで、細胞は形態、表現型機能、およびアーキテクチャを採用することができ、 これは生体内で 観察されるものに似ていますが、古典的な単層細胞培養技術では捕捉が困難です。 インビボ および インビトロ の両方で、細胞機能は、細胞のコミュニケーションおよびプログラミング(例えば、細胞 - 細胞接合の形成、細胞ニッチを形成する機会)に限定されない細胞微小環境によって直接影響を受ける。即時環境におけるホルモンおよび成長因子への細胞曝露(例えば、炎症反応の一部としての細胞サイトカイン曝露);物理的および化学的マトリックスの組成(例えば、細胞が硬い組織培養プラスチックまたは弾性組織環境で増殖されるかどうか);そして最も重要なのは、細胞代謝が栄養と酸素へのアクセス、ならびに乳酸などの代謝性老廃物の処理によってどのように影響を受けるかということです。

代謝フラックス分析は、定義された in vitro システム内の細胞代謝を調べるための強力な方法です。具体的には、XF技術は、無傷の細胞および組織の細胞生体エネルギーの生きたリアルタイム変化の分析を可能にする。多くの細胞内代謝事象が数秒から数分のオーダーで起こることを考えると、イン ビトロで無傷の細胞および組織における細胞代謝フラックスのリアルタイム変化を理解するためには、リアルタイムの機能的アプローチが最も重要である。

本論文では、強制凝集アプローチを用いた in vitro 3Dスフェロイドモデルとして、がん由来細胞株A549(肺腺がん)、HepG2/C3A(肝細胞がん)、MCF-7(乳腺がん)、SK-OV-3(卵巣腺がん)を培養するためのプロトコルを提供する(図1)。また、(i)Agilent XFe96 XFアナライザーを使用して単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べる方法を詳細に説明し、(ii)単一の3Dスフェロイドを使用してXFアッセイを最適化する方法を強調し、(iii)このアプローチを使用して3Dスフェロイド代謝をプローブする重要な考慮事項と制限について説明します。最も重要なのは、この論文では、酸素消費速度(OCR)の計算が酸化的リン酸化を決定し、したがって細胞スフェロイドのミトコンドリア機能を決定することを可能にするデータセットがどのように収集されるかを説明する。このプロトコールについては分析されていないが、細胞外酸性化率(ECAR)は、XF実験においてOCRデータとともに測定される別のパラメータである。ただし、ECAR は XF データセットから不適切または誤って解釈されることがよくあります。テクノロジーメーカーの基本的なアプローチに従ってECARを計算することの限界について解説します。

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Protocol

Figure 1
図1:細胞スフェロイドの生成、細胞外フラックス分析、ダウンストリームアッセイのグラフィカルワークフロー。4つの癌細胞株を単層(A)として選択的に培養し、組織培養フラスコから剥離し、超低付着96ウェルマイクロプレートに播種してスフェロイド(B)を形成した。A549肺癌、HepG2/C3A肝癌、SK-OV-3卵巣腺癌、およびMCF-7乳癌細胞を1×103-8×103細胞/ウェルで播種し、7日間まで増殖させて単一のスフェロイドを形成し、連続観察および平面測定によりスフェロイドの播種密度および培養時間を最適化した。一旦形成されると、単一のスフェロイドを無血清XF培地に洗浄し、ポリD-リジン(C)でプレコートしたスフェロイドアッセイマイクロプレートに慎重に播種した。スフェロイドは、いくつかのプロトコルを使用してXFe96アナライザーを使用して細胞外フラックス分析を行い、(1)基底ミトコンドリア呼吸応答に最適なスフェロイドサイズ;(2)ミトコンドリア呼吸器阻害剤の最適化された滴定;(3)マイクロプレートウェル内の回転楕円体配置の最適化。(d)XF後分析、位相差顕微鏡、およびスフェロイドDNA定量を、データ正規化および他の下流のインビトロアッセイに使用した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. がん細胞株を3D in vitro スフェロイドとして培養

細胞株 形容 培地 源
A549 · 肺癌細胞株 RPMI 1640 欧州認証細胞培養物コレクション(ECACC)
ピルビン酸ナトリウム (1 mM)
ペニシリン - ストレプトマイシン - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
HepG2/C3A 肝癌細胞株は、親HepG2細胞株のクローン誘導体である ティッカー アメリカンティッシュカルチャーコレクション(ATCC)
ペニシリン - ストレプトマイシン - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
ティッカー 乳房腺癌細胞株 RPMI 1640 欧州認証細胞培養物コレクション(ECACC)
ピルビン酸ナトリウム (1 mM)
ペニシリン - ストレプトマイシン - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
SK-OV-3 卵巣腺癌細胞株 RPMI 1640 欧州認証細胞培養物コレクション(ECACC)
ピルビン酸ナトリウム (1 mM)
ペニシリン - ストレプトマイシン - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
コンポーネント RPMIアッセイ培地(50mL最終容量)
ベースメディア アジレントタツノオトシゴXF RPMI、pH 7.4
グルコース (1 M 滅菌ストック) 11 mM (0.55 mL ストック ソリューション)
L-グルタミン(200 mM滅菌ストック) 2 mM (0.5 mL の原液)
ピルビン酸ナトリウム(100 mM滅菌ストック) 1 mM (0.5 mL の原液)

表1:癌細胞株培地およびXF培地組成物。

  1. 標準的な無菌組織培養技術を用いて全ての細胞株を培養し、適切なアッセイキットを用いてマイコプラズマを含まないことを確認する。
  2. T75組織培養フラスコまたは同等の細胞株を、推奨培地を用いて培養する(表1)。細胞株を65〜80%のコンフルエント度まで培養し、最大25継代まで定期的に継代する。
  3. 細胞培養フラスコをダルベッコの修飾リン酸緩衝生理食塩水(DBPS)で2回すすいでください。
  4. 3mLの細胞解離試薬( 材料表参照)を入れたフラスコから細胞を37°Cで5分間剥離し、顕微鏡観察により剥離を確認した。
  5. 剥離した細胞懸濁液を穏やかに吸引して単一細胞懸濁液を確保し、7mLの完全組織培養培地で細胞解離試薬を失活させる。
  6. 300 × g で5分間遠心分離して細胞を集め、上清を捨て、細胞を完全培地に再懸濁した。
  7. 血球計数器または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、播種に必要な所望の細胞密度まで滴定する。
    注: 96 ウェルプレート全体を 100 μL/ウェルで 4 ~103 × ウェルで播種するには、推奨容量 12 mL で細胞を 4 ×104 細胞/mL まで滴定する必要があります。
  8. 細胞懸濁液を滅菌リザーバーにデカントし、マルチチャンネルピペッターを使用して細胞撥水性マイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液100μLを分配する。
    注:マイクロプレートの内側60ウェルのみを播種し、残りをDPBSで満たしてください。これにより、蒸発障壁が形成され、プレート全体で回転楕円体の均質性が確保され、プレートエッジの影響が最小限に抑えられます。
  9. スフェロイドマイクロプレートを300 × g で15分間遠心分離し、細胞を緩い凝集体に強制した。
  10. プレートを37°C、5%CO2 で最低3日間インキュベートし、スフェロイド形成を確実にします。
  11. 標準化された実験室の実践を使用して位相差顕微鏡法を実行し、スフェロイドの成長を監視します。細胞培養培地を3日ごとまたは週2回、半容量培地交換を行って補充する。

