Summary
Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).
Abstract
El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus medio selectivo artificial para aislar hongos entomopatógenos (EPF) de muestras de suelo. El suelo es un hábitat rico en microorganismos, incluyendo EPF particularmente perteneciente a los géneros Metarhizium y Beauveria, que pueden regular las plagas de artrópodos. Los productos biológicos a base de hongos están disponibles en el mercado principalmente para el control de plagas de artrópodos agrícolas. Sin embargo, a pesar de la alta biodiversidad endémica, solo unas pocas cepas se utilizan en bioproductos comerciales en todo el mundo. En el presente estudio, se cultivaron 524 muestras de suelo en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC). El crecimiento de colonias de hongos se observó durante 3 semanas. Todos los Metarhizium y Beauveria EPF fueron identificados morfológicamente a nivel de género. Además, algunos aislamientos fueron identificados molecularmente a nivel de especie. Veinticuatro de estas 524 muestras de suelo también fueron estudiadas para detectar la aparición de EPF utilizando el método de cebo para insectos (Galleria mellonella y Tenebrio molitor). Se aislaron un total de 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. y 10 Beauveria spp.) de las 524 muestras de suelo. Todas las cepas de hongos se aislaron de tierras de cultivo o pastizales. De las 24 muestras seleccionadas para la comparación, el 91,7% fueron positivas para EPF con cebo Galleria , el 62,5% con cebo Tenebrio y el 41,7% con CTC. Nuestros resultados sugirieron que el uso de cebos de insectos para aislar el EPF del suelo es más eficiente que el uso del medio CTC. La comparación de métodos de aislamiento además de la identificación y conservación de EPF tiene un impacto positivo en el conocimiento sobre la biodiversidad. La mejora de la colección EPF apoya el desarrollo científico y la innovación tecnológica.
Introduction
El suelo es la fuente de varios microorganismos, incluidos los hongos entomopatógenos (EPF). Este grupo particular de hongos es reconocido por su capacidad para colonizar y a menudo matar a los huéspedes artrópodos, especialmente a los insectos1. Después del aislamiento, la caracterización, la selección de cepas virulentas y el registro, los EPF se producen en masa para el control de plagas de artrópodos, lo que respalda su relevancia económica2. En consecuencia, el aislamiento de EPF se considera el primer paso para el desarrollo de un bioplaguicida. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) y Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) son los hongos más comunes utilizados para el control de plagas de artrópodos3. Los EPF se han aislado con éxito del suelo, artrópodos con micosis visible, plantas colonizadas y rizosfera vegetal 4,5.
El aislamiento de EPF también puede ser útil para estudiar la diversidad, distribución y ecología de este grupo en particular. La literatura reciente informó que el uso de EPF está subestimado, citando varias aplicaciones no convencionales de EPF, como su capacidad para mejorar el crecimiento de las plantas4, para eliminar contaminantes tóxicos del suelo y para ser utilizado en medicina6. El presente estudio tiene como objetivo comparar la eficiencia de aislar EPF del suelo utilizando cebos para insectos versus medio de cultivo artificial 7,8,9. El uso de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como cebo para insectos en el contexto del aislamiento de EPF ha sido bien aceptado. Estas larvas son utilizadas en todo el mundo por la comunidad científica como modelo experimental para estudiar las interacciones huésped-patógeno10,11. La larva de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) se considera otro modelo de insecto para estudios que involucran virulencia y para el aislamiento de EPF ya que este insecto es fácil de rarar en el laboratorio a un bajo costo 7,12.
