Summary
Entomopatogene svampekolonier isoleres fra tropiske jordprøver ved hjælp af Tenebrio agn, Galleria agn samt selektivt kunstigt medium, dvs. kartoffeldextrose agar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid (CTC medium).
Abstract
Målet med denne undersøgelse er at sammenligne effektiviteten af at bruge insektlokkemad versus kunstigt selektivt medium til isolering af entomopatogene svampe (EPF) fra jordprøver. Jorden er et rigt levested for mikroorganismer, herunder EPF, der især tilhører slægterne Metarhizium og Beauveria, som kan regulere leddyr skadedyr. Biologiske produkter baseret på svampe er tilgængelige på markedet hovedsagelig til bekæmpelse af leddyr i landbruget. På trods af den højendemiske biodiversitet anvendes kun få stammer i kommercielle bioprodukter over hele verden. I den foreliggende undersøgelse blev 524 jordprøver dyrket på kartoffeldextrose agar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid (CTC medium). Væksten af svampekolonier blev observeret i 3 uger. Alle Metarhizium og Beauveria EPF blev morfologisk identificeret på slægtsniveau. Derudover blev nogle isolater molekylært identificeret på artsniveau. Fireogtyve ud af disse 524 jordprøver blev også undersøgt for EPF-forekomst ved hjælp af insektagnmetoden (Galleria mellonella og Tenebrio molitor). I alt 51 EPF-stammer blev isoleret (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) fra de 524 jordprøver. Alle svampestammer blev isoleret enten fra dyrkede arealer eller græsarealer. Af de 24 prøver, der blev udvalgt til sammenligning, var 91,7% positive for EPF ved hjælp af Galleria agn, 62,5% ved hjælp af Tenebrio agn og 41,7% ved hjælp af CTC. Vores resultater antydede, at det er mere effektivt at bruge insektlokkemad til at isolere EPF fra jorden end at bruge CTC-mediet. Sammenligningen af isolationsmetoder ud over identifikationen og bevarelsen af EPF har en positiv indvirkning på viden om biodiversitet. Forbedringen af indsamlingen af EPF støtter videnskabelig udvikling og teknologisk innovation.
Introduction
Jord er kilden til flere mikroorganismer, herunder entomopatogene svampe (EPF). Denne særlige gruppe af svampe genkendes af deres evne til at kolonisere og ofte dræbe leddyrværter, især insekter1. Efter isolering, karakterisering, udvælgelse af virulente stammer og registrering masseproduceres EPF til leddyr-skadedyrsbekæmpelse, hvilket understøtter deres økonomiske relevans2. Følgelig betragtes isoleringen af EPF som det første skridt til udviklingen af et biopesticid. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) og Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) er de mest almindelige svampe, der anvendes til leddyr-skadedyrsbekæmpelse3. EPF er med succes blevet isoleret fra jord, leddyr med synlig mykose, koloniserede planter og plante rhizosfære 4,5.
Isolering af EPF kan også være nyttigt at studere mangfoldigheden, distributionen og økologien i denne særlige gruppe. Nyere litteratur rapporterede, at brugen af EPF er undervurderet, idet der henvises til flere ukonventionelle anvendelser af EPF, såsom deres evne til at forbedre plantevæksten4, fjerne giftige forurenende stoffer fra jorden og anvende dem i medicin6. Den foreliggende undersøgelse har til formål at sammenligne effektiviteten af isolering af EPF fra jord ved hjælp af insektlokkemad versus kunstigt kulturmedium 7,8,9. Brugen af Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insektagn i forbindelse med EPF-isolering er blevet godt accepteret. Disse larver bruges over hele verden af det videnskabelige samfund som en eksperimentel model til at studere værtspatogeninteraktioner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve betragtes som en anden insektmodel til undersøgelser, der involverer virulens og til isolering af EPF, da dette insekt er let at sjældent i laboratoriet til en lav pris 7,12.
