Summary
엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.
Abstract
본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 엔토모병원성 진균(EPF)을 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택적 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다. 토양은 절지 동물 해충을 조절할 수있는 Metarhizium 및 Beauveria 속에 특히 속하는 EPF를 포함한 미생물의 풍부한 서식지입니다. 곰팡이를 기본으로하는 생물학적 제품은 주로 농업 절지 동물 해충 방제를 위해 시장에서 구입할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 높은 고유 생물 다양성에도 불구하고, 단지 몇 가지 균주만이 전 세계적으로 상업적 바이오 제품에 사용된다. 본 연구에서, 524개의 토양 샘플을 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천에서 배양하였다. 진균 콜로니의 성장은 3주 동안 관찰되었다. 모든 Metarhizium 및 Beauveria EPF는 속 수준에서 형태학적으로 확인되었습니다. 추가적으로, 일부 단리물은 종 수준에서 분자적으로 확인되었다. 이 524 개의 토양 샘플 중 스물 네 개는 곤충 미끼 방법 (갤러리아 멜로 넬라 및 테네브리오 몰리터)을 사용하여 EPF 발생에 대해 조사되었습니다. 총 51개의 EPF 균주(41개의 메타리지움 spp. 및 10개의 보베리아 spp.)를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 모든 곰팡이 균주는 농경지 또는 초원에서 분리되었습니다. 비교를 위해 선택된 24개의 샘플 중 91.7%는 갤러리아 미끼를 사용한 EPF에 대해 양성이었고, 62.5%는 테네브리오 미끼를 사용했으며, 41.7%는 CTC를 사용하여 양성이었다. 우리의 결과는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 것이 CTC 배지를 사용하는 것보다 더 효율적이라는 것을 시사했습니다. EPF의 식별 및 보존 외에도 분리 방법의 비교는 생물 다양성에 대한 지식에 긍정적 인 영향을 미칩니다. EPF 컬렉션의 개선은 과학 발전과 기술 혁신을 지원합니다.
Introduction
토양은 엔토모병원성 진균(EPF)을 포함한 여러 미생물의 공급원입니다. 이 특정 곰팡이 그룹은 절지 동물 숙주, 특히 곤충을 식민지화하고 종종 죽일 수있는 능력에 의해 인식됩니다1. 분리, 특성화, 독성 균주의 선택 및 등록 후, EPF는 절지 동물 해충 방제를 위해 대량 생산되며, 이는 경제적 관련성2을 지원합니다. 따라서, EPF의 분리는 생물농약의 개발을 위한 첫 번째 단계로 간주된다. Beauveria spp. (Hypocreales : Cordycipitaceae)와 Metarhizium spp. (Hypocreales : Clavicipitaceae)는 절지 동물 해충 방제에 사용되는 가장 일반적인 곰팡이입니다3. EPF는 토양, 눈에 보이는 진균증을 가진 절지 동물, 식민지화 된 식물 및 식물 근권 4,5에서 성공적으로 분리되었습니다.
EPF의 분리는 또한이 특정 그룹의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 최근 문헌들은 EPF의 사용이 과소평가되고 있으며, 식물 생장을 개선하고4, 토양으로부터 독성 오염물질을 제거하고, 약6에서 사용될 수 있는 능력과 같은 EPF의 몇몇 비전통적 응용을 인용하고 있다. 본 연구는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 효율과 인공 배양 배지 7,8,9를 비교하는 것을 목표로합니다. EPF 격리의 맥락에서 곤충 미끼로 갤러리아 멜로 넬라 L. (Lepidoptera : Phyralidae)의 사용은 잘 받아 들여졌습니다. 이 유충은 전 세계적으로 과학계에서 숙주 - 병원체 상호 작용10,11을 연구하기위한 실험 모델로 사용됩니다. Tenebrio molitor L. (Coleoptera : Tenebrionidae) 유충은 독성과 관련된 연구 및 EPF의 격리를위한 또 다른 곤충 모델로 간주됩니다.이 곤충은 저렴한 비용으로 실험실에서 희귀하기 쉽기 때문에 7,12.
