Summary
昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア 餌、ならびに選択的人工培地、すなわちクロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天(CTC培地)を用いて熱帯土壌サンプルから単離される。
Abstract
本研究の目的は、土壌サンプルから昆虫病原性真菌(EPF)を単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。土壌は微生物の豊かな生息地であり、特に節足動物の害虫を調節できる メタリシウム 属および ボーベリア属に属するEPFを含む。真菌に基づく生物学的製剤は、主に農業節足動物有害生物防除のために市場で入手可能である。それにもかかわらず、高い固有種の生物多様性にもかかわらず、世界中の市販のバイオ製品に使用されている株はごくわずかです。本研究では、524の土壌サンプルを、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシイミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天培地(CTC培地)上で培養した。真菌コロニーの成長を3週間観察した。すべての メタリジウム および ボーベリア EPFは、属レベルで形態学的に同定された。さらに、いくつかの分離株は種レベルで分子的に同定された。これら524の土壌サンプルのうち24個は、昆虫餌法(Galleria mellonella および Tenebrio molitor)を用いてEPFの発生についても調査された。合計51のEPF株(41の メタリシウム 属および10 種のボーベリア 属)を524の土壌サンプルから単離した。すべての真菌株は、耕作地または草原のいずれかから単離された。比較のために選択された24サンプルのうち、91.7%が ガレリア 餌を用いたEPFに対して陽性であり、62.5%が テネブリオ 餌を用いて、および41.7%がCTCを用いて陽性であった。我々の結果は、昆虫餌を使用して土壌からEPFを単離することが、CTC培地を使用するよりも効率的であることを示唆した。EPFの同定と保全に加えて、分離方法の比較は、生物多様性に関する知識にプラスの影響を与えます。EPFコレクションの改善は、科学の発展と技術革新を支援します。
Introduction
土壌は、昆虫病原性真菌(EPF)を含むいくつかの微生物の供給源である。真菌のこの特定のグループは、節足動物宿主、特に昆虫1をコロニー形成し、しばしば殺す能力によって認識される。単離、特性評価、毒性株の選択、および登録後、EPFは節足動物 - 害虫防除のために大量生産され、その経済的関連性を支持する2。したがって、EPFの単離は、バイオ殺有害生物剤の開発への第一歩と考えられている。ボーベリア属(Hypocreales:Cordycipitaceae)およびMetarhizium spp.(Hypocreales:Clavicipitaceae)は、節足動物 - 害虫防除に使用される最も一般的な真菌である3。EPFは、土壌、目に見える真菌症を有する節足動物、コロニー形成植物、および植物根圏4,5から首尾よく単離されている。
EPFの単離は、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのにも有用であり得る。最近の文献は、EPFの使用が過小評価されていると報告し、植物の成長を改善する能力4、土壌から有毒な汚染物質を除去する能力、および薬6に使用されるEPFのいくつかの非従来型用途を引用している。本研究は、昆虫餌を用いた土壌からのEPFの単離効率を人工培養培地7、8、9と比較することを目的とする。Galleria mellonella L.(鱗翅目:Phyralidae)を昆虫の餌として使用することは、EPF単離の文脈でよく受け入れられている。これらの幼虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための実験モデルとして、科学界によって世界中で使用されている10,11。Tenebrio molitor L. (鞘翅目:Tenebrionidae)幼虫は、この昆虫が低コストで実験室でまれにしやすいため、毒性を伴う研究およびEPFの単離のための別の昆虫モデルと考えられている7,12。