Kulturuafhængige metoder såsom anvendelse af en række PCR-teknikker kan anvendes til at detektere og kvantificere EPF på deres substrater, herunder jord13,14. For at isolere disse svampekolonier korrekt skal deres substrat dog dyrkes på et selektivt kunstigt medium9, eller de svampe, der er til stede i prøverne, kan lokkes ved hjælp af følsomme insekter15. På den ene side er CTC et dodinfrit kunstigt medium, der består af kartoffeldextroseagar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid. Dette medium blev udviklet af Fernandes et al. 9 for at maksimere genopretningen af naturligt forekommende Beauveria spp. og Metarhizium spp. fra jorden. På den anden side kan G. mellonella og T. molitor larver også med succes anvendes som lokkemad for at opnå EPF-isolater fra jorden. Ikke desto mindre rapporterede færre undersøgelser ifølge Sharma et al.15 den samtidige brug og sammenligning af disse to agninsekter. Portugisiske vinmarker jord udviste betydelige genvindinger af Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin ved hjælp af T. molitor larver i sammenligning med G. mellonella larver; i modsætning hertil Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolation var forbundet med brugen af G. mellonella lokkemad15. Derfor bør beslutningen om, hvilken EPF-isolationsmetode der skal anvendes (dvs. G. mellonella-agn, T. molitor-agn eller CTC-medium), overvejes i henhold til undersøgelsens mål og laboratorieinfrastrukturen. Målet med denne undersøgelse er at sammenligne effektiviteten af at bruge insektlokkemad versus kunstigt selektivt medium til isolering af EPF fra jordprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Da den foreliggende undersøgelse fik adgang til brasiliansk genetisk arv, blev forskningen registreret på National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) under koden AA47CB6.
1. Prøveudtagning af jord
- Saml 800 g jord (med eller uden hændelse sekundære planterødder) til en dybde på 10 cm ved hjælp af en lille skovl. Opbevar dem i polypropylenposer ved stuetemperatur indtil eksperimentets start.
BEMÆRK: Små rødder kan også indsamles, da EPF rapporteres at have rhizosfærekompetence. Jo hurtigere behandlingen af prøverne er, desto bedre er det, fordi svampesporerne kan være mindre levedygtige over tid. I den foreliggende undersøgelse blev prøver analyseret højst 7 dage efter indsamlingen. - Brug en GPS til at identificere placeringen af de indsamlede prøver i breddegrad og længdegrad og klassificere det indsamlede område i henhold til jordtypen (for eksempel græsarealer, indfødt regnskov, søbredder eller dyrkede arealer).
2. Isoleringsmetoder for entomopatogene svampe
- Isolering ved hjælp af CTC selektivt kunstigt medium.
- For at fremstille CTC-mediet [kartoffeldextrose agar plus gærekstrakt (PDAY) suppleret med 0,5 g/l chloramphenicol, 0,001 g/l thiabendazol og 0,25 g/l cycloheximid9] vejes alle reagenserne individuelt, blandes i destilleret vand, og mediet steriliseres i autoklave. I et biosikkerhedsskab plade 23 ml af mediet i 60 mm x 15 mm Petri plader.
FORSIGTIG: Når du vejer CTC-reagenser, skal du bruge en laboratoriefrakke, maske, handsker og beskyttelsesbriller, fordi cyclohexamid og chloramphenicol er giftige. - Der vejes 0,35 ± 0,05 g af hver jordprøve (med eller uden rødder), og den anbringes i et mikrorør på 1,5 ml.
- I et biosikkerhedsskab tilsættes 1 ml steril 0,01 % (vol/vol) polyoxyethylensorrbitanmonooleat vandig suspension til mikrorøret, der indeholder jord og hvirvel i 30 sek.
- Fjern 50 μL af supernatanten og pipetter den på midten af Petri-plader med CTC-medium. Suspensionerne spredes homogent på overfladen af mediet ved hjælp af en steril Drigalski-spatel (6 mm i diameter).
BEMÆRK: Der skal udarbejdes mindst tre replikater for hver jordprøve. - Inkuber pladerne i klimakamre (25 ± 1 ° C, relativ luftfugtighed ≥80%) i mørket og observer væksten af svampekolonier efter 7, 14 og 21 dages inkubation.