2. 細胞外フラックス(XF)技術を用いた単一スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の解明

  1. アッセイ調製(1日前)
    1. 倍率4倍の位相差を備えた倒立光学顕微鏡を使用して回転楕円体の生存率を確認し、無傷の回転楕円体構造、形態、およびサンプル間の全体的な均一性を確保します。
    2. センサーカートリッジをハイドレートします。
      1. キャリブラントのアリコート〜20mLを円錐形のチューブに入れる。
      2. キャリブラントを入れた円錐管を非CO2 37°Cインキュベーターに入れ、一晩置いた。
      3. アッセイキットから内容物を取り除きます。
      4. センサーカートリッジをユーティリティー・プレートから取り外し、ユーティリティー・プレートの横にあるワークトップに逆さまに置きます。
      5. 200 μLの滅菌ddH2OをマルチチャンネルP300ピペットを用いてセンサーカートリッジユーティリティプレートの各ウェルにピペット。
      6. センサーカートリッジをユーティリティープレートの上に置きます。
      7. 各井戸の水位がセンサープローブを水没させるのに十分な高さであることを確認します。
      8. 組み立てたセンサーカートリッジを非CO2 37°Cインキュベーターに移し、一晩放置します。
        注:このステップは、アッセイ開始の12〜72時間前に実行できます。
  2. コートスフェロイドアッセイマイクロプレート
    1. 無菌技術を使用して、30 μL/ウェルの滅菌ポリD-リジン(0.1 mg/mL)溶液をスフェロイドマイクロプレートに加え、室温で30分間インキュベートします。
    2. 回転楕円体マイクロプレートの各ウェルから溶液を吸引し、プレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留溶液を除去します。
    3. プレートを200 μL/ウェルの滅菌ddH 2 Oで2回洗浄します。
    4. 最後の洗浄後、マイクロプレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留水を取り除きます。
    5. プレートを30分間風乾してから使用または保管し、将来の使用に備えて4°Cで保管してください。
      注:スフェロイドアッセイマイクロプレートは、スフェロイドがマイクロプレートの底部に固定されていることを確認するために、分子接着剤でコーティングする必要があります。分子接着剤がないと、スフェロイドが外れてアッセイ結果を妨げる可能性があります。他の分子接着剤も、プレコートプレート用のポリ-D-リジンの代替として使用することができる。プレコートプレートは4°Cで保存できますが、アッセイ開始前に室温に平衡化するようにしておく必要があります。
  3. XF アッセイ培地の調製
    1. 表1に詳述されているように、XF RPMI培地を調製し、0.22μmシリンジフィルターを備えた滅菌フィルターを調製する
  4. アッセイ調製(アッセイの1時間前)
    1. 補充したXF RPMIアッセイ培地を37°Cに予温する。
    2. コーティングしたスフェロイドアッセイマイクロプレートを非CO2 37°Cインキュベーターまたは乾燥浴中で予温する。
    3. センサーカートリッジを準備します。
      1. キャリブラントとセンサーカートリッジが入った円錐管をエアインキュベーターから取り出します。
      2. センサーカートリッジをユーティリティプレートから取り外し、作業台に逆さまに置きます。
      3. P300マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートから水を吸引し、廃棄します。
      4. キャリブラント溶液を滅菌試薬リザーバに注ぎ、P300マルチチャンネルピペットを使用して、予熱したキャリブラントをユーティリティプレートに200μL/ウェル加えます。
      5. センサーカートリッジを拾い上げてユーティリティプレートの上に置き、センサーがキャリブラントにしっかりと沈んでいることを確認します。
      6. 組み立てたセンサーカートリッジを、ポート注入溶液をロードする準備ができるまで、非CO2 37°Cインキュベーターに戻します。
  5. スフェロイドをアッセイ培地で洗浄する。
    1. 37°C、5%CO2 インキュベーターからスフェロイド培養プレートを取り出し、スフェロイド転写ステップの前にそれらの完全性を確実にするために顕微鏡下でスフェロイドを観察した。
    2. スフェロイドプレートのすべてのウェルに、バックグラウンド補正ウェルを含む180 μL/ウェルの予温アッセイ培地をロードします。
    3. 7cmのシャーレに3mLのアッセイ培地を部分的に充填する。
    4. 広いオリフィスピペットチップをロードしたマルチチャンネルピペットを使用して、ピペッターを10〜50μLの吸引容量に設定して、96ウェル培養プレートから7cmペトリ皿にスフェロイドを移します。
  6. スフェロイドを予めコーティングしたスフェロイドアッセイマイクロプレートにシードする。
    1. 解剖顕微鏡およびライトボックス装置を用いて、以下に詳述するように、スフェロイドをシャーレからスフェロイドアッセイマイクロプレートに移す。
      1. 広いオリフィスピペットチップを取り付けたシングルチャンネルピペッターの容量を20μLに設定し、単一のスフェロイドを慎重に吸引します。先端をスフェロイドアッセイマイクロプレートの各ウェルの中央に直接置き、重力が単一のスフェロイドを各ウェルの中心に溶出させる、すなわち、ピペットチップから媒体を排出せず、毛細管現象がピペットチップからスフェロイドを引き出すことを可能にする。溶出を確認するために、ピペッターの内容物を顕微鏡下で7cmのペトリ皿に戻すことができます。
        注:単一の回転楕円体の重力溶出は、通常、回転楕円体のサイズ/密度に応じて15〜30秒かかります。この間、ピペッターは取り外さないでください。バックグラウンド補正ウェルにはスフェロイドがなく、アッセイ媒体のみを含む必要があります。顕微鏡下で、各回転楕円体の位置を確認する。各回転楕円体は、理想的には各ウェルの中心内に配置する必要があります。
      2. すべてのスフェロイドがスフェロイドアッセイマイクロプレートに移されたら、アッセイの前にプレートを37°Cの非CO2 インキュベーターに最低1時間移します。

3. XFアッセイ用のセンサーカートリッジへの化合物の調製と装填

インジェクション戦略 コンパウンド(ポート) XFe96 マイクロウェル開始容量 (μL) 所望の最終井戸濃度 ポート容量(μL) 最終XFe96マイクロウェル容量ポストインジェクション(μL) 作業在庫の集中
1 オリゴマイシン (A) 180 3 ug/mL 20 200 30 μg/mL
ロテノン (B) 200 2 μM 20 220 22 μM
アンチマイシンA(B) 200 2 μM 20 220 22 μM
2 BAM15 (A) 180 5 μM 20 200 50 μM
ロテノン (B) 200 2 μM 20 220 22 μM
アンチマイシンA(B) 200 2 μM 20 220 22 μM

表2:XFe96アナライザーを使用して単一3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるためのミトコンドリア化合物濃度。

  1. 完全に補充された、予め温められたXF RPMIアッセイ培地を用いて、 表2 に記すように各化合物の作業ストック濃度を調製する。
  2. カートリッジプレート(ユーティリティプレートに結合)を列方向に左から右に1~12方向に向けます。
  3. ローディングガイドを使用する場合は、ウェルローディング手順に従ってカートリッジプレートの上に置きます(たとえば、ポートAを最初にロードする場合は、ガイドの左上隅に A が見えるようにします)。
  4. 各化合物の作用溶液を適切なリザーバに移し、較正されたP100マルチチャネルピペットを使用して、対応するすべてのポートに20μLを分配する。残りのポートへの各コンパウンドについて、この手順を繰り返します。
    メモ:センサーカートリッジプレートに使用されていないポートがある場合は、これらのポートを空のままにするか、アッセイ媒体で満たすことができます。特定のポートレターの選択のみが使用されている場合は、そのレターに対応する他のポートにアッセイ媒体がロードされていることを確認してください。さもなければ、空気は井戸に注入され、それらの井戸の結果を損なうでしょう。
  5. ポート・ロード後、プレート・ローディング・ガイド (使用されている場合) を取り外し、センサー・カートリッジをロードするためのアナライザーを準備します。
    メモ:ポートをロードした直後にアッセイが実行されない場合は、センサーカートリッジに蓋を戻し、マシンにロードできる状態になるまでプレートを37°Cのエアインキュベーターに戻します。

4. アッセイ設計、注入戦略、データ取得

  1. アッセイの実行
    1. アナライザの電源を入れ、コントローラ(コンピュータ)に接続します。
      注:これは、Wave Controllerソフトウェアのウィジェットパネルの計測器接続ステータスによって確認できます。
    2. WAVE ソフトウェアのテンプレートページに移動し、実験のアッセイ テンプレート ファイルを見つけてダブルクリックして開きます。
      メモ: アッセイテンプレートが [ テンプレート] ビューに表示されない場合は、共有ネットワークドライブまたは USB フラッシュドライブからテンプレートファイルをテンプレートフォルダにインポートします。
    3. アッセイを開始するには、[ アッセイの実行] タブをクリックします。
      注: プレートマップ内でグループ定義が正しく割り当てられている場合、ページの右側にある緑色のチェックマークで示すようにアッセイを実行する準備が整います。この段階では、アッセイサマリーページまたは空白のままのページに追加情報を入力できます。次の手順に進みます。3D微小組織スフェロイドにおけるミトコンドリアモジュレーターの浸透遅延(図2)のために、 表3に記載の測定プロトコル情報を使用する。
測定期間 インジェクション番号とポート 測定の詳細 期間 (h:min:s)
キャリブレーション 該当なし XFアナライザは常にこのキャリブレーションを実行して、測定値が正確であることを確認します 00:20:00 (これは平均であり、マシンによって異なる場合があります)
エクイリブレーション 該当なし 平衡化はキャリブレーション後に行われ、推奨されます。 00:10:00
基底 該当なし サイクル = 5 00:30:00
ミックス = 3:00
待機 = 0:00
メジャー = 3:00
オリゴマイシン / BAM15 インジェクション 1(ポート A) サイクル = 10 01:00:00
ミックス = 3:00
待機 = 0:00
メジャー = 3:00
ロテノン+アンチマイシンA インジェクション 2(ポート B) サイクル = 10 01:00:00
ミックス = 3:00
待機 = 0:00
メジャー = 3:00
合計時間: 03:00:00

表3:XFe96アナライザーを使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝をプローブするためのプロトコル設定。