様々なPCR技術を用いるなどの培養に依存しない方法を適用して、土壌13、14を含むそれらの基質上のEPFを検出および定量することができる。それにもかかわらず、これらの真菌コロニーを適切に単離するためには、それらの基質を選択的人工培地9上で培養するか、または試料中に存在する真菌を感受性昆虫15を用いて餌付けすることができる。一方、CTCは、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天からなるドジンフリーの人工培地である。この培地はフェルナンデスらによって開発された。9は土壌からの天然に存在するボーベリア属およびメタリジウム属菌の回収率を最大化する。一方、G. mellonellaおよびT. molitor幼虫は、土壌からEPF分離株を得るための餌として首尾よく使用することもできる。それにもかかわらず、Sharma et al.15によると、これら2つの餌昆虫の併用と比較を報告した研究は少なかった。ポルトガルのブドウ畑の土壌は、メタリシウム・ロベルツィイ(Metscn)の大幅な回復を示した。ソロキンはTを用いた。 G.メロネラ幼虫と比較したモリター幼虫;対照的に、ボーヴェリア・バッシアナ(バルス・クライブ)ヴュイル単離は、G.メロネラ餌15の使用と関連していた。したがって、どのEPF単離方法(すなわち、G. mellonella-bait、T. molitor-baitまたはCTC培地)を使用するかの決定は、研究の目標および実験室インフラストラクチャに従って考慮されるべきである。本研究の目的は、土壌サンプルからEPFを単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究がブラジルの遺伝遺産にアクセスしたため、この研究は、AA47CB6コードの下で、遺伝遺産および関連伝統的知識の管理のための国家システム(Sisgen)に登録されました。
1. 土壌サンプリング
- 小さなシャベルを使用して、800gの土壌(二次植物の根の有無にかかわらず)を10cmの深さまで集める。実験開始まで室温でポリプロピレン製袋に保管してください。
注:EPFが根圏能力を有すると報告されているため、小さな根も採取することができる。サンプルの処理が速いほど、真菌の胞子は時間の経過とともに生存率が低くなる可能性があるため、より良いです。本研究では、サンプルは、収集後7日以内に分析された。 - GPS を使用して、収集されたサンプルの位置を緯度と経度で識別し、土壌の種類 (草原、原生の熱帯雨林、湖畔、耕作地など) に従って収集された領域を分類します。
2. 昆虫病原性真菌の単離方法
- CTC選択的人工培地を用いた単離。
- CTC培地[ジャガイモデキストロース寒天に酵母エキス(PDAY)を加えたものにクロラムフェニコール0.5g/L、チアベンダゾール0.001g/L、シクロヘキシイミド0.25g/Lを添加]を調製するには、すべての試薬を個別に計量し、蒸留水で混合し、培地をオートクレーブで滅菌する。バイオセーフティキャビネットに、培地23mLを60mm×15mmのペトリプレートにプレートする。
注意: CTC 試薬の重量を量るときは、シクロヘキシミドとクロラムフェニコールは有毒であるため、白衣、マスク、手袋、ゴーグルを使用してください。 - 各土壌サンプルの重量0.35±0.05g(根の有無にかかわらず)を計量し、1.5mLのマイクロチューブに入れます。
- バイオセーフティキャビネットに、滅菌0.01%(vol/vol)ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液1mLを土壌および渦を含むマイクロチューブに30秒間加える。
- 50 μLの上清を除去し、CTC培地でペトリプレートの中央にピペットでピペットします。滅菌ドリガルスキヘラ(直径6mm)を用いて懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。
注: 土壌サンプルごとに少なくとも 3 回の反復を準備する必要があります。 - プレートを気候室(25±1°C、相対湿度≥80%)で暗所でインキュベートし、7、14、および21日間のインキュベーション後の真菌コロニーの成長を観察した。
- EPFを求める真菌コロニーのマクロ形態およびミクロ形態を観察する。純粋な培養物が得られるまで、EPF培養物を0.05%クロラムフェニコール(PDAC)を加えたジャガイモデキストロース寒天培地に移す。
注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。
- CTC培地[ジャガイモデキストロース寒天に酵母エキス(PDAY)を加えたものにクロラムフェニコール0.5g/L、チアベンダゾール0.001g/L、シクロヘキシイミド0.25g/Lを添加]を調製するには、すべての試薬を個別に計量し、蒸留水で混合し、培地をオートクレーブで滅菌する。バイオセーフティキャビネットに、培地23mLを60mm×15mmのペトリプレートにプレートする。
- 昆虫餌を用いた隔離
- 表面消毒されたG. メロネラ および T.モリター 後期幼虫を使用する。幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。滅菌水を使用して幼虫を2回洗浄する。