다양한 PCR 기술을 사용하는 것과 같은 배양-독립적인 방법은 토양13,14를 포함하는 그들의 기질 상의 EPF를 검출하고 정량화하는데 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 진균 콜로니를 적절하게 단리하기 위해, 이들의 기질은 선택적인 인공 배지(9) 상에서 배양되어야 하거나, 샘플에 존재하는 진균은 민감한 곤충(15)을 사용하여 미끼화될 수 있다. 한편, CTC는 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천으로 구성된 도딘이 없는 인공 배지입니다. 이 배지는 Fernandes et al.에 의해 개발되었다. 9 토양에서 자연적으로 발생하는 Beauveria spp. 및 Metarhizium spp.의 회수를 극대화합니다. 한편, G. mellonella 및 T. molitor 유충은 또한 토양으로부터 EPF 분리 물을 얻기 위한 미끼로서 성공적으로 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 Sharma et al.15에 따르면,이 두 미끼 곤충의 병용 사용과 비교를보고하는 연구는 거의 없습니다. 포르투갈 포도원 토양은 Metarhizium robertsii (Metscn)의 상당한 회복을 나타냈다. T를 사용하는 소로킨. G. 멜로넬라 유충과 비교하여 몰리터 유충; 대조적으로, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill 격리는 G. mellonella 미끼15의 사용과 관련이 있습니다. 따라서, 어떤 EPF 분리 방법(즉, G. mellonella-bait, T. molitor-bait 또는 CTC 배지)을 사용할지에 대한 결정은 연구의 목표 및 실험실 인프라에 따라 고려되어야 한다. 본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 EPF를 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다.
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Protocol
본 연구가 브라질 유전 유산에 접근함에 따라이 연구는 AA47CB6 코드로 유전 유산 및 관련 전통 지식 관리 (Sisgen)를위한 국가 시스템에 등록되었습니다.
1. 토양 샘플링
- 작은 삽을 사용하여 800g의 토양 (입사 보조 식물 뿌리 유무에 관계없이)을 10cm 깊이로 수집하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 보관하십시오.
참고 : EPF가 근권 능력을 갖고있다고보고됨에 따라 작은 뿌리도 수집 할 수 있습니다. 샘플의 처리가 빠를수록 곰팡이 포자가 시간이 지남에 따라 덜 생존 할 수 있기 때문에 더 좋습니다. 본 연구에서, 샘플은 수집 후 7일 이내에 분석되었다. - GPS를 사용하여 위도 및 경도에서 수집된 샘플의 위치를 식별하고 토양의 유형(예: 초원, 토착 열대 우림, 호숫가 또는 농경지)에 따라 수집 지역을 분류합니다.
2. 엔토모병원성 진균에 대한 분리 방법
- CTC 선택적 인공 배지를 사용한 분리.
- CTC 배지 [0.5 g/L의 클로람페니콜, 0.001 g/L의 티아벤다졸, 0.25 g/L의 시클로헥시미드9로 보충된 감자 덱스트로스 한천 플러스 효모 추출물(PDAY)]을 준비하려면, 모든 시약을 개별적으로 칭량하고, 증류수에 혼합하고, 오토클레이브에서 배지를 멸균한다. 생물안전 캐비닛에서, 배지 23mL를 60mm x 15mm 페트리 플레이트에 플레이트로 플레이트한다.
주의: CTC 시약을 칭량하는 동안 사이클로헥시미드와 클로람페니콜이 독성이 있으므로 실험실 코트, 마스크, 장갑 및 고글을 사용하십시오. - 0.35 ± 0.05 g의 각 토양 샘플 (뿌리 유무에 관계없이)을 무게로 측정하여 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣으십시오.
- 생물 안전 캐비닛에 멸균 0.01 % (vol / vol) 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 모노 올레 에이트 수성 현탁액 1 mL를 토양과 와류가 들어있는 마이크로 튜브에 30 초 동안 첨가하십시오.
- 50 μL의 상청액을 제거하고 CTC 배지로 페트리 플레이트의 중앙에 피펫팅한다. 현탁액을 멸균된 Drigalski 주걱(직경 6 mm)을 사용하여 배지의 표면에 균질하게 분산시킨다.