  1. [ 実行の開始 ] をクリックして、[ 保存場所 ] ダイアログ ボックスを表示します。
  2. 結果ファイルの 保存場所 を入力し、組み立てたセンサーカートリッジを分析器側面のドアから表示されるサーマルトレイに置きます。サーマルトレイが自動的に開き、画面に キャリブラントユーティリティプレートのロード メッセージが表示されるまで待ちます。画面の指示に従う前に、i) センサーカートリッジがユーティリティー・プレートに正しくフィットしていること、ii) センサー・カートリッジから蓋が取り外されていること、および iii) センサー・カートリッジがユーティリティー・プレート上のセンサー・カートリッジの向きが正しいことを確認してください。
  3. 画面上のコマンドに従って、センサーカートリッジのキャリブレーションを開始します。
    メモ:キャリブレーションの完了にかかる時間は約10~20分です(37°Cでのアッセイの場合)。
  4. センサーカートリッジのキャリブレーション後、Wave Controllerの画面上の指示に従ってスフェロイドマイクロプレートをアナライザーにロードし、12分間の平衡化ステップを開始します。
    注:白いチェックマークの付いた緑色のボックスは、その井戸の「良い」キャリブレーションを示します。いずれかの井戸が「良い」校正を提供しない場合、それらは赤い箱と白い十字で示されます。このようなウェルは、 修飾 アッセイタブを使用してアッセイが完了した後に、いかなる分析からも除外されるべきであることに留意されたい。
  5. 機械が平衡化ステップを完了した後、分析器が自動的にベースライン測定値の取得を開始するのを待ちます(機器プロトコルで概説されているように)。
  6. 実験を完了するには、WAVE コントローラーの画面上のコマンドに従います。
    メモ:スフェロイドマイクロプレートをアナライザーから取り外したら、センサーカートリッジを廃棄し、必要に応じてさらに分析(例えば、二本鎖(ds)DNA定量)のためにスフェロイドプレートを脇に置いておきます。マイクロプレートがさらなる分析に必要ない場合は、センサーカートリッジと一緒に廃棄することができます。
  7. アッセイダイアログが表示されるのを待って結果を表示するか、 テンプレート ビューに戻ります。

5. データ正規化および分析戦略 - ポストアッセイ正規化および下流アッセイ(オプションステップ)

  1. データの正規化
    1. スフェロイドデータを正規化するには、スフェロイドサイズと体積を計算し、スフェロイドアッセイでdsDNAを定量するためのデータ正規化戦略に関連する一連のプロトコルを参照してください。これらは補足ファイルとして含まれています。 補足ファイル 1 および 補足ファイル 2 を参照してください。
  2. データ解析
    1. 自動分析ジェネレーターの 1 つにデータをエクスポートするには、WAVE コントローラーのデータエクスポートコマンドに従い、アッセイタイプに一致するエクスポートジェネレーターを選択します。または、データファイルをエクスポートして、Seahorse 分析にアップロードします。
      注: レポートジェネレーターとタツノオトシゴ分析の欠点は、データ分析がXFアッセイの設計方法に限定され、測定サイクル全体で平均を取得できないことです。計測器ソフトウェアからデータセットを手動でエクスポートすると、この点でユーザの好みが可能になります。3Dスフェロイドのミトコンドリア呼吸を評価するための注入戦略が典型的な「MitoStress」テストのそれとは異なる可能性が高いことを考えると、3D細胞培養に固有のこれらのデータセットを分析するのに役立つ一連のスプレッドシートテンプレートが開発されており、要求に応じて提供されます。これらのデータテンプレートファイルは、 図2で詳細かつ説明されている主要なミトコンドリア呼吸パラメータに関するデータを提供します。
    2. データを分析するには、WAVEコントローラソフトウェアからデータをスプレッドシートレポートとしてエクスポートし、独立したスプレッドシートテンプレートを使用して分析します。

Figure 2
図2:細胞外フラックスデータ解析から導出されたパラメータの概略記述子。 略語: OCR = 酸素消費率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Representative Results

十分に形成されたコンパクトなスフェロイドを得るために、各細胞株を播種密度および培養期間について個別に最適化した(図3)。A549、HepG2/C3A、およびSK-OV-3細胞株は、最初に緩い凝集体を形成し、培養7日後まで周囲が明確に定義された丸いスフェロイドに進行しなかった。逆に、MCF-7細胞は3日以内にスフェロイドを形成することができた。すべてのスフェロイドモデルについて、培養期間後の初期細胞播種密度とスフェロイド体積との間に明確な相関関係があった。スフェロイドサイズおよび形態は、播種密度に最適化した。形態学および円形度は、すべてのモデルにおいて回転楕円体サイズの増加とともに低下し始めた。細胞株の播種戦略は、A549およびSK-OV-3細胞について4×103細胞/ウェルで最適化した。HepG2/C3A細胞は、以前は他の場所で1×103細胞/ウェルに最適化されており、MCF-7細胞はすべてのアッセイで4×103細胞/ウェルで使用されていました。最適化された播種戦略では、回転楕円体体積は5.46×107μm3(SK-OV-3)から1.45×108μm3(A549)の間であった(図3B)。すべてのスフェロイドタイプは、初期播種密度と回転楕円体体積との間に線形相関を有し、A549およびHepG2/C3Aはそれぞれ0.957および0.947のR2値を有した。MCF-7およびSK-OV-3スフェロイド体積は、いずれも初期播種密度R2=0.977とより大きな相関を有することが見出された(図3A)。

回転楕円体円形度は、長短回転楕円体直径を使用して、FIJI解析ソフトウェア内の画像平面測定を使用して計算した。完全な回転楕円体対称性は円形度= 1.0であった。1.0からの偏差は円形度の損失を示した(図3C)。円形度は、MCF-7スフェロイドにおいて、すべての播種密度で円形度が0.83〜0.9の間で維持された他のモデルよりも大きかった。対照的に、SK-OV-3スフェロイドの外周はそれほど明確に定義されておらず、スフェロイド体積は培養7日後でさえも有意に小さく、4×103/ウェルの播種密度で最大円形度0.61のスフェロイドを産出した。HepG2/C3A細胞はまた、すべてのスフェロイドの表面積にわたって均一な形態を有するタイトでよく形成されたスフェロイドを形成することが見出され、1×103 細胞/ウェルで播種された細胞について円形度は0.79に維持された。A549細胞は、スフェロイドの円形度と形態が播種密度で増強される傾向に従っているように見えた。しかし、円形度はこれらの実験で使用された密度で0.63以下であった。

基底ミトコンドリア呼吸は、超低付着スフェロイド培養マイクロプレートに1×103、2×103、4×103、または8×103細胞/ウェルで播種したスフェロイドからOCR測定として計算した(図3D)。すべてのスフェロイドタイプについて、OCRは回転楕円体サイズとともに増加し、回転楕円体体積に直線的に相関し、R2はMCF-7スフェロイドで0.988で最高、SK-OV-3スフェロイドでは0.744で最も低かった(図3E)。測定されたOCRは、すべての実験群間で統計的に異なっていた。A549 の OCR は最も低く、最大の回転楕円体サイズで 18 pmol/min/well しか達成できませんでした (図 3D)。逆に、MCF-7スフェロイドは、培養後わずか3日後に最小のスフェロイドサイズで同様のOCRを生じ、最大のスフェロイドサイズに対して53pmol/min/wellの最大ベースラインOCRに達した(図3D)。HepG2/C3Aは、回転楕円体のサイズと形態と非常に一致するOCRデータをもたらした。1 × 10 3 細胞/ウェルから播種された HepG2/C3A スフェロイドでは、ベースライン OCR は平均 15 pmol/min/well に達し、最大のスフェロイドでは最大 52 pmol/min/well まで増加しました(図 3D)。SK-OV-3スフェロイドのOCRは、4~103細胞/ウェルと8~103細胞/ウェルから増殖したスフェロイド×間でのみ有意であり、1~103個、2~103個、×103個、または4~103個×間で増殖したスフェロイド×はほとんど差×見られなかった。サイズの違いにもかかわらず、OCRデータはすべてのサイズ点でHepG2/C3AとMCF-7の回転楕円体の間で非常に類似していた。スフェロイドサイズ(μm3)に対して、MCF-7スフェロイドによるベースラインOCRは、ウェルあたり1,000個の細胞から7日間にわたって増殖したHepG2/C3Aスフェロイドのそれと同等であった。