Se pueden aplicar métodos independientes del cultivo, como el uso de una variedad de técnicas de PCR, para detectar y cuantificar EPF en sus sustratos, incluido el suelo13,14. Sin embargo, para aislar adecuadamente estas colonias de hongos, su sustrato debe cultivarse en un medio artificial selectivo9, o los hongos presentes en las muestras pueden ser cebados utilizando insectos sensibles15. Por un lado, CTC es un medio artificial libre de dodina que consiste en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida. Este medio fue desarrollado por Fernandes et al. 9 para maximizar la recuperación de Beauveria spp. y Metarhizium spp. naturales del suelo. Por otro lado, las larvas de G. mellonella y T. molitor también pueden utilizarse con éxito como cebos para obtener aislados de EPF del suelo. Sin embargo, según Sharma et al.15, menos estudios reportaron el uso concomitante y la comparación de estos dos insectos de cebo. Los suelos de los viñedos portugueses exhibieron recuperaciones significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas de molitor en comparación con larvas de G. mellonella; en contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) El aislamiento de Vuill se relacionó con el uso de cebos de G. mellonella 15. Por lo tanto, la decisión sobre qué método de aislamiento de EPF utilizar (es decir, G. mellonella-bait, T. molitor-bait o CTC medium) debe considerarse de acuerdo con el objetivo del estudio y la infraestructura del laboratorio. El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus el medio selectivo artificial para aislar EPF de muestras de suelo.
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Protocol
Como el presente estudio accedió al patrimonio genético brasileño, la investigación fue registrada en el Sistema Nacional de Gestión del Patrimonio Genético y los Conocimientos Tradicionales Asociados (Sisgen) bajo el código AA47CB6.
1. Muestreo de suelos
- Recolecte 800 g de tierra (con o sin raíces secundarias de plantas incidentes) a una profundidad de 10 cm con una pala pequeña. Guárdelos en bolsas de polipropileno a temperatura ambiente hasta el inicio del experimento.
NOTA: También se pueden recolectar raíces pequeñas ya que se informa que EPF tiene competencia de rizosfera. Cuanto más rápido sea el procesamiento de las muestras, mejor porque las esporas de hongos pueden ser menos viables con el tiempo. En el presente estudio, las muestras se analizaron no más de 7 días después de la recolección. - Utilice un GPS para identificar la ubicación de las muestras recolectadas en latitud y longitud y clasificar el área recolectada según el tipo de suelo (por ejemplo, pastizales, selva tropical nativa, orillas de lagos o tierras de cultivo).
2. Métodos de aislamiento para hongos entomopatógenos
- Aislamiento mediante medio artificial selectivo CTC.
- Para preparar el medio CTC [agar de dextrosa de papa más extracto de levadura (PDAY) suplementado con 0.5 g / L de cloranfenicol, 0.001 g / L de tiabendazol y 0.25 g / L de cicloheximida9], pese todos los reactivos individualmente, mézclelos en agua destilada y esterilice el medio en autoclave. En un gabinete de bioseguridad, placa 23 ml del medio en placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
PRECAUCIÓN: Al pesar los reactivos de CTC, use una bata de laboratorio, máscara, guantes y gafas porque la cicloheximida y el cloranfenicol son tóxicos. - Pesar 0,35 ± 0,05 g de cada muestra de suelo (con o sin raíces) y colocarla en un microtubo de 1,5 ml.
- En un gabinete de bioseguridad, agregue 1 ml de suspensión acuosa estéril de polioxietileno sorbitano monooleato al 0,01% (vol/vol) al microtubo que contiene el suelo y el vórtice durante 30 s.
- Retire 50 μL del sobrenadante y pipetearlo en el centro de las placas de Petri con medio CTC. Disperse homogéneamente las suspensiones sobre la superficie del medio utilizando una espátula estéril de Drigalski (6 mm de diámetro).
NOTA: Se deben preparar al menos tres réplicas para cada muestra de suelo. - Incubar las placas en cámaras climáticas (25 ± 1 °C, humedad relativa ≥80%) en la oscuridad y observar el crecimiento de colonias de hongos después de 7, 14 y 21 días de incubación.