참고: 각 토양 샘플에 대해 적어도 세 번의 반복실험을 준비해야 합니다. - 플레이트를 어둠 속에서 기후 챔버 (25± 1°C, 상대 습도 ≥80%)에서 인큐베이션하고, 배양 7, 14, 및 21일 후에 진균 콜로니의 성장을 관찰한다.
- EPF를 찾는 곰팡이 식민지의 대형학 및 미세 형태를 관찰하십시오. 순수한 배양물이 얻어질 때까지 EPF 배양물을 감자 덱스트로스 한천 배지와 0.05% 클로람페니콜(PDAC)로 옮긴다.
참고: EPF 콜로니를 식별하기 위해 3단계에서 아래에 표시된 설명 키를 사용하십시오.
- CTC 배지 [0.5 g/L의 클로람페니콜, 0.001 g/L의 티아벤다졸, 0.25 g/L의 시클로헥시미드9로 보충된 감자 덱스트로스 한천 플러스 효모 추출물(PDAY)]을 준비하려면, 모든 시약을 개별적으로 칭량하고, 증류수에 혼합하고, 오토클레이브에서 배지를 멸균한다. 생물안전 캐비닛에서, 배지 23mL를 60mm x 15mm 페트리 플레이트에 플레이트로 플레이트한다.
- 곤충 미끼를 사용한 격리
- 표면 소독 된 G. mellonella 및 T. molitor 후기 단계 유충을 사용하십시오. 살균을 위해 유충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨에 1 분 동안 담그십시오. 멸균수를 사용하여 애벌레를 두 번 씻으십시오.
참고: 네 번째 단계의 G. 멜로넬라 유충이 본 연구에 사용되었다. T. molitor 애벌레 단계는 표준화되지 않았다. - 플라스틱 냄비를 사용하여 미끼를 조립하십시오. 수집 된 토양 250g을 각 플라스틱 냄비에 넣으십시오 (너비 98mm x 높이 47mm x 길이 142mm). 각 종의 15 마리의 유충 (T. molitor 및 G. mellonella)을 분리하고 플라스틱 냄비 당 5 마리의 애벌레를 퇴적시킵니다. 냄비를 25 ± 1 °C, 상대 습도 ≥ 80 %에 어둠 속에서 보관하십시오.
참고: 냄비 뚜껑에 10개의 작은 구멍(직경 2mm)을 뚫어 환기가 가능합니다. 날카로운 가열 철 장치를 사용하여 구멍을 뚫을 수 있습니다. - 애벌레와 토양의 최대 접촉을 허용하기 위해 격일로 토양을 균질화하십시오.
참고 : 수분은 애벌레의 곰팡이 감염을 지원하는 데 중요합니다. 토양의 수분을 유지하려면 필요할 때마다 토양 표면에 멸균 증류수를 뿌리십시오. 토양 샘플을 물에 담그지 마십시오. - 죽은 곤충을 찾는 냄비를 매일 분석하십시오.
참고 : 곤충이 감염되지 않았는지 확인하기 위해 무척추 동물 병리학 적 징후를 위해 식민지에 남아있는 유충을 매일 관찰하십시오. 대안으로, 멸균 토양을 가진 대조 냄비는 곤충 유충의 건강 상태를 검사하기 위한 연구에 포함될 수 있다. - 죽은 곤충을 제거하고 1 분 동안 0.5 % 차아 염소산 나트륨으로 피상적으로 살균하십시오. 멸균 곤충을 25≥ 1°C에서 7일 동안 습한 챔버(상대 습도 ± 80%)에 두어 엔토모병원성 진균(mycosis)의 외장화를 지지한다.
- 진균증에 따라, 곤충 표면에서 conidia를 수확하십시오. 미생물 루프를 사용하여 침엽수를 입체 현미경으로 PDAC 배지 위에 놓습니다. 대안으로, 감염된 전체 유충을 PDAC 배지 상에 놓는다. 배양 플레이트를 25± 1°C 및 상대 습도 80%≥ 기후 챔버에서 인큐베이션한다.