Figure 3
(A)A549、HepG2/C3A、MCF-7、およびSK-OV-3スフェロイドを播種密度に最適化し、それらの増殖を1×103、2×103、4×103、および8×103細胞/ウェルでそれぞれ左上から右下へ。スケールバー = 500 μm。(B)スフェロイドサイズは、収集された顕微鏡写真からの平面データを用いて計算され、ピアソンの相関統計量を用いて比較された。点線は95%信頼区間の分布を表す。(c)回転楕円体形態は円形度の計算により比較した。(d)OCRを5倍に測定し、その後、アジレント・タツノオトシゴXFe96アナライザーを使用して、非ミトコンドリア呼吸数を説明するためにロテノン - アンチマイシンAを添加した。OCRとして測定されたOCR基底 - OCRr / aは、播種密度(D)とスフェロイド体積(E)の間で比較された。データは、スフェロイドタイプおよび細胞播種密度あたり5〜8ウェル複製からのSEM±の平均である。略語: OCR = 酸素消費率;OCR基底=基底ミトコンドリア呼吸;OCRr/a = ロテノン - アンチマイシンA添加後のOCR。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

XF分析における呼吸調節物質への曝露の濃度と経時変化は、アッセイ最適化における重要なステップです。呼吸調節因子化合物−オリゴマイシン、BAM15、ロテノン−アンチマイシンA−またはDMSOビヒクルコントロールの混合物を、MCF−7スフェロイドを含むマイクロプレートウェルにセンサーカートリッジ注入口を通して順次注入した(図4A)。4つの測定サイクルを完了し、すべてのサンプルグループについて30-40 pmol/min/wellの平均基礎OCRを決定しました。アッセイ期間の残りの期間、呼吸調節剤を5測定サイクルごとに順次添加し、注射1後に0.5μM(0.5μg/mLオリゴマイシン)の最終ウェル濃度を達成した。注射後の2.0μM(2μg/mLオリゴマイシン)2;注射後の5μM(5μg/mLオリゴマイシン3;そして最後に、4回目の逐次添加後の最大ウェル濃度11 μM(11 μg/mLオリゴマイシン)を得た。MCF-7スフェロイドは、実験を通して車両制御に応答しなかった(図4A)。基礎OCRは、最低濃度0.5 μMまたは0.5 μg/mLのオリゴマイシンで各化合物を最初に注射した後、直ちに変化しました(図4B)。MCF-7スフェロイドのOCRは、オリゴマイシンとともに、0.5μg/mLの最初の注射に続く5回の測定サイクル後に41pmol/min/wellから23pmol/min/wellに低下した(図4B)。

0.5 μm BAM15に応答して、OCRは2回目の注射の前に33から41 pmol/min/wellに増加しました(図4C)。比較すると、ロテノンとアンチマイシンAの組み合わせにより、2回目の注射の前にOCRが37から13pmol/min/wellに低下しました(図4D)。運動学的痕跡はさらに、OCRにおける着実な線形減少(オリゴマイシンおよびロテノン - アンチマイシンA)または増加(BAM15)を明らかにした。すべての化合物投与レジメンについて、2 μM BAM15、2 μM ロテノン、2 μM アンチマイシン A、および 2 μg/mL オリゴマイシンの合計ウェル濃度で、10 ~ 12 回の完全な測定サイクル (60 ~ 72 分) 以内に定常状態 OCR が達成されました(図 4A)。酸素消費速度は、約19pmol/min/well(オリゴマイシン)、52pmol/min/well(BAM15)、および10pmol/min/well(ロテノン - アンチマイシンA)で定常状態のプラトーに達した(図4A)。オリゴマイシン、BAM15、またはロテノン+アンチマイシンAの化合物濃度を上昇させることは、さらにOCRに明白な影響を及ぼさず、OCRはアッセイの残りを通して一定にとどまった。これらのデータは、3Dスフェロイドを使用する場合のアッセイ最適化のために、化合物濃度と呼吸調節化合物への曝露の経時変化の両方を考慮すべきであることを示しています。

Figure 4
図4:細胞外フラックス分析を最適化するための重要なステップとしての呼吸調節化合物の滴定。 (A)MCF-7スフェロイドを4×103細胞/ウェルで播種し、3日間にわたって培養した後、XF RPMIを含むスフェロイドアッセイマイクロプレートのウェルに入れ、XFe96アナライザーを使用してOCR±ミトコンドリアモジュレーターをプローブした。OCRを5倍測定し、その後、ビヒクルコントロール、オリゴマイシン(B)、BAM15(C)、またはロテノンアンチマイシンA(D)のいずれかの滴定を加えて、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害し、最大呼吸能力を決定し、または非ミトコンドリア呼吸数を確立する。各ミトコンドリアモジュレーターの濃度を4つの個々の滴定注入戦略(0.5 μM、1.5 μM、3 μM、および6 μM;オリゴマイシンの単位はμg/mL)にわたって増加させ、最適な化合物濃度に応答して最大定常状態OCRを決定した。OCRは、各注射間の5つの測定サイクルについて測定した。データは、5〜8個のウェルが反復するSEM±平均である。略語: OCR = 酸素消費率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

XF技術の主な利点の1つは、無傷の細胞および組織におけるミトコンドリア機能をプローブする能力である。細胞および組織におけるミトコンドリア機能の特定の側面を調べるために、ミトコンドリアモジュレーターを、センサーカートリッジ上の4つの利用可能な注入ポートを介してサンプルマイクロプレートのウェルに順次添加する。XFアッセイにおいてミトコンドリアパラメータをプローブするために使用されるモジュレーターの典型的な配列は、オリゴマイシン、プロトノフォア(例えば、FCCPまたはBAM15)、およびミトコンドリアATP合成酵素を阻害し、最大呼吸能力を決定し、非ミトコンドリア呼吸数を補正するために順次添加されるロテノンとアンチマイシンAの組み合わせである。モジュレーター添加のこの典型的なシーケンスは、アッセイ技術メーカーによってMitoStressテストと呼ばれています。オリゴマイシンが一部の細胞単層20において非結合刺激呼吸を阻害し得ることを考えると、我々は、オリゴマイシン注射の前(単一)および後(逐次)に非結合刺激OCR(OCRmax)を測定することによって、癌由来3Dスフェロイドを用いてこれを調べた(図5A-D)。OCRmaxは、HEPG2/C3AまたはSK−OV−3から形成されたスフェロイドにおけるオリゴマイシンの添加によって有意に制限されなかった(図5Eおよび図5G)。しかしながら、オリゴマイシン後のBAM15の逐次注射後のA549およびMCF-7スフェロイドでは、BAM15の単回注射から達成されたOCR maxと比較して、OCRmaxが有意に低下した(図5Fおよび図5H)。したがって、特に知られていない限り、3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を探索する際には、別々のウェルを使用してオリゴマイシンとアンカプラーで治療し、ロテノンとアンチマイシンAを最終的に添加することが推奨される。このアプローチは、化合物が順次添加される典型的なMitoStress試験と同様に、すべてのミトコンドリアパラメータの計算を可能にする。

Figure 5
図5:ミトコンドリア呼吸器化合物の単回または逐次注射。MCF-7、HEPG2/C3A、SK-OV-3、およびA549のがん細胞由来スフェロイドをXF RPMI中のXFe96スフェロイドマイクロプレートのウェルに入れ、Agilent Seahorse XFe96アナライザーを使用してOCRをプローブした。OCRを5倍測定し、その後、2μg/mLオリゴマイシン(注入口A:緑色微量)または5μM BAM15(注入口A:青色微量または注入口B:緑色微量)でミトコンドリアATP合成酵素を阻害し、それぞれ最大呼吸能力を決定した。運動OCRデータは、%基底(A-D)として表される。最大呼吸容量(OCRmax)は、OCRmax=OCRBAM15/OCR基底の式により基礎OCRの因子として計算した。 OCRmaxは、オリゴマイシン(緑色のバー)およびなし(青色のバー)を有するBAM15注射後の測定サイクル8〜10にわたるOCR平均から得た。データは、スフェロイドアッセイマイクロプレート全体±3〜8個のウェルが複製するSEMの平均である。略語: OCR = 酸素消費率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

これらの最適化実験で決定された最適な細胞播種密度、化合物濃度、注入戦略、および測定サイクル期間(表3)を使用して、基底ミトコンドリア呼吸を正確にプロービングするための詳細なプロトコルを開発しました:OCR基底呼吸(図6A)、ADPリン酸化呼吸:OCRADP(図6B)、リーク呼吸:OCRオミー(図6C)、結合効率(図6D)、最大呼吸容量:OCR最大(図6E)、および予備呼吸容量:OCRスペア(図6F)は、癌由来3Dスフェロイドを使用した。