- Observar la macromorfología y micromorfología de las colonias fúngicas que buscan EPF. Transfiera los cultivos de EPF al medio de agar dextrosa de papa más cloranfenicol al 0,05% (PDAC) hasta obtener cultivos puros.
NOTA: Utilice las claves de descripción que se presentan a continuación en el paso 3 para la identificación de colonias de EPF.
- Para preparar el medio CTC [agar de dextrosa de papa más extracto de levadura (PDAY) suplementado con 0.5 g / L de cloranfenicol, 0.001 g / L de tiabendazol y 0.25 g / L de cicloheximida9], pese todos los reactivos individualmente, mézclelos en agua destilada y esterilice el medio en autoclave. En un gabinete de bioseguridad, placa 23 ml del medio en placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
- Aislamiento mediante cebos para insectos
- Use larvas de etapa tardía de G. mellonella y T. molitor desinfectadas en superficie. Sumergir las larvas en hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min para la esterilización. Lave las larvas dos veces con agua estéril.
NOTA: En el presente estudio se utilizaron larvas de G. mellonella de la cuarta etapa. Los estadios larvales de T. molitor no se estandarizaron. - Use macetas de plástico para ensamblar los cebos. Agregue 250 g de tierra recolectada a cada maceta de plástico (98 mm de ancho x 47 mm de alto x 142 mm de largo). Separar 15 larvas de cada especie (T. molitor y G. mellonella) y depositar cinco larvas por maceta de plástico. Guarde las macetas a 25 ± 1 °C y la humedad relativa ≥ 80% en la oscuridad.
NOTA: Perfore 10 orificios pequeños (2 mm de diámetro) en las tapas de la olla para permitir la ventilación. Se puede usar un dispositivo de hierro calentado afilado para perforar los agujeros. - Homogeneizar el suelo cada dos días para permitir el máximo contacto de las larvas con el suelo.
NOTA: La humedad es importante para apoyar la infección por hongos de las larvas. Para mantener la humedad en el suelo, rocíe agua destilada estéril en la superficie del suelo siempre que sea necesario. No remoje la muestra de suelo en agua. - Analiza las macetas diariamente buscando insectos muertos.
NOTA: Observe las larvas restantes en la colonia diariamente para detectar signos patológicos de invertebrados para asegurarse de que los insectos no estén infectados. Como alternativa, se pueden incluir en el estudio macetas de control con suelo estéril para verificar el estado de salud de las larvas de insectos. - Retire los insectos muertos y esterilícelos superficialmente con hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min. Colocar los insectos estériles en una cámara húmeda (humedad relativa ≥ 80%) a 25 ± 1 °C durante 7 días para favorecer la exteriorización de hongos entomopatógenos (micosis).
- Tras la micosis, cosecha los conidios de la superficie del insecto. Utilice un bucle microbiológico para colocar los conidios en el medio PDAC bajo un microscopio estereoscópico. Como alternativa, coloque las larvas infectadas enteras en el medio PDAC. Incubar las placas de cultivo en una cámara climática a 25 ± 1 °C y la humedad relativa ≥ 80%.
- Observe la macromorfología y micromorfología de las colonias de hongos en las placas para confirmar la identidad de EPF. Repita el cultivo en PDAC hasta que se obtengan colonias de hongos puros.
NOTA: Utilice las claves de descripción que se presentan a continuación en el paso 3 para la identificación de colonias de EPF.
- Use larvas de etapa tardía de G. mellonella y T. molitor desinfectadas en superficie. Sumergir las larvas en hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min para la esterilización. Lave las larvas dos veces con agua estéril.
3. Identificación de EPF (Metarhizium spp. y Beauveria spp.)
- Analizar las características macromorfológicas de los cultivos fúngicos en las placas (es decir, superficie y reverso de colonias, su forma, borde, tasa de crecimiento, color, textura, pigmento difusible, exudados y conidios aéreos) después de 14 días a 25 ± 1 ° C y humedad relativa ≥ 80%.