- Overhold makromorfologien og mikromorfologien i svampekolonierne, der søger EPF. Overfør EPF-kulturerne til kartoffeldextrose agar medium plus 0,05% chloramphenicol (PDAC), indtil der opnås rene kulturer.
BEMÆRK: Brug beskrivelsestasterne nedenfor i trin 3 til identifikation af EPF-kolonier.
- For at fremstille CTC-mediet [kartoffeldextrose agar plus gærekstrakt (PDAY) suppleret med 0,5 g/l chloramphenicol, 0,001 g/l thiabendazol og 0,25 g/l cycloheximid9] vejes alle reagenserne individuelt, blandes i destilleret vand, og mediet steriliseres i autoklave. I et biosikkerhedsskab plade 23 ml af mediet i 60 mm x 15 mm Petri plader.
- Isolering ved hjælp af insekt lokkemad
- Brug overfladedesinficeret G. mellonella og T. molitor sen-stage larver. Sænk larverne i 0,5% natriumhypochlorit i 1 minut til sterilisering. Vask larverne to gange med sterilt vand.
BEMÆRK: G. mellonella larver fra fjerde fase blev anvendt i denne undersøgelse. T. molitor larve stadier blev ikke standardiseret. - Brug plastikpotter til at samle lokkemad. Tilsæt 250 g opsamlet jord til hver plastikpotte (98 mm bredde x 47 mm højde x 142 mm længde). Adskil 15 larver af hver art (T. molitor og G. mellonella) og aflejr fem larver pr. Plastikpotte. Opbevar gryderne ved 25 ± 1 °C, og den relative luftfugtighed ≥ 80% i mørke.
BEMÆRK: Bor 10 små huller (2 mm i diameter) i grydelågene for at muliggøre ventilation. En skarp opvarmet jernanordning kan bruges til at bore hullerne. - Homogeniser jorden hver anden dag for at tillade maksimal kontakt mellem larver og jord.
BEMÆRK: Fugt er vigtigt for at understøtte svampeinfektionen hos larver. For at opretholde fugt i jorden sprøjtes sterilt destilleret vand på jordoverfladen, når det er nødvendigt. Sug ikke jordprøven i vand. - Analyser potterne dagligt søger døde insekter.
BEMÆRK: Overhold de resterende larver i kolonien dagligt for hvirvelløse patologiske tegn for at sikre, at insekterne ikke er inficeret. Som et alternativ kan kontrolpotter med steril jord indgå i undersøgelsen for at kontrollere insektlarvernes sundhedsstatus. - Fjern døde insekter og steriliser dem overfladisk med 0,5% natriumhypochlorit i 1 min. Placer de sterile insekter i et fugtigt kammer (relativ luftfugtighed ≥ 80%) ved 25 ± 1 ° C i 7 dage for at favorisere eksteriørisering af entomopatogene svampe (mykose).
- Ved mykose høstes conidia fra insektoverfladen. Brug en mikrobiologisk sløjfe til at placere conidierne på PDAC-medium under et stereoskopisk mikroskop. Som et alternativ skal du placere hele de inficerede larver på PDAC-mediet. Inkuber kulturpladerne i et klimakammer ved 25 ± 1 °C, og den relative luftfugtighed ≥ 80 %.
- Overhold makromorfologien og mikromorfologien af svampekolonierne på pladerne for at bekræfte EPF's identitet. Gentag dyrkning på PDAC, indtil der opnås rene svampekolonier.
BEMÆRK: Brug beskrivelsestasterne nedenfor i trin 3 til identifikation af EPF-kolonier.
- Brug overfladedesinficeret G. mellonella og T. molitor sen-stage larver. Sænk larverne i 0,5% natriumhypochlorit i 1 minut til sterilisering. Vask larverne to gange med sterilt vand.