注:第4段階からの G.メロネラ 幼虫を本研究に使用した。 T.モリター 幼虫期は標準化されなかった。 - 餌を組み立てるためにプラスチック製の鍋を使用してください。集めた土250gを各プラスチックポットに加えます(幅98mm×高さ47mm×長さ142mm)。各種の15匹の幼虫(T.モリトール と G.メロネラ)を分離し、プラスチックポットあたり5匹の幼虫を堆積させる。ポットを25±1°C、相対湿度≥80%の暗所に保管してください。
メモ: ポットの蓋に 10 個の小さな穴 (直径 2 mm) をあけて、換気できるようにします。鋭利な加熱された鉄の装置を使用して穴をあけることができます。 - 幼虫と土壌との最大の接触を可能にするために、1日おきに土壌を均質化する。
注:水分は幼虫の真菌感染をサポートするために重要です。土壌中の水分を維持するために、必要に応じて土壌表面に滅菌蒸留水を噴霧する。土壌サンプルを水に浸さないでください。 - 死んだ昆虫を求めて毎日鍋を分析してください。
注:昆虫が感染していないことを確認するために、無脊椎動物の病理学的徴候についてコロニー内の残りの幼虫を毎日観察してください。別の方法として、昆虫の幼虫の健康状態をチェックするために、滅菌土壌を有する対照ポットを研究に含めることができる。 - 死んだ昆虫を取り除き、表面的には0.5%次亜塩素酸ナトリウムで1分間殺菌する。昆虫病原性真菌(真菌症)の外在化を促進するために、滅菌昆虫を25≥1°Cで湿ったチャンバー(相対湿度±80%)に7日間置く。
- 真菌症の際には、昆虫の表面から分生子を収穫する。微生物学的ループを使用して、実体顕微鏡下でPDAC培地上に分生子を配置する。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。培養プレートを25±1°Cおよび相対湿度80%の気候チャンバー≥インキュベートする。
- プレート上の真菌コロニーのマクロ形態および微形態を観察し、EPFの同一性を確認する。純粋な真菌コロニーが得られるまでPDAC上で培養を繰り返す。
注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。
- 表面消毒されたG. メロネラ および T.モリター 後期幼虫を使用する。幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。滅菌水を使用して幼虫を2回洗浄する。
3. EPF(メタリシウム 属および ボーベリア 属)の同定
- プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特性(すなわち、コロニーの表面および逆、それらの形状、縁、増殖速度、色、質感、拡散性色素、滲出液、および空中分生子)を、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で14日後に分析する。
- 空中分生子をスライド培養(マイクロカルチャー技術)16に移し、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で3日間、ラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴(すなわち、分生子の配置、分生子、分生子の形状、およびサイズ)17、18、19、20を観察した。
- 光学顕微鏡を用いて顕微鏡で微視的な真菌構造を観察し、EPF同定を確認した。
注:EPFの形態学的鍵は、Bischoffら、Rehnerら、Seifertら、およびHumber17,18,19,20による報告に記載されている。真菌コロニーのマクロおよびミクロ形態は、属レベルで糸状真菌を同定するために使用される最も頻繁な基準である。EPFの属に応じて、これらの形態学的特徴は変化するであろう。ハンバー20は、真菌性昆虫病原体の主要属への同定鍵を提示する。メタリシウム属コロニーは、例えば、通常、円形であり、粉末状であり、緑色の様々な色合いを呈し、かつ滲出液を提示することができる。微視的には、これらのコロニーは、広枝状の分生子上に頂端の分生子細胞を有し、密集した絡み合った分生子がコンパクトなハイメニウムを形成し、円筒形から楕円体状の分生子を平行な鎖状にして柱または板状の塊を形成する。ボーベリア属のコロニーは、通常、白色、粉末状、または綿状である。それらは、ジグザグ方向に頂端的に延びる拡張基底部分を有する分生細胞を示す。ボーベリア分生子は、地球形の分生子の密集したクラスターを形成する。種レベルでのEPFの同定には分子分析が必要です。 - 分離株の分子解析を行い、種レベルで分類学的同定を行う。本研究で単離されたEPF株、すなわちメタリジウム属およびボーベリア属について、Bischoff et al.17およびRehner et al.18の報告に基づいて分子解析を行う。