Figure 6
図6:XF技術によるOCRのプロービングにより、がん由来スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を確立する。MCF-7、HEPG2/C3A、SK-OV-3、およびA549のがん細胞由来スフェロイドをXF RPMIのスフェロイドアッセイマイクロプレートのウェルに入れ、Agilent Seahorse XFe96分析装置を用いてOCRをプローブした。OCRを5倍に測定し、その後、2μg/mLオリゴマイシンまたは5μM BAM15、およびRAを添加してミトコンドリアATP合成酵素を阻害し、最大呼吸能力を決定し、非ミトコンドリア呼吸数をそれぞれ計算した。(a)基底ミトコンドリア呼吸(OCRbasal)は、ポートA注射前の3測定サイクルからのOCRの平均として算出した。(b)酸化的リン酸化の結合効率は、OCRADP(OCR基底-OCRリーク)をOCR基底値に対する百分率で表すことによって近似した。(c)ADPリン酸化呼吸(OCRADP)をオリゴマイシン感受性OCRとして測定し、BAM15注射前の測定サイクル11〜13にわたる平均OCRから算出した。(d)漏出卵呼吸(OCRリーク)は、オリゴマイシンに非感受性のOCRとして測定し、測定サイクル11〜13にわたって平均化されたOCRから計算した。(e)最大呼吸容量(OCRmax)は、BAM15注射後に測定された平均最大OCRとして測定した。(f)予備呼吸容量は、OCR予備(OCRmax−OCR基底)をOCR基底値に対する百分率として表すことによって計算した。ロテノン - アンチマイシンA注射後のOCR(OCRr r / a)は、非ミトコンドリアOCRを補正するためにすべての率から差し引かれた。データは、XFe96スフェロイドプレート全体±3〜8個のウェル複製からのSEMの平均である。略語: OCR = 酸素消費率;RA = 2 μM ロテノン-2 μM アンチマイシン A. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3日間にわたって4 × 103 細胞/ウェルから増殖したMCF-7スフェロイドをモデルとして使用し、スフェロイドアッセイマイクロプレート内での最適な転写、配置、および分析を決定しました。メーカーから提供されたスフェロイドマイクロプレートに提供された寸法を使用して、ウェル表面を最適な回転楕円体配置のために3つのゾーン領域に分割し(図7A)、ゾーン1をウェルの中心で最適ゾーンとして強調表示した。広いオリフィスピペットチップを使用した慎重なピペッティングにより、回転楕円体プレートにスフェロイドを移し、重力溶出によってウェル表面にランダムに分布させました(図7B)。スフェロイドが重力溶出を使用して慎重に転写された場合、ほとんどのスフェロイドは、通常、製造業者から推奨される転写技術を使用して、マイクロプレートのゾーン1〜2で見出すことができた。スフェロイドが吸引によってピペットチップから押し出されたところでは、スフェロイドはしばしばこれらのゾーンを超えて配置され、顕微鏡法では見ることができなかった。

スフェロイド配置位置を比較するために、MCF−7スフェロイドを、指定されたゾーン1〜3またはゾーン外のスフェロイドアッセイマイクロプレートに移した(図7A)。これらの4ウェルを、ベースライン時およびオリゴマイシン、BAM15、またはロテノン - アンチマイシンAの添加後に、運動学的実験OCRを通して追跡した(図7C)。OCRは、各注射前の3サイクル読み取り値の平均から計算した(図7B)。OCRは、4つの選択されたウェルにおいて200分にわたって動態的に測定され(図7C)、ベースライン補正(図7D)された。スフェロイドをゾーン3またはゾーン外に配置した場合、ベースラインOCRはゾーン1および2に配置されたスフェロイドよりも有意に低かった(図7C)。呼吸器化合物オリゴマイシン、BAM15、およびロテノン - アンチマイシンAの効果も、ゾーン3およびゾーン外領域と比較して、ゾーン1および2に配置されたスフェロイド間で劇的に異なっていた。OCRの増加は、ゾーン3またはゾーン外に配置されたスフェロイド中のオリゴマイシンで見られた(図7E)。さらに、ゾーン3またはゾーン外に配置されたスフェロイドは、ロテノン - アンチマイシンA注射後のベースラインよりも高いOCRを有するBAM15に対して過度に高い応答を経験した(図7E)。ゾーン1に対してゾーン2に配置されたスフェロイドでは基底OCRがほぼ2倍に増加したにもかかわらず(図7C)、すべての呼吸器化合物に対する応答のフォールド変化は非常に類似しており(図7E)、ゾーン1または2に配置されたスフェロイド間の基底OCRの違いがウェル内の配置の結果である可能性は低いことが示唆された。

Figure 7
図7:スフェロイドアッセイマイクロプレート内のスフェロイドの配置は、XF技術を用いた基底OCRおよびミトコンドリアモジュレーター効果を決定する。 MCF-7スフェロイドを4×103細胞/ウェルで播種し、XF RPMIを含むスフェロイドマイクロプレートのウェルに入れる前に3日間にわたって培養し、Agilent Seahorse XFe96アナライザーを使用してOCRおよ±ミトコンドリアモジュレーターをプローブした。(a)アッセイ期間後のスフェロイドアッセイマイクロプレートにおけるスフェロイドゾーン位置の顕微鏡写真;スケールバー = 500 μm および対応するウェルから時間経過でキャプチャされたOCRは、pmol/min-1/well-1(B)または%基底(C)のいずれかとして表されます。(d)スフェロイドアッセイマイクロプレート内の異なるゾーンに配置されたMCF-7スフェロイドのミトコンドリアモジュレーター効果;基底からのフォールド変化として表されるデータ。(E)Eに提示されたデータに対する各ミトコンドリアモジュレーターの応答を計算するためにどのOCRデータ測定値(赤丸)が使用されるかを強調する動態トレースの例。示されているデータは、個々のウェル応答からのものである。略語: OCR = 酸素消費率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

背景の選択基準は非常に重要です。バックグラウンド補正のための最外周ウェルの使用は、すべてのマイクロプレートウェルを代表するものではなく、誤ったデータ仮定が導かれ、回転楕円体マイクロプレート全体のエッジ効果による誤ったデータ結論につながる可能性があります。この観察結果を評価するために、MCF-7スフェロイドを使用してアッセイ補正手順を比較し、ビヒクルコントロール、オリゴマイシン、BAM15、またはロテノン - アンチマイシンAの添加に応答してOCR値を導出しました(図8)。すべての呼吸器化合物は、選択された化合物について予想される運動学的OCRプロファイルをもたらし、20〜30pmol/min/wellの平均安定した基礎呼吸数を明らかにした(図8A)。しかし、バックグラウンド温度補正のために最外周ウェル(A1、A12、H1、およびH12)を使用してアッセイデータを分析した場合、呼吸器化合物の添加後にOCRについて明らかになった値は特に低かった。OCRは、ロテノン - アンチマイシンAについて負の値をもたらした。これらの観察に応答して、バックグラウンド温度補正ウェルとして、スフェロイドマイクロプレート全体にランダムに分布した一連の空のウェルを用いて、代替分析を実施した(図8B)。代替バックグラウンド補正が適用された場合、OCRに対するすべての相対複合効果は、両方の分析セットで同じであった。しかし、OCRの絶対値は約10pmol/min/well増加しました(図8)。これらのデータは、スフェロイドアッセイマイクロプレート上のバックグラウンド温度補正のパワーと重要性を強調し、XF分析のためのユーザー最適化の重要性を強調しています。

Figure 8
図8:スフェロイドアッセイマイクロプレート全体の温度勾配の制御を改善するためのバックグラウンド補正のためのウェルのランダム選択。バックグラウンド補正(A)に推奨ウェルを使用して図2Aから外挿したOCRデータと、バックグラウンド補正用のランダムに割り当てられたウェル(B)との比較。略語: OCR = 酸素消費率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞単層とは異なり、スフェロイドは 3D 空間内の細胞の不均一な凝集を表すため、特にこれらのデータを正規化する際には、解析に関して十分な検討が必要です。このホワイトペーパーでは、MCF-7回転楕円体から取得したXFデータを正規化するための3つのアプローチを紹介します(図9)。正規化されていない場合、OCRは、ピアソン相関係数P=0.0057と統計的に比較した場合、スフェロイドサイズ(初期細胞播種密度によって決定される)と正の相関(R2 = 0.98)します(図9A)。この線形関係は、OCRが初期細胞播種密度(R2 = 0.78)に正規化され、スフェロイドサイズ(P = 0.117、図9B)と有意に相関しなくなると低下する。これは、回転楕円体体積に正規化した場合にも当てはまります(R2 = 0.ピアソン相関係数P=0.120、図9C)および核dsDNA含量(R2=0.58;ピアソン相関係数P=0.233、図9D)。これらのデータは、スフェロイドのミトコンドリア代謝を調査する際に、特にそれらが異なるサイズである場合、XFデータを正規化することの重要性を強調しています。