3. Identifikation af EPF (Metarhizium spp. og Beauveria spp.)
- Analyser de makromorfologiske egenskaber ved svampekulturerne på pladerne (dvs. overflade og omvendt af kolonier, deres form, kant, væksthastighed, farve, tekstur, diffusibelt pigment, ekssudater og luftkonidier) efter 14 dage ved 25 ± 1 ° C og relativ luftfugtighed ≥ 80%.
- Overfør luftkonidierne til diaskulturer (mikrokulturteknik)16 i 3 dage ved 25 ± 1 °C og relativ luftfugtighed ≥ 80% og plet med lactophenolblå for at observere de mikroskopiske træk (dvs. arrangement af conidier, conidiophores, form og størrelse af conidier)17,18,19,20.
- Overhold de mikroskopiske svampestrukturer ved 400x ved hjælp af et optisk mikroskop for at bekræfte EPF-identifikationen.
BEMÆRK: Morfologiske nøgler til EPF er beskrevet i rapporterne fra Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. og Humber 17,18,19,20. Makro- og mikromorfologien af svampekolonier er de hyppigste kriterier, der anvendes til at identificere trådformede svampe på slægtsniveau. Afhængigt af EPF's slægt vil disse morfologiske egenskaber ændre sig. Humber20 præsenterer en identifikationsnøgle til store slægter af svampeentomopatogener. Metarhizium spp. kolonier, for eksempel, er normalt cirkulære, pulverformige, udviser forskellige nuancer af grønt og kan præsentere ekssudat. Mikroskopisk har disse kolonier konidiogene celler apikale på bredt forgrenede, tæt sammenflettede conidiophorer, der danner et kompakt hymenium og cylindrisk til ellipsoid conidia i parallelle kæder, der danner søjler eller pladelignende masser. Beauveria spp. kolonier er normalt hvide, pulverformige eller bomuldslignende. De udviser konidiogene celler med en udvidet basal del, der strækker sig apikalt i zigzagretning. Beauveria conidiophores danner tætte klynger af globeformede conidier. Molekylære analyser er nødvendige for at identificere EPF på artsniveau. - Udføre molekylære analyser af isolaterne til taksonomisk identifikation på artsniveau. For epf-stammerne isoleret i denne undersøgelse, nemlig Metarhizium spp. og Beauveria spp., udføre molekylære analyser baseret på rapporterne fra Bischoff et al.17 og Rehner et al.18.
- Efter at have bekræftet, at isolaterne er EPF, deponeres isolaterne i en samling svampekulturer. I den foreliggende undersøgelse blev isolaterne deponeret i samlingen af entomopatogene svampekulturer fra Laboratory of Microbial Control (LCM) ved Federal Rural University of Rio de Janeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I alt 524 jordprøver blev indsamlet fra græsarealer: husdyrgræs (165 prøver), indfødt tropisk skov (90 prøver), sø (42 prøver) og dyrkede/dyrkede arealer (227 prøver) mellem 2015 og 2018 i delstaten Rio de Janeiro, Brasilien. Nærmere oplysninger om geografiske koordinater for prøver, der er positive for EPF, findes i supplerende tabel 1.
Af de 524 jordprøver blev 500 prøver kun analyseret ved hjælp af CTC-medium, og 24 prøver blev samtidig analyseret ved hjælp af tre former for isolering (Galleria-agn, Tenebrio-agn og det selektive CTC-kulturmedium), så den relative effektivitet af disse metoder kunne evalueres. I alt 51 EPF-stammer blev isoleret fra 524 prøver (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) (Figur 1). Mikromorfologiske egenskaber ved nogle isolater er vist i figur 2. Alle svampestammer blev isoleret fra græsarealer eller dyrkede arealer (supplerende tabel 1). Resultaterne afslørede, at Metarhizium spp. er mere udbredt end Beauveria spp. (Supplerende tabel 1). Ni af Metarhizium-isolaterne (LCM S01 til LCM S09) blev molekylært identificeret ved anvendelse af ef1-a-genet (eukaryot translationsforlængelsesfaktor 1-alfa)21. Af disse blev syv isolater (LCM S01-LCM S06 og LCM S08) identificeret som Metarhizium anisopliae sensu stricto, mens to isolater (LCM S07 og LCM S09) blev identificeret som Metarhizium pingshaense21.