- EPF의 동일성을 확인하기 위해 플레이트 상의 진균 콜로니의 거대 형태학 및 미세형태를 관찰한다. 순수한 진균 콜로니가 얻어질 때까지 PDAC에서 배양을 반복한다.
참고: EPF 콜로니를 식별하기 위해 3단계에서 아래에 표시된 설명 키를 사용하십시오.
- 표면 소독 된 G. mellonella 및 T. molitor 후기 단계 유충을 사용하십시오. 살균을 위해 유충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨에 1 분 동안 담그십시오. 멸균수를 사용하여 애벌레를 두 번 씻으십시오.
3. EPF (Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.)의 식별
- 플레이트 상의 진균 배양물의 거시형태학적 특성(즉, 콜로니의 표면 및 역, 이들의 형상, 가장자리, 성장 속도, 색상, 질감, 확산성 안료, 삼출물, 및 공중 코니디아)을 25±1°C 및 상대 습도 80%에서 14일 후에 분석≥다.
- 공중 침엽수를 슬라이드 배양물(microculture technique)16으로 옮겨 25± 1°C 및 상대습도 80%≥에서 3일 동안 락토페놀 블루로 염색하여 미세한 특징(즉, 원추골의 배열, conidiophores, conidia의 모양 및 크기)17,18,19,20을 관찰하였다.
- EPF 동정을 확인하기 위해 광학 현미경을 이용하여 400x에서 현미경 진균 구조를 관찰하였다.
참고: EPF에 대한 형태학적 키는 Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., 및 Humber17,18,19,20에 의한 보고에 기재되어 있다. 곰팡이 식민지의 매크로 및 미세 형태학은 속 수준에서 필라멘트 균류를 확인하는 데 사용되는 가장 빈번한 기준입니다. EPF의 속에 따라, 이러한 형태학적 특성이 바뀔 것이다. 험버20은 곰팡이 엔토모병원균의 주요 속(genera)에 대한 식별 열쇠를 제시한다. 예를 들어, 메타리지움 spp. 콜로니는 일반적으로 원형, 분말성이며, 녹색의 다양한 색조를 나타내며, 삼출물을 나타낼 수 있습니다. 현미경적으로,이 콜로니는 컴팩트 한 hymenium을 형성하는 광범위하게 분지되고 조밀하게 얽혀있는 conidiophores에 원통형 - 타원형 코니디아 (conidiophores)에 원통형 세포 정점을 가지고 있으며, 평행 사슬에서 원통형으로 타원형 코니디아가 기둥 또는 판상 덩어리를 형성합니다. Beauveria spp. 식민지는 일반적으로 흰색, 분말 또는 면화와 같습니다. 그들은 지그재그 방향으로 정점으로 연장되는 확장 된 기저 부분을 가진 원추형 세포를 나타냅니다. Beauveria conidiophores는 지구 모양의 코니디아의 조밀 한 클러스터를 형성합니다. 분자 분석은 종 수준에서 EPF의 확인에 필요합니다. - 종 수준에서 분류 식별을 위해 분리 물에 대한 분자 분석을 수행하십시오. 본 연구에서 분리된 EPF 균주, 즉 Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.의 경우, Bischoff et al.17 및 Rehner et al.18의 보고에 기초하여 분자 분석을 수행한다.
- 단리물을 EPF로 확인한 후, 단리물을 진균 배양물 집합체에 침착시킨다. 본 연구에서, 단리물은 리우데자네이루 연방 농촌 대학의 미생물 통제 연구소 (LCM)로부터의 엔토모병원성 진균 배양물 수집물에 침착되었다.
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Representative Results
브라질 리우데자네이루 주에서 2015년부터 2018년까지 가축 목초지(165개 샘플), 토착 열대 우림(90개 샘플), 호숫가(42개 샘플), 경작/농경지(227개 샘플)와 같은 총 524개의 토양 샘플이 초원에서 수집되었습니다. EPF에 대해 양성인 샘플의 지리적 좌표에 대한 세부사항은 보충 표 1에 제시되어 있다.