Figure 9
図9:細胞スフェロイドから取得した細胞外フラックスデータの正規化(A)生OCRデータを3日間にわたって培養したMCF-7から取得し、ピアソンのモデルを使用してプロットし、スフェロイド播種密度とOCRとの間の相関係数を得た。P 値を 0.05 に設定します。(B)生のOCRデータを、初期スフェロイド播種密度に対して正規化した;(c)顕微鏡平面測定から得られたMCF-7スフェロイド体積;(D)ピアソンの相関係数を用いて比較した核ds DNA含量。略語: OCR = 酸素消費率;ds DNA = 二本鎖 DNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞株 播種密度(井戸) 回転楕円体の成長 (日) 最終回転楕円体体積(μM3) 基底OCR (pmolO2/分/ウェル) 基礎OCRの感度が満たされた(はい/いいえ)
ショフ 1000 5 9.52E+06 28 ± 3.5 はい
ショフ 2000 5 2.38E+07 26 ± 1.4 はい
ショフ 4000 5 4.92E+07 36 ± 3.1 はい
ショフ 8000 5 1.11E+08 50 ± 7.9 はい
ヘップG2 1000 5 1.11E+07 15 ± 0.7 いいえ
ヘップG2 2000 5 2.88E+07 23 ± 1.8 はい
ヘップG2 4000 5 5.46E+07 31±1.7 はい
ヘップG2 8000 5 1.21E+08 52 ± 2.8 はい
A549 · 1000 5 2.11E+07 30 ± 2.5 はい
A549 · 2000 5 3.57E+07 41 ± 1.6 はい
A549 · 4000 5 6.93E+07 53 ± 7.2 はい
A549 · 8000 5 1.44E+08 65±8.4 はい
ティッカー 1000 3 1.60E+07 29 ± 0.8 はい
ティッカー 2000 3 2.52E+07 37 ± 1.7 はい
ティッカー 4000 3 6.00E+07 46 ± 1.7 はい
ティッカー 8000 3 1.06E+08 66 ± 2.9 はい

表4:単一の3Dスフェロイドにおける基礎OCR測定値を決定するための最適化されたパラメータ。 略語: OCR = 酸素消費率。

補足ファイル1:回転楕円体のサイズと体積の分析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:スフェロイドマイクロプレート内のスフェロイドからの二本鎖DNAの定量化。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:信頼性の高いXFアッセイデータセットを取得するために必要な反復数の推奨事項。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

主な調査結果と成果
この論文では、XFe96 XF Analyzerを搭載した一連のがん由来細胞株を使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。強制凝集のための細胞忌避技術を用いて、A549、HepG2/C3A、MCF7、およびSK-OV-3細胞スフェロイドの迅速な培養のための方法が開発され、記述されている。このプロトコルは、(1)スフェロイド培養プロトコルの最適化、および技術メーカーからの特定のスフェロイドアッセイマイクロプレートへのスフェロイドの取り扱いと移動を元の培養容器から含む、XF技術によるスフェロイド代謝のプロービングに関する多くの考慮事項に対処します。(2)使用する呼吸器化合物の濃度および化合物浸透の時間依存性;(3)使用する注入戦略;(4)実験群間でデータを正規化する方法。これらすべての考慮事項は、現在の論文で検討されており、以下でさらに詳しく説明します。これらの方法は、XFe96 Flux アナライザーで単一の 3D スフェロイドを使用して一貫した代謝酸素フラックスデータを生成するための簡略化されたアプローチとして提示されます。この実験的アプローチは、基本的な実験室環境内で容易に実装される他の回転楕円体モデルで使用するための出発点およびルーブリックとして使用することができる。

考慮 事項
XF技術の回転楕円体の成長、サイズ、感度
XF技術で再現可能なデータを確立するには、特定のモデルのアッセイを特性評価し、最適化することが不可欠です。このアプローチは、細胞の基本的な単層では比較的簡単です。しかし、これは、細胞を3Dスフェロイドとして培養する際に追加の課題を提示する。ここで提示した実験の間、製造業者からのRPMI培地は、使用時に補充された。いくつかの細胞株、すなわちHepG2/C3AがDMEM増殖培地中で培養されたことに留意されたいが、これらの比較的短いアッセイ(〜3〜5時間)の間、RPMI-DMEM製剤による置換はXF分析に限られた影響しか及ぼさなかった。2つの培地の処方は非常に類似しており、ユーザーは、補充、例えばグルコースの増加、炭水化物源のさらなる添加を通じて、タツノオトシゴRPMI培地を細胞培養培地のマトリックスに一致させるように「調整」することができる。すべてのXF緩衝液および培地の最終製剤にとって重要なのは、XFプローブカートリッジプレート内の蛍光プローブに干渉する可能性のあるフェノールレッドと、細胞培養インキュベーターに存在するCO2 緩衝液の欠如のためにアルカリ性をもたらす炭酸水素ナトリウムの不在である。その他のメディアおよびバッファは、社内で購入および/または製造することができます。例えば、クレブスリンガーHEPESバッファーは、スフェロイドモデルを含む多くの異なる細胞における呼吸を評価するために使用できる単純なバッファーである。しかし、XFアッセイのユーザーは、培地/バッファーとその補充の変化により、全体的な緩衝能が変化する可能性があることに注意する必要があります。これは、ユーザーがEKRの測定に関心があり、ACERから陽子流出速度(PER)への変換を可能にするために培地のバッファ係数を評価する必要がある場合に特に懸念される。

XF技術によって測定された細胞OCRは、ウェル内の細胞数がシステムの感度内にある場合、細胞密度に比例するため、単一の3Dスフェロイドを使用してこの関係を調査することが重要でした。1ウェルあたり1,000、2,000、4,000、または8,000細胞の密度で播種された4つの異なる癌細胞株から培養された単一の3DスフェロイドのOCRをプロービングすることにより、XFe96分析装置は、異なる細胞播種密度から増殖した3Dスフェロイド間のミトコンドリア呼吸速度の変化を拾うのに十分な感度を有することを示した(図3)。我々は、OCRをプロービングするための3Dスフェロイドを形成するための細胞播種密度の最適な範囲、したがってスフェロイド体積が細胞型によって異なることを示した。これは、OCRと播種密度または回転楕円体体積との間の線形関係によって示される(図3)。A549およびHepG2/C3A細胞の場合、OCR感受性の最適な播種密度は1,000~8,000細胞/ウェルであった。MCF-7では2,000-8,000細胞/ウェル、SK-OV-3細胞では4,000-8,000細胞/ウェルであった。これらのデータは、XF技術を使用してOCRを評価する際に、回転楕円体サイズの最適化が特に重要であることを示しています。

最小回転楕円体体積と最大回転楕円体体積と基底OCRに関する考慮事項
一般に、これらの実験のために製造業者によって推奨される測定可能なOCRパラメータの最小閾値および最大閾値が常に存在するであろう。XFe96分析装置の場合、それぞれ20pmol O 2/min/wellと200pmol O2/min/wellの間の基底OCRが下限と上限です。これは単層細胞およびスフェロイドの場合であり、実験モデルがこの動的OCR範囲内に位置する場合、利用可能な生物学的物質の量、例えば、単層としての細胞の数またはスフェロイドのサイズに依存する。ここで使用した回転楕円体モデルによってOCR閾値がどのように達成されたかの例については、表4を参照してください。これらのデータがレベルデータとしてこれらの測定値からも利用可能である井戸内の酸素レベルをチェックすることは賢明かもしれません。これは、品質管理の目的で各実験から定期的に見る必要があります。井戸に酸素枯渇がある場合、これはデータ内で明らかになります。その場合は、実験内の測定サイクルを調整する必要があります。例えば、測定サイクル内の次の測定期間の前にウェル内の酸素レベルが回復するように混合ステップを増加させる。可能性はあるものの、記載されている細胞株を用いた単一回転楕円体実験では、この可能性は低いことが分かっています。

細胞外フラックスアッセイのためのミトコンドリア脱共役剤の選択
カルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)21、カルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)22またはBAM1523などのプロトンイオノフォアは、ミトコンドリア膜を横切る電気化学的プロトン勾配を破壊し、ATPの産生を阻害し、最終的にミトコンドリア呼吸を脱結合することができる強力な低分子化学物質である24.新しい小分子は、これらの目的のために、特に代謝性疾患の治療において開発され続けている25、26、27;2つの優れたレビュー28,29を参照してください。逆に、酸化呼吸の脱共役は、望ましくないオフターゲット毒性30と関連している。しかしながら、in vitro細胞アッセイ内では、分子FCCPはミトコンドリア膜電位を脱分極し、原形質膜脱分極などのオフターゲット効果を発揮し、NA+イオンフラックス31を破壊する。細胞タンパク質プロセシング32との干渉、さらには細胞老化33を誘導する。BAM15は、原形質膜23への影響を最小限に抑えたミトコンドリアアンカプラーとして2013年に導入され、全細胞ではマイクロモル範囲、単離されたミトコンドリアではナノモル範囲の原始異形成活性23,34を有する。