- Transferir los conidios aéreos a cultivos deslizantes (técnica de microcultivo)16 durante 3 días a 25 ± 1 °C y humedad relativa ≥ 80% y teñir con azul lactofenol para observar las características microscópicas (es decir, disposición de conidios, conidióforos, forma y tamaño de los conidiomas)17,18,19,20.
- Observe las estructuras fúngicas microscópicas a 400x utilizando un microscopio óptico para confirmar la identificación de EPF.
NOTA: Las claves morfológicas para EPF se describen en los informes de Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. y Humber 17,18,19,20. La macro y micromorfología de las colonias de hongos son los criterios más frecuentes utilizados para identificar hongos filamentosos a nivel de género. Dependiendo del género del EPF, estas características morfológicas cambiarán. Humber20 presenta una clave de identificación para los principales géneros de entomopatógenos fúngicos. Las colonias de Metarhizium spp., por ejemplo, suelen ser circulares, polvorientas, exhiben diferentes tonos de verde y pueden presentar exudado. Microscópicamente, estas colonias tienen células conidiogenas apicales en conidióforos ampliamente ramificados y densamente entrelazados que forman un himenio compacto, y conidios cilíndricos a elipsoides en cadenas paralelas que forman columnas o masas en forma de placa. Las colonias de Beauveria spp. suelen ser blancas, polvorientas o similares al algodón. Exhiben células conidiogenas con una porción basal dilatada que se extiende apicalmente en dirección zigzagueante. Los conidióforos de Beauveria forman densos grupos de conidios en forma de globo. Los análisis moleculares son necesarios para la identificación de EPF a nivel de especie. - Realizar análisis moleculares en los aislados para la identificación taxonómica a nivel de especie. Para las cepas de EPF aisladas en este estudio, a saber, Metarhizium spp. y Beauveria spp., realizar análisis moleculares basados en los informes de Bischoff et al.17 y Rehner et al.18.
- Después de confirmar que los aislados son EPF, deposite los aislados en una colección de cultivos de hongos. En el presente estudio, los aislados fueron depositados en la colección de cultivos fúngicos entomopatógenos del Laboratorio de Control Microbiano (LCM) de la Universidad Federal Rural de Río de Janeiro.
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Representative Results
Se recolectaron un total de 524 muestras de suelo de pastizales: pastos para ganado (165 muestras), bosque tropical nativo (90 muestras), junto al lago (42 muestras) y tierras cultivadas / de cultivo (227 muestras) entre 2015 y 2018 en el estado de Río de Janeiro, Brasil. Los detalles de las coordenadas geográficas de las muestras positivas para EPF se dan en la Tabla suplementaria 1.
De las 524 muestras de suelo, 500 muestras se analizaron solo utilizando medio CTC, y 24 muestras se analizaron concomitantemente utilizando tres formas de aislamiento (Galleria-bait, Tenebrio-bait y el medio de cultivo selectivo CTC), por lo que se pudo evaluar la eficiencia relativa de estos métodos. Se aislaron un total de 51 cepas de EPF de 524 muestras (41 Metarhizium spp. y 10 Beauveria spp.) (Figura 1). Las características micromorfológicas de algunos aislados se muestran en la Figura 2. Todas las cepas de hongos se aislaron de pastizales o tierras de cultivo (Tabla suplementaria 1). Los resultados revelaron que Metarhizium spp. es más prevalente que Beauveria spp. (Tabla suplementaria 1). Nueve de los aislados de Metarhizium (LCM S01 a LCM S09) se identificaron molecularmente utilizando el gen ef1-a (factor de elongación de traducción eucariota 1-alfa)21. De estos, siete aislados (LCM S01-LCM S06 y LCM S08) fueron identificados como Metarhizium anisopliae sensu stricto mientras que dos aislados (LCM S07 y LCM S09) fueron identificados como Metarhizium pingshaense21.