524개의 토양 샘플 중 500개의 샘플은 CTC 배지를 통해서만 분석되었으며, 24개의 샘플은 세 가지 형태의 분리(갤러리아-미끼, 테네브리오-미끼 및 선택적 CTC 배양 배지)를 사용하여 동시에 분석되었기 때문에 이러한 방법의 상대적 효율을 평가할 수 있었습니다. 총 51개의 EPF 균주를 524개의 샘플로부터 분리하였다(메타 리지움 spp. 41개 및 보베리아 spp. 10개). (그림 1). 일부 단리물의 미세형태학적 특성은 도 2에 나타내었다. 모든 진균 균주는 초원 또는 농경지로부터 분리되었다(보충 표 1). 결과는 Metarhizium spp.가 Beauveria spp.보다 더 널리 퍼져 있음을 보여주었습니다 (보충 표 1). 메타리지움 단리 물 중 9개(LCM S01 내지 LCM S09)는 ef1-a(진핵 번역 신장 인자 1-알파) 유전자21을 사용하여 분자적으로 동정하였다. 이 중 7개의 분리물(LCM S01-LCM S06 및 LCM S08)은 메타리지움 아니소플리아 센수테르초로 확인되었고, 두 개의 단리물(LCM S07 및 LCM S09)은 메타리지움 핑샨세21로 확인되었다.
세 가지 상이한 분리 방법을 사용하여 연구된 24개의 토양 샘플에서 EPF(양성 EPF 샘플의 %)의 발생이 표 1에 제시되어 있다. EPF의 회수율은 카이-제곱 검정에 의해 분석되었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 갤러리아 미끼는 EPF (양성 샘플의 91.7% (22/24))의 단리에 더 효율적임이 입증되었고, 이어서 T. molitor 미끼 (EPF 양성 샘플의 62.5% (15/24)) 및 CTC 배지 (EPF 양성 샘플의 41.7% (14/24))가 뒤따랐다. 이 24 개의 토양 샘플은 Beauveria spp.의 회복은 보이지 않았지만 Metarhizium 만 나타났습니다.
그림 1: 토양 샘플로부터 분리된 균주의 엔토모병원성 진균 콜로니. 콜로니를 CTC 인공 배지 상에서 배양하였다. (1) 순수한 배양이 수득되기 전에 CTC 선택적 배지 상에서 배양 14일 후 토양 샘플로부터 진균 콜로니를 나타내는 페트리 플레이트; (2-42) 순수 메타리지움 spp. 콜로니; (43-52) 순수 보베리아 spp. 식민지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 토양 샘플로부터 분리된 엔토모병원성 진균의 미세형태학적 특성. 콜로니를 25± 1°C 및 상대습도 80%≥ 감자 덱스트로스 한천에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 현미경 슬라이드를 락토페놀 블루 용액으로 염색하였다. 이미지는 (A) 은형화 아니소플리아 센수테르토(들) 단리된 LCM S01의 conidiophores 및 conidia를 보여준다; (b) 메타리지움 아니소플리아 에스 단리물 LCM S03; (c) 메타리지움 sp. LCM S27을 단리하는 단계; (D-F) Beauveria spp.는 LCM S23, LCM S24 및 LCM S20을 각각 분리합니다. 여기에 나타난 모든 균주는 CTC 배지를 사용하여 분리하였다. LCM S27은 또한 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 회수되었습니다. * Conidiophores 및 conidia. ** 침엽수 사슬은 인접한 사슬에서 메타 리지움 포자의 특징적인 나란히 배치를 보여줍니다. 검은 화살표는 Metarhizium 원통형에서 타원형 코니디아를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 보베리아 지구 모양의 코니디아를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 격리 방법 | 엔토모병원성 균류* | χ2** | |
| 플러스 | 마이너스 | ||
| 갤러리아 미끼 | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| 테네브리오 미끼 | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC 선택적 배지 | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * 메타 리지움 spp.만이 분리되었다. | |||
| ** 카이-제곱 분석, DF2. P = 0.0013 | |||
표 1: 상이한 분리 방법을 사용하여 24개의 토양 샘플에서 엔토모병원성 진균(양성 샘플의 %)의 발생.