原形質膜脱分極に対するFCCPの効力を考えると、BAM15は、細胞外フラックスアッセイにおいてインタクトな全細胞における開共役呼吸のためのより信頼性の高いプロトノフォアである。FCCPおよびそれに対応するCCCPは、最大呼吸能力を測定するために50年以上にわたって使用され、XF研究で広く使用され続けていますが、これらの小分子の使用はしばしばミトコンドリアおよび細胞代謝能力を過小評価しています。これは、XF技術を使用する非常に多くの出版物が、FCCPが使用されているときに負の予備呼吸能力を報告したり、真のミトコンドリア呼吸能力を過小評価したりする罠に陥る理由と部分的に関連しています。無傷の細胞および組織におけるFCCPの効力の追加は、しばしばミトコンドリア機能の損なわれをもたらし、細胞は、非常に低い濃度であっても、それらの添加後の複数の測定サイクルにわたって最大呼吸能力を維持するために適切に動作するのに苦労する可能性がある35。したがって、FCCPに対する細胞の応答は、多くの研究において、最初の測定サイクル期間の後に低下することが見出され得る。FCCPはXF分析に日常的に使用されてきましたが、BAM15は、10μM3の濃度で完全に脱分極したミトコンドリアで最大呼吸能力を維持できることを考えると、全細胞またはスフェロイドモデルを含む場合に優先的に使用されます3。さらに、BAM15は細胞外酸性化に対する効果を誘導し、これはCO2の水和による栄養素の酸化のそれと一致し、FCCP3よりも大きな程度までHCO3-およびH+を形成する。それにもかかわらず、単離されたミトコンドリアおよび透過処理された細胞の場合、これらの脱共役剤のいずれかが、正しい濃度で滴定されれば、ミトコンドリア脱共役のためのBAM15と同様に機能するはずである。

化合物浸透とアッセイサイクルの動力学
XFアナライザを使用して3Dスフェロイドを使用した典型的なMitoStress試験を実施するために使用される化合物の濃度、浸透度、および速度論的プロファイルは、対処するのがより複雑です。スフェロイドが3D構造に存在することを考えると、スフェロイドの直径にわたる分子の浸透は、細胞単層全体にわたるよりも無限に複雑なプロセスである。例えば、動態学的浸透およびしたがって、化学療法ソラフェニブに対する感受性は、スフェロイド年齢およびしたがって、HepG2スフェロイドモデル36におけるサイズによって決定された。小分子化学物質(例えば、薬物、ナノ粒子)が生物学的標的に到達する能力は、動的に浸透し拡散されるシステムの複雑さを含むいくつかの根底にある要因に依存する37,38。これは、腫瘍組織39を標的とする薬物に特に当てはまる。3Dスフェロイドの文脈における腫瘍標的化と同様に、サイズ、コンパクトさ、および薬物トランスポータータンパク質の発現などの他の表現型応答は、生物学的応答を惹起するために必要な化合物の浸透時間および濃度を支配することができる。

このプロトコルでは、ATP合成酵素阻害剤オリゴマイシン、原始相およびミトコンドリアアンカプラーBAM15、ならびに複合体Iおよび複合体III阻害剤のロテノンおよびアンチマイシンAの組み合わせに応答して、浸透時間と低分子濃度に関する問題に対処した。これらの一般的な呼吸化合物の複数回の滴定に曝された単一のMCF-7スフェロイドのOCRをプローブすることにより、定常呼吸数を誘導するために必要な各化合物の最適濃度が単層細胞のそれと同様の範囲内にあることを実証する(図4)。重要なことに、単層対応物とは異なり、注入間の測定サイクル数を増やすことが、単一の3Dスフェロイドで定常状態のOCRを達成するための鍵であることが示されています。これらのデータは、これらのアプローチを用いて3Dスフェロイドのミトコンドリア呼吸パラメータを探索する際の化合物浸透の重要性とそれぞれの運動学的プロファイルを強調している。図3、図4、および図5に提示されたデータによって情報を得たスフェロイド最適化特性、化合物濃度、および測定サイクルタイムを使用して、がん由来の3Dスフェロイドの範囲におけるミトコンドリア酸化代謝の特定のパラメータをプロービングするための検証済みのMitoStress試験が確立された(図6)。重要なことに、いくつかの単層癌細胞株40と同様に、特定の癌由来3Dスフェロイドの最大呼吸能力(非結合刺激呼吸の速度)は、オリゴマイシンによって阻害された(図5)。具体的には、A549またはMCF-7細胞のいずれかから増殖させた3Dスフェロイドは、オリゴマイシン注射後にBAM15と非結合された場合に、オリゴマイシンを含まないBAM15によって非結合された場合と比較して有意に低い最大呼吸速度を示した(図5Fおよび図5H)。この効果が他の3Dスフェロイド培養物に存在する可能性があることを考えると、以前に検証されたプロトコルが採用されない限り、3Dスフェロイドの最大呼吸能力はオリゴマイシンなしで推定されるべきである。

細胞スフェロイドにおける解糖系フラックスの尺度としてのEKRデータの同時収集
技術メーカーの文献または情報に典型的に見られるように、ECARとして測定されるスフェロイドの解糖系速度は、OCRとともに捕捉することができる二次パラメータである。ECAR の計算のみでは、XF アッセイバッファーの緩衝能や、CO2 から HCO3 および H+ への水和から生じるミトコンドリア酸性化の付加が補正されないため、XF 実験において有用または意味のあるパラメータではありません。ECARは、これらのデータ補正が適用された後にのみ洞察力に富み、その後、解糖系フラックスについてより正確な結論を提供することが可能になります。バッファリング能力を補正してより意味のあるPERデータを生成するには、回転楕円体マイクロプレートのマイクロチャンバーの体積を知る必要があります。メーカーは、回転楕円体マイクロプレートでこれに対する真の体積を提供することができなかったため、PERデータを容易に決定することはできません。実際、これらの測定は経験的に達成することができたが、これはこの原稿の範囲を超えていた。しかし、適切な補正を行い、ウェル内に存在する所与の回転楕円体サイズに対するマイクロチャンバーの体積を知ること(例えば、回転楕円体密度の尺度を得ること)により、ECARデータは意味のあるものとなり、解糖系PERの計算が可能となる。したがって、XFデータは、スフェロイドにおける解糖系および酸化的代謝を調査するためにより有益であり得るが、これらのパラメータが深く考慮された場合に限られる。

回転楕円体の形成、取り扱い、移動、移動
いくつかの細胞株は、他の細胞株よりもスフェロイドの形成に適しており、スフェロイドを全く形成しない可能性があり、例えば、MCF-7卵巣癌細胞41,42は、他の細胞株と比較して高度に円形のスフェロイドを形成する(図3)。別の例として、Capan−1膵臓癌細胞は、Panc−1またはBxPC343よりも良好なスフェロイドを形成することが示されている。同様に、肝癌細胞株は、HepG2対HepG2/C3A 9,45,46またはHepaRGスフェロイドの場合と同様に、薬物代謝の増強またはアルブミンの産生などの表現型の観察された変化を伴う、コンパクトなスフェロイド5,44を形成する可変能力を有することが知られている17,47,48.したがって、ユーザーはそれに応じてスフェロイド培養技術を最適化し、滴定実験を実行して最適な播種密度と栽培時間経過を決定する必要があります。加えて、アッセイ媒体の製剤および組成物は、メチルセルロースの添加を含むスフェロイド製剤に影響を与えることが示されており、マトリックス粘度を上昇させるために媒体に添加されることが多い43、49、50。したがって、最適な細胞培地組成は、使用されるすべての細胞株について経験的に決定されるべきである。

スフェロイド培養中の培地交換の数は、使用する細胞株によって決定される。しかしながら、典型的には、2〜3日毎の半容量培地交換が、ほとんどの場合、栄養素を補充するために適用可能である。我々は、XF解析研究におけるスフェロイドモデルの迅速な開発と展開のために、市販のソースからの細胞忌避マイクロプレートを使用して3Dスフェロイドを生成するために強制凝集アプローチを使用した。しかしながら、代替プラットフォームは、他の細胞型、例えば、ハンギングドロップまたはマトリックス埋め込みアプローチからスフェロイドを生成するのにより適している可能性がある。資源が限られている研究室では、初期のスフェロイド法開発ステップの経済的コストを大幅に削減するために、細胞忌避マイクロプレート表面51,52の形成のためのアガロース - 液体オーバーレイ技術に目を向けたいと思うかもしれません。培養容器間のスフェロイドの移動は、XF分析および他の下流アッセイを実行するために必要である。転送の容易さは、通常、回転楕円体のサイズと全体的な密度によって決まります。回転楕円体の完全性を維持するために、P200またはP1000ワイドオリフィスピペットチップを使用することをお勧めします。小口径のピペットチップは、商業的に調達して購入できるスフェロイドの機械的破壊の危険性があり、ピペットチップの端をトリミングしてオリフィスを増やすだけで慎重に行うことができます。ただし、このアプローチでは、先端の端付近のプラスチックに毛羽立ちが付く可能性があり、取り扱い中に機械的に中断する可能性があります。バックライトまたはライトボックスの使用は、スフェロイドアッセイマイクロプレートへのスフェロイドの転写を確実に成功させるための不可欠なステップとして、解剖顕微鏡下でのスフェロイドの取り扱いおよび観察にも有用である。さらに、スフェロイドアッセイマイクロプレートのウェル内のスフェロイド位置は特に重要であり、典型的なMitoStress試験(図7)中のOCRおよび化合物効果に直接影響しますが、これはおそらくスフェロイド位置とセンサープローブフルオロフォアの関係によるものです。