- 分離株がEPFであることを確認した後、分離株を真菌培養物の集合体に寄託する。本研究では、分離株は、リオデジャネイロ連邦農村大学の微生物制御研究所(LCM)からの昆虫病原性真菌培養コレクションに寄託された。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ブラジルのリオデジャネイロ州で、2015年から2018年の間に、家畜牧草地(165サンプル)、原生熱帯林(90サンプル)、湖畔(42サンプル)、耕作地/耕作地(227サンプル)の合計524の土壌サンプルが草原から収集されました。EPF陽性のサンプルの地理座標の詳細は、 補足表1に示されている。
524の土壌サンプルのうち、500サンプルをCTC培地のみを用いて分析し、24サンプルを3つの形態の単離(ガレリア餌、 テネブリオ餌、および選択的CTC培地)を用いて同時に分析したので、これらの方法の相対効率を評価することができた。合計51のEPF株を524のサンプル(41の メタリジウム 属および10 個のボーベリア 属)から単離した。(図1)。いくつかの分離株のミクロ形態学的特徴を 図2に示す。全ての真菌株を草原または耕作地から単離した(補足表1)。その結果、 メタリシウム 属菌が ボーベリア 属菌よりも流行していることが明らかとなった(補足表1)。9つの メタリシウム 分離株(LCM S01〜LCM S09)を、ef1−a(真核生物翻訳伸長因子1−α)遺伝子21を用いて分子同定した。これらのうち、7つの分離株(LCM S01-LCM S06およびLCM S08)がメタリ ジウム・アニソプリアエ ・センス・ストリクトーとして同定され、2つの分離株(LCM S07およびLCM S09)が メタリジウム・ピンシェンセ21として同定された。
3つの異なる単離方法を用いて研究した24の土壌サンプルにおけるEPF(陽性EPFサンプルの%)の発生を 表1に示す。EPFの回収率はカイ二乗検定により分析した。 表1に示すように、 ガレリアベイトは 、EPF(陽性サンプルの91.7%(22/24))に続いて T.モリターベイト (EPF陽性サンプルの62.5%(15/24))およびCTC培地(EPF陽性サンプルの41.7%(14/24))の単離においてより効率的であることが証明された。これら24の土壌サンプルは、 ボーベリア 属の回収を示さず、 メタリシウムのみを示した。
図1:土壌サンプルから単離された株の昆虫病原性真菌コロニー。 コロニーはCTC人工培地上で培養した。(1)純粋培養物が得られる前にCTC選択培地上での培養から14日後の土壌試料から真菌コロニーを示すペトリプレート;(2-42)純粋な メタリシウム 属コロニー;(43-52) ピュア・ ボーベリア 属のコロニー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:土壌サンプルから分離された昆虫病原性真菌の微形態学的特徴。コロニーをジャガイモデキストロース寒天培地上で25±1°C、相対湿度≥80%で3日間インキュベートした。顕微鏡スライドをラクトフェノールブルー溶液で染色した。画像は、(A)メタリジウム・アニソプリアエ・センス・ストリント(s.s)単離LCM S01の分生子および分生子を示す。(b)メタリジウム・アニソプリアエs.s.を単離しLCM S03;(c)メタリシウム・エスピー・LCM S27を単離する工程;(D-F)ボーベリア属は、それぞれLCM S23、LCM S24、およびLCM S20を単離する。ここに表わされる全ての菌株は、CTC培地を用いて単離した。LCM S27はまた、昆虫餌を用いて土壌から回収された。*分生子と分生子。** 分生鎖は、隣接する鎖におけるメタリジウム胞子の特徴的な横並び配置を示す。黒い矢印は、円筒形から楕円体状の分生子に中根座を示す。赤い矢印はボーベリアの地球形の分生子を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 単離方法 | 昆虫病原性真菌* | χ2** | |
| ＋ | － | ||
| ガレリア餌 | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| テネブリオ餌 | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC選択培地 | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * メタリシウム 属菌のみが単離された | |||
| ** カイ二乗分析、DF2。 P = 0.0013 | |||
表1:異なる単離方法を用いた24の土壌サンプルにおける昆虫病原性真菌の発生(陽性サンプルの%)。
補足表1:昆虫病原性真菌に陽性のサンプルの地理的座標、単離方法、コード、収集年、および土地利用タイプ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