Forekomsten af EPF (% af positive EPF-prøver) i de 24 jordprøver, der blev undersøgt ved hjælp af de tre forskellige isolationsmetoder, er vist i tabel 1. Genvindingshastigheder for EPF blev analyseret ved chi-kvadratisk test. Som vist i tabel 1 viste Galleria agn sig at være mere effektiv i isolationen af EPF (91,7 % (22/24) af positive prøver) efterfulgt af T. molitor agn (62,5 % (15/24) af EPF-positive prøver) og CTC-medium (41,7 % (14/24) af EPF-positive prøver). Disse 24 jordprøver viste ingen genopretning af Beauveria spp., Men kun Metarhizium.
Figur 1: Entomopatogene svampekolonier af stammer isoleret fra jordprøver. Kolonier blev dyrket på CTC kunstigt medium. (1) Petri-plader, der udviser svampekolonier fra jordprøver 14 dage efter inkubation på CTC-selektivt medium, før der opnås rene kulturer (2-42) Rene Metarhizium spp. kolonier; (43-52) Rene Beauveria spp. kolonier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikromorfologiske egenskaber ved entomopatogene svampe isoleret fra jordprøver. Kolonier blev inkuberet i 3 dage på kartoffeldextrose agar ved 25 ± 1 ° C og relativ luftfugtighed ≥ 80%. Mikroskopet dias blev farvet med lactophenol blå opløsning. Billeder viser conidiophores og conidia af (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolere LCM S01; B) Metarhizium anisopliae s.s. isolere LCM S03 C) Metarhizium sp. isolere LCM S27 (D-F) Beauveria spp. isolerer henholdsvis LCM S23, LCM S24 og LCM S20. Alle stammer, der er repræsenteret her, blev isoleret ved hjælp af CTC-mediet. LCM S27 blev også genvundet fra jord ved hjælp af insektlokkemad. * Conidiophores og conidia. ** Conidialkæder viser den karakteristiske side-om-side placering af Metarhizium sporer i tilstødende kæder. Sorte pile angiver Metarhizium cylindrisk til ellipsoid conidia. Røde pile angiver Beauveria globeformede conidier. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Metode til isolering | Entomopatogene svampe* | χ2** | |
| Positiv | Negativ | ||
| Galleria-agn | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-agn | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC selektivt medium | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Kun Metarhizium spp. blev isoleret | |||
| ** Chi-kvadratisk analyse, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabel 1: Forekomst af entomopatogene svampe (% af positive prøver) i 24 jordprøver ved hjælp af forskellige isolationsmetoder.
Supplerende tabel 1: Geografiske koordinater, isolationsmetode, kode, indsamlingsår og arealanvendelsestyper af prøver, der er positive for entomopatogene svampe. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Natur- og landbrugsjordhabitater er typiske miljøer for EPF22 og et fremragende naturreservoir. I den foreliggende undersøgelse blev to metoder til EPF-isolering ved hjælp af insektlokkemad versus selektivt medium behandlet. Det første skridt til isolering er indsamlingen af jordprøverne. Korrekt opbevaring og identifikation af jordprøver er afgørende. Oplysninger om breddegrad, længdegrad, jordtype og biom er afgørende for undersøgelser, der involverer epidemiologiske, modellerings- og geospatiale emner23,24. Efter indsamling anbefales det, at prøverne behandles så hurtigt som muligt (helst inden for 7 dage), fordi levedygtigheden af conidier i disse jordprøver i sidste ende kan falde. Kritiske trin i EPF-isoleringen ved hjælp af CTC omfatter: a) undersøgelse af CTC-plader 1 og 2 uger efter inkubation (de første uger er kritiske, fordi andre svampekolonier på senere stadier kan indsnævre EPF-udviklingen), og b) nøjagtigt at identificere EPF-kolonier baseret på deres makromorfologi og mikromorfologi. Til isolering ved hjælp af insektlokkemad er det vigtigt at holde jordprøven fugtig, men ikke suge den i vand.