バックグラウンド補正および温度制御井戸
マイクロプレートベースのアッセイの使用は、いくつかの研究分野で広く使用されているアプローチです。しかし、それらを使用するにはいくつかの実用的な課題があります。他の実験的アプローチ、特に96(またはそれ以上)アレイ形式を使用するアプローチに当てはまるように、マイクロプレートの形状と位置決めは、時間の経過とともにプレート全体の温度およびガス交換勾配に影響を与える可能性があり、しばしば「エッジ効果」と呼ばれる53,54。我々は、スフェロイドアッセイマイクロプレートについても同じことがわかった。メーカーのガイドラインとプロトコルでは、最も外側のコーナーウェル(A1、A12、H1、およびH12)は、常にXFe96アナライザのバックグラウンド補正および温度制御ウェルとして指定されています。逆に、24ウェルアレイフォーマットでは、A1およびD6は、B4およびC3のプレートの中央に均等に広がる他の2つのウェルとともに、コントロールウェルとして指定される。XF回転楕円体解析を実行すると、製造元のガイダンスを使用して最初に収集されたデータに大きな偏差が見つかりました。これは、データの取得を開始する前に、温度およびCO2含有量に対するアッセイの事前平衡化を確実にするために必要なステップが含まれていたにもかかわらず、特定の呼吸器阻害剤の注射後のOCRに対してしばしば負の値をもたらした(図8)。

我々は、これらの観察が、スフェロイドアッセイマイクロプレート全体にわたるエッジ効果に起因する可能性が高いことを見出した。 図8において、マイクロプレート全体にバックグラウンドコントロールウェルを再分配し、XFデータを約2倍に調整したことを見出した。最も可能性の高い理由は、(1)エッジウェルでの蒸発効果により、XFe96プローブがサンプリングするためのチャンバーの総容積が小さくなったこと、および(2)バックグラウンド補正用に指定されたウェルとサンプルウェルの間の不十分な温度平衡化により、OCRをマスクまたは過剰に膨張させるデータセットが生じるためです。したがって、このような結果を回避するために、特に回転楕円体分析の文脈において、ユーザーはバックグラウンド補正用に指定されたウェルをスフェロイドアッセイマイクロプレート全体に再分配し、XFデータを取得する前にアッセイを事前に平衡化するために必要な措置を講じることが推奨される。

データの正規化
本稿では、XF技術を用いて単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供することに加えて、3Dスフェロイドで得られたミトコンドリア呼吸数データを正規化する可能性のある方法も提示する。異なる細胞播種密度で培養したMCF-7スフェロイドで得られた呼吸数データ(図3)を用いて、我々は、初期細胞播種密度、スフェロイド体積、およびdsDNA含量(図9)に正規化したときにサイズと直径が増加するMCF-7スフェロイドから基底ミトコンドリア呼吸数を提示する。適切な正規化方法は、特に in vitro 3Dスフェロイドモデルと異なる細胞型を比較する場合、XFデータセットの正確な解釈にとって最も重要です。正規化が不十分な場合、データセット間で比較できない誤った結果が生じる可能性があります。前処理は呼吸数に有意な影響を及ぼさずにタンパク質合成の速度に影響を与える可能性があるため、タンパク質含有量はスフェロイドXFデータの正規化には好ましくない。さらに、有意で一貫性のない量のタンパク質は、細胞溶解時にスフェロイドマイクロプレートに結合することができ、ウェル間のタンパク質含有量の変動を導入する。これは、スフェロイドまたはタンパク質を含む可能性のある生体分子接着剤を必要とする非接着細胞を用いたXF分析ではさらに複雑になる可能性があります。

細胞内タンパク質含有量とは対照的に、核DNA含量は細胞型とは無関係であり、細胞数に比例する(図9D)-細胞数定量のためのスフェロイドの分解よりも正確で時間のかかるアプローチである。逆に、線維芽細胞の単層でXF解析を行ったYepéz et al.55は、XFデータを細胞数に正規化すると、正規化前よりもデータの分散が大きいことを発見しました。核DNA含量は分化した状態または表現型とは無関係であるため、XFアッセイにおけるスフェロイドデータの正規化は、タンパク質含量よりも正確である。DNA含量は、他の代謝関連データセットの分析のための実証済みの戦略でもある56。しかし、核DNA含量はスフェロイド内に存在するすべての細胞から定量化されることに注意することが重要です。したがって、DNA含量への正規化は、スフェロイドが細胞生存率の著しい損失をもたらす可能性のある治療を受けるXFデータセットでは推奨されない。このようなデータセットの場合、可能であれば、細胞生存率に対する正規化が好まれるか、またはデータを基礎呼吸に対してベースライン補正することができる。

予備の呼吸能力をデータ正常化の重要性の模範として使用する
予備呼吸容量は、最大ミトコンドリア呼吸容量から基底ミトコンドリア呼吸数を引いた速度の尺度である(図6)。しかし、このタイプのデータをレート、すなわち特定の実験内でpmolO2/min/wellとして報告することの問題は、データが正規化の無効であることです。スフェロイドデータを細胞密度/DNA含有量に正規化しても、細胞内のミトコンドリア密度について正規化する必要がある重要なパラメータが除外されることがよくあります。ミトコンドリア密度の変化が基底呼吸と最大呼吸の比例的な変化につながることを考えると、予備容量も増加します。たとえば、回転楕円体 OCR基底 が 200 で OCRmax が 400 の場合、予備容量は 200 と報告されます。OCR基底 値が 100 で OCRmaxの場合、予備容量も 100 です。ただし、パーセンテージとして、それらは両方とも最大値の50%(または基礎値の100%)です。したがって、予備容量は、pmols O 2/min/wellとして計算した場合の200と100の割合の違いにもかかわらず、これら2つの例間では変化しません。内部的に正規化された値は、より信頼性が高く、洞察力に富み、XFデータを研究やプロジェクト間でより比較可能にします。予備の呼吸能力に対してこれを行うために、我々はこれを絶対速度ではなく最大呼吸の割合として提示することを選択しました。これはまた、基礎呼吸の割合として提示することができる。これは、細胞や回転楕円体を扱う場合に当てはまります。しかし、マイクロウェルプレート内の回転楕円体の位置は絶対OCRを変化させるかもしれないが、阻害剤またはアンカプラーによる相対的変化は変えないかもしれないことを考えると、回転楕円体の内部的に正規化された応答をフォールド変化またはパーセンテージとして見ることがより重要である。

ここで生成された回転楕円体モデルは、従来の 2D モデルではキャプチャできないさまざまな細胞タイプとアーキテクチャを示しています。これらには、3次元における細胞の不均一で空間的な配置、細胞間接触の増強(例えば、ギャップ接合および細胞外マトリックスの形成)、およびスフェロイド直径全体にわたる生化学的勾配(例えば、pH勾配、栄養素への酸素拡散アクセス)が含まれる。細胞外フラックスを使用して in vitro スフェロイド生物学を研究することで、代謝摂動観察を通じて薬物療法の最適な標的を同定することができます。これらは、in vitro スフェロイドからin vivo 腫瘍に外挿され、スフェロイド - 腫瘍代謝、例えば、スフェロイド成長中の炭水化物利用を標的とする可能性のある経路を同定することができる。治療モダリティは、初期の成長段階でスフェロイドを標的化するのに効果的であるかもしれないが、代謝ネットワークの複雑さが成熟するにつれて、スフェロイド成長の後期段階ではあまり効果的ではないことが証明される。結論として、生物学的研究における3D細胞培養モデルと高度な解析技術の開発は、比類のない可能性を秘めたダイナミックで急速に変化する分野であり続けるでしょう。 in vitro 細胞培養スフェロイドの細胞外フラックス分析は、ヒト関連生物学をよりよく理解し、研究における動物モデルの使用を減らし、患者中心の研究を強化するために外挿できる研究成果を前進させるために、最先端の研究方法として採用することができる。

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Disclosures

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgments

N.J.C.は、Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003) と共に BBSRC MIBTP CASE Award の支援を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. - Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. -
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling

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がん研究、第180号、

Erratum

Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索
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Coltman, N. J., Rochford, G.,… More

Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).

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