自然土壌と農業土壌の生息地は、EPF22の典型的な環境であり、優れた自然の貯水池です。本研究では、昆虫餌対選択的培地を用いたEPF単離の2つの方法が取り組まれた。単離のための最初のステップは、土壌サンプルの収集である。土壌サンプルの適切な保管と同定は非常に重要です。緯度、経度、土壌タイプ、バイオームに関する情報は、疫学的、モデリング的、および地理空間的主題を含む研究に不可欠である23,24。収集後、これらの土壌サンプル中の分生子の生存率は最終的に低下する可能性があるため、サンプルをできるだけ早く(好ましくは7日以内に)処理することが推奨される。CTCを用いたEPF単離における重要なステップには、a)インキュベーション後1および2週間のCTCプレートの調査(後の段階で他の真菌コロニーがEPFの発生を狭める可能性があるため、最初の数週間が重要である)、およびb)マクロ形態および微形態に基づいてEPFコロニーを正確に同定することが含まれる。昆虫の餌を使用して隔離するには、土壌サンプルを湿気に保つことが不可欠ですが、水に浸さないでください。
いくつかの研究によって報告された結果は、M. anisopliaeが自然生態系よりも耕作土壌においてより一般的であるという解釈につながった8,25,26。これらの真菌の分布および発生に違いが生じ得る。本研究では、すべての菌株を耕作土壌(作物)または草原から単離し、ボーベリア属よりもメタリシウム属菌が優勢であった。栽培慣行および有機物の高含有量は、土壌中の腐生菌の存在を支持することが示唆される27。したがって、EPFを求める効果的な単離技術は、真菌汚染物質の減少を検討すべきである。
選択的人工培地は、使いやすく、昆虫病原性真菌、主にメタリシウム属およびボーベリア属細菌の単離に効率的であることが証明されているため、単離に一般的に使用されている28。これらの選択的媒体は、汚染物質の成長を低減するために特定の化学物質を使用する。1980年代と1990年代には、殺菌剤ドジンはメタリシウム属およびボーベリア属菌29,30を単離するために広く使用される選択培地となった。これらの人工培地は有効であるが、メタリジウム・アクリダムなどのいくつかのEPF種はドジン31の影響を受けやすい可能性がある。そのため、本研究ではドージンフリーCTC培地が選択された。Fernandes et al.9によると、CTCは、M. acridumを含む天然に存在する昆虫病原性真菌の単離を最大化するために開発された。EPFの単離において昆虫餌ではなく選択培地を使用することは、前者がサンプル処理においてより少ないスペースを必要とするので便利である。CTC使用における主な欠点は、その成分の一部(すなわち、シクロヘキシミドおよびクロラムフェニコール)が有毒であるという事実に依存するので、個人用保護具の使用は必須である。
本研究で観察されるように、EPF 15、32、33、34、35の単離のための人工選択的培地と比較して、昆虫餌を有する陽性サンプルの割合が高いことが報告されている。昆虫餌の使用は、新しいEPFの探索において低コストで高効率の代替手段と考えられている。それにもかかわらず、選択的媒体に対する昆虫餌の使用に関連する欠点がある。昆虫を使用して分析する土壌の量が多いため、サンプルを保管し、ポットをインキュベートするための物理的なスペースを増やすことも必要です。昆虫の獲得も制限になる可能性があります。例えばブラジルでは、G. mellonellaは市販されていないので、この昆虫を餌として使用するには実験室にコロニーを確立する必要があります。EPFによる自然感染を避けて、昆虫のコロニーのサルブリティを維持することが不可欠です。コロニー内でのEPF感染は、単離結果を信頼できないものにする可能性があります。したがって、無脊椎動物の病理学的徴候を求めてコロニー内の残りの幼虫を観察しなければならない。別の方法として、昆虫の幼虫の健康状態をチェックするために、滅菌土壌を有する対照ポットを研究に含めることができる。
優れた生物防除形質を有する新しい真菌分離株を求めることは、節足動物 - 害虫防除における真菌の有効性を高めるために極めて重要である。土壌から単離された真菌は、この環境22での生育に良好に適合することができ、そしてそれらは、高い圃場持続性を有する可能性が高く、これは、有害生物防除21において成功したEPFの本質的な特徴である。したがって、局所的に単離されたEPFは、その地理的および時間的合同のために局所害虫の生物学的防除を改善し、成功の可能性を高め、合成殺虫剤の適用によって引き起こされる環境への影響を低減することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、ブラジルのCoordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)、財務コード001、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)(プロジェクト番号E-26/010.001993/2015)、ブラジルのConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