Resultaterne rapporteret af flere undersøgelser har ført til en fortolkning af, at M. anisopliae er mere almindelig i dyrkede jordarter end naturlige økosystemer 8,25,26. Forskelle i fordelingen og forekomsten af disse svampe kan forekomme. I den foreliggende undersøgelse blev alle stammer isoleret enten fra dyrket jord (afgrøder) eller græsarealer, og der var en overvægt af Metarhizium spp. over Beauveria spp. Det foreslås, at dyrkningspraksis og det høje indhold af organisk materiale favoriserer tilstedeværelsen af saprofytiske svampe i jorden27. Derfor bør effektive isoleringsteknikker, der søger EPF, overveje at reducere svampeforurenende stoffer.
Selektive kunstige medier bruges almindeligvis til isolering, fordi de er nemme at bruge og har vist sig effektive til isolering af entomopatogene svampe, hovedsageligt Metarhizium spp. og Beauveria spp.28. Disse selektive medier bruger specifikke kemikalier til at reducere væksten af forurenende stoffer. I 1980'erne og 1990'erne blev fungicidet dodin et meget anvendt selektivt medium til at isolere Metarhizium spp. og Beauveria spp.29,30. Selvom disse kunstige medier er effektive, kan nogle EPF-arter som Metarhizium acridum være modtagelige for dodin31. Derfor blev det dodinfrie CTC-medium valgt i denne undersøgelse. Ifølge Fernandes et al.9 blev CTC udviklet til at maksimere isoleringen af naturligt forekommende entomopatogene svampe, herunder M. acridum. Brug af et selektivt medium i stedet for insektlokkemad i isolering af EPF er praktisk, fordi førstnævnte kræver mindre plads i prøvebehandlingen. Den største ulempe ved CTC-brug afhænger af, at nogle af dets komponenter (dvs. cyclohexamid og chloramphenicol) er giftige, så brugen af personlige værnemidler er obligatorisk.
Som observeret i denne undersøgelse er der rapporteret om en højere procentdel af positive prøver med insektlokkemad sammenlignet med kunstige selektive medier til isolering af EPF 15,32,33,34,35. Brugen af insekt lokkemad betragtes som et billigt og højeffektivt alternativ i søgen efter ny EPF. På trods af dette er der ulemper forbundet med brugen af insekt lokkemad over selektive medier. Da mængden af jord, der skal analyseres ved hjælp af insekter, er højere, er det også nødvendigt at have mere fysisk plads til at opbevare prøverne og inkubere potterne. Erhvervelsen af insekter kan også være en begrænsning. I Brasilien er G. mellonella for eksempel ikke kommercielt tilgængelig, så det er nødvendigt at etablere en koloni i laboratoriet for at bruge dette insekt som agn. Det er vigtigt at bevare saluriteten af insekternes kolonier og undgå naturlig infektion med EPF. En EPF-infektion i kolonien kan gøre isolationsresultaterne upålidelige. Derfor er man nødt til at observere de resterende larver i kolonien, der søger hvirvelløse patologiske tegn. Som et alternativ kan kontrolpotter med steril jord indgå i undersøgelsen for at kontrollere insektlarvernes sundhedsstatus.
At søge nye svampeisolater med fremragende biokontrolegenskaber er afgørende for at øge effektiviteten af svampe i leddyr-skadedyrsbekæmpelse. Svampe isoleret fra jord kan tilpasses godt til dyrkning i dette miljø22, og de vil sandsynligvis have høj feltpersistens, hvilket er et væsentligt kendetegn ved vellykket EPF i skadedyrsbekæmpelse21. Derfor kan lokalt isoleret EPF forbedre den biologiske bekæmpelse af lokale skadegørere på grund af deres geografiske og tidsmæssige kongruens, øge chancerne for succes og reducere de miljøpåvirkninger, der ellers er forårsaget af anvendelsen af syntetiske insekticider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasilien, finanskode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projektnummer E-26/010.001993/2015) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) fra Brasilien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