La ocurrencia de EPF (% de muestras positivas de EPF) en las 24 muestras de suelo estudiadas utilizando los tres métodos diferentes de aislamiento se muestra en la Tabla 1. Las tasas de recuperación de la EPF se analizaron mediante la prueba de chi cuadrado. Como se muestra en la Tabla 1, el cebo Galleria demostró ser más eficiente en el aislamiento de EPF (91,7% (22/24) de muestras positivas) seguido de cebo de T. molitor (62,5% (15/24) de muestras positivas de EPF) y medio CTC (41,7% (14/24) de muestras positivas de EPF). Estas 24 muestras de suelo no mostraron recuperación de Beauveria spp., sino sólo Metarhizium.
Figura 1: Colonias de hongos entomopatógenos de cepas aisladas de muestras de suelo. Las colonias se cultivaron en medio artificial CTC. (1) Placa de Petri que exhibe colonias de hongos de muestras de suelo 14 días después de la incubación en medio selectivo CTC antes de obtener cultivos puros; (2-42) Colonias puras de Metarhizium spp.; (43-52) Colonias puras de Beauveria spp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Características micromorfológicas de hongos entomopatógenos aislados de muestras de suelo. Las colonias se incubaron durante 3 días en agar dextrosa de patata a 25 ± 1 °C y la humedad relativa ≥ 80%. El portaobjetos del microscopio se tiñó con solución azul de lactofenol. Las imágenes muestran conidióforos y conidios de (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) aislado LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. aislado LCM S03; (C) Metarhizium sp. aislado LCM S27; (D-F) Beauveria spp. aísla LCM S23, LCM S24 y LCM S20, respectivamente. Todas las cepas representadas aquí se aislaron utilizando el medio CTC. LCM S27 también se recuperó del suelo utilizando cebos para insectos. * Conidióforos y conidios. ** Las cadenas conidiales muestran la ubicación característica lado a lado de las esporas de Metarhizium en cadenas adyacentes. Las flechas negras indican Conidios cilíndricos a elipsoides de Metarhizium. Las flechas rojas indican conidios en forma de globo de Beauveria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Método de aislamiento | Hongos entomopatógenos* | χ2** | |
| Positivo | Negativo | ||
| Galleria-cebo | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-cebo | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| Medio selectivo CTC | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Sólo Metarhizium spp. fueron aislados | |||
| ** Análisis chi-cuadrado, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabla 1: Ocurrencia de hongos entomopatógenos (% de muestras positivas) en 24 muestras de suelo utilizando diferentes métodos de aislamiento.
Tabla suplementaria 1: Coordenadas geográficas, método de aislamiento, código, año de recolección y tipos de uso de la tierra de muestras positivas para hongos entomopatógenos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Los hábitats naturales y agrícolas del suelo son ambientes típicos de EPF22 y un excelente reservorio natural. En el presente estudio, se abordaron dos métodos de aislamiento de EPF utilizando cebos de insectos versus medio selectivo. El primer paso para el aislamiento es la recolección de las muestras de suelo. El almacenamiento adecuado y la identificación de muestras de suelo son cruciales. La información sobre la latitud, longitud, tipo de suelo y bioma es esencial para los estudios que involucran temas epidemiológicos, de modelización y geoespaciales23,24. Después de la recolección, se recomienda que las muestras se procesen lo antes posible (preferiblemente dentro de los 7 días) porque la viabilidad de los conidios en estas muestras de suelo puede disminuir eventualmente. Los pasos críticos en el aislamiento de EPF utilizando CTC incluyen: a) la investigación de las placas de CTC 1 y 2 semanas después de la incubación (las primeras semanas son críticas porque, en etapas posteriores, otras colonias de hongos pueden reducir el desarrollo de EPF), y b) la identificación precisa de colonias de EPF en función de su macromorfología y micromorfología. Para el aislamiento con cebos de insectos, es esencial mantener la muestra de suelo húmeda pero no remojarla en agua.
Los resultados reportados por varios estudios han llevado a una interpretación de que M. anisopliae es más común en suelos cultivados que en ecosistemas naturales 8,25,26. Pueden ocurrir diferencias en la distribución y ocurrencia de estos hongos. En el presente estudio, todas las cepas se aislaron del suelo cultivado (cultivos) o de pastizales, y hubo un predominio de Metarhizium spp. sobre Beauveria spp. Se sugiere que las prácticas de cultivo y el alto contenido de materia orgánica favorecen la presencia de hongos saprófitos en el suelo27. En consecuencia, las técnicas de aislamiento efectivas que buscan EPF deben considerar la reducción de los contaminantes fúngicos.
Los medios artificiales selectivos se utilizan comúnmente para el aislamiento porque son fáciles de usar y han demostrado ser eficientes en el aislamiento de hongos entomopatógenos, principalmente Metarhizium spp. y Beauveria spp.28. Estos medios selectivos utilizan productos químicos específicos para reducir el crecimiento de contaminantes. En las décadas de 1980 y 1990, el fungicida dodina se convirtió en un medio selectivo ampliamente utilizado para aislar Metarhizium spp. y Beauveria spp.29,30. Aunque estos medios artificiales son efectivos, algunas especies de EPF como Metarhizium acridum pueden ser susceptibles a la dodina31. Es por eso que el medio CTC libre de dodina fue elegido en el presente estudio. Según Fernandes et al.9, ctC fue desarrollado para maximizar el aislamiento de hongos entomopatógenos naturales, incluyendo M. acridum. El uso de un medio selectivo en lugar de cebos de insectos en el aislamiento de EPF es conveniente porque el primero requiere menos espacio en el procesamiento de la muestra. La principal desventaja en el uso de CTC radica en el hecho de que algunos de sus componentes (es decir, cicloheximida y cloranfenicol) son tóxicos, por lo que el uso de equipos de protección personal es obligatorio.
Como se observó en el presente estudio, se ha reportado un mayor porcentaje de muestras positivas con cebos para insectos en comparación con medios selectivos artificiales para el aislamiento de EPF 15,32,33,34,35. El uso de cebos para insectos se considera una alternativa de bajo costo y alta eficiencia en la búsqueda de nuevos EPF. A pesar de esto, hay desventajas asociadas con el uso de cebos de insectos sobre medios selectivos. Como la cantidad de suelo a analizar utilizando insectos es mayor, también es necesario disponer de más espacio físico para almacenar las muestras e incubar las macetas. La adquisición de insectos también puede ser una limitación. En Brasil, por ejemplo, G. mellonella no está disponible comercialmente, por lo que es necesario establecer una colonia en el laboratorio para usar este insecto como cebo. Es fundamental mantener la salubridad de las colonias de insectos, evitando la infección natural por EPF. Una infección por EPF en la colonia puede hacer que los resultados del aislamiento no sean confiables. Por lo tanto, uno tiene que observar las larvas restantes en la colonia buscando signos patológicos de invertebrados. Como alternativa, se pueden incluir en el estudio macetas de control con suelo estéril para verificar el estado de salud de las larvas de insectos.
La búsqueda de nuevos aislados de hongos con rasgos de biocontrol sobresalientes es crucial para aumentar la efectividad de los hongos en el control de plagas de artrópodos. Los hongos aislados del suelo pueden estar bien adaptados para crecer en este entorno22, y es probable que tengan una alta persistencia en el campo, que es una característica esencial del EPF exitoso en el control de plagas21. En consecuencia, el EPF aislado localmente puede mejorar el control biológico de las plagas locales debido a su congruencia geográfica y temporal, aumentando las posibilidades de éxito y reduciendo los impactos ambientales causados por la aplicación de insecticidas sintéticos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado en parte por la Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) de Brasil, código financiero 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (número de proyecto E-26/010.001993/2015), y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) de Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
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