보충 표 1 : 지리적 좌표, 분리 방법, 코드, 수집 연도 및 엔토모 병원성 곰팡이에 양성 인 샘플의 토지 사용 유형. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
자연 및 농업 토양 서식지는 EPF22 및 우수한 자연 저수지의 전형적인 환경입니다. 본 연구에서, 곤충 미끼 대 선택적 배지를 사용하는 EPF 분리의 두 가지 방법이 다루어졌다. 격리를위한 첫 번째 단계는 토양 샘플의 수집입니다. 토양 샘플의 적절한 저장 및 확인이 중요합니다. 위도, 경도, 토양 유형 및 생물 군계에 대한 정보는 역학, 모델링 및 지리 공간 과목23,24을 포함하는 연구에 필수적입니다. 수집 후, 이러한 토양 샘플에서 코니디아의 생존력이 결국 감소 할 수 있기 때문에 샘플을 가능한 한 빨리 (바람직하게는 7 일 이내에) 처리하는 것이 좋습니다. CTC를 이용한 EPF 분리의 중요한 단계는 a) 배양 후 1 및 2 주 후에 CTC 플레이트의 조사 (1 주간은 나중 단계에서 다른 진균 콜로니가 EPF 발달을 좁힐 수 있기 때문에 중요합니다), b) 그들의 거시 형태학 및 미세 형태학에 기초하여 EPF 콜로니를 정확하게 식별하는 것을 포함합니다. 곤충 미끼를 사용하여 격리하려면 토양 샘플을 습하게 유지하지만 물에 담그지 않는 것이 중요합니다.
여러 연구에 의해보고 된 결과는 M. anisopliae가 자연 생태계 8,25,26보다 재배 토양에서 더 흔하다는 해석을 이끌어 냈습니다. 이러한 곰팡이의 분포와 발생에 차이가 발생할 수 있습니다. 본 연구에서, 모든 균주는 경작 토양 (작물) 또는 초원으로부터 분리되었고, Beauveria spp보다 Metarhizium spp.의 우세가 있었다. 재배 관행과 유기물의 함량이 높으면 토양27에서 saprophytic 곰팡이의 존재를 선호한다고 제안된다. 따라서, EPF를 추구하는 효과적인 격리 기술은 곰팡이 오염 물질을 감소시키는 것을 고려해야 한다.
선택적 인공 배지는 사용하기 쉽고 엔토모병원성 진균, 주로 Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.28을 분리하는 데 효율이 입증되었기 때문에 격리에 일반적으로 사용됩니다. 이러한 선택적 매체는 오염 물질의 성장을 줄이기 위해 특정 화학 물질을 사용합니다. 1980 년대와 1990 년대에 살균제 도딘은 Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.29,30을 분리하기 위해 널리 사용되는 선택적 배지가되었습니다. 이러한 인공 배지가 효과적이지만, 메타리지움 아크리둠과 같은 일부 EPF 종은 도딘31에 취약할 수 있다. 이것이 도딘이 없는 CTC 배지가 본 연구에서 선택된 이유입니다. Fernandes et al.9에 따르면, CTC는 M. acridum을 포함한 자연 발생 엔토모병원성 진균의 분리를 최대화하기 위해 개발되었다. EPF의 단리에서 곤충 미끼보다는 선택적 배지를 사용하는 것이 편리한데, 그 이유는 전자가 샘플 처리에서 더 적은 공간을 필요로 하기 때문이다. CTC 사용의 주요 단점은 일부 구성 요소 (예 : 시클로 헥시미드 및 클로람페니콜)가 독성이 있으므로 개인 보호 장비의 사용이 필수적이라는 사실에 달려 있습니다.
본 연구에서 관찰 된 바와 같이, EPF 15,32,33,34,35의 단리를 위한 인공 선택적 배지와 비교하여 곤충 미끼로 양성 샘플의 더 높은 비율이 보고되었다. 곤충 미끼의 사용은 새로운 EPF를 찾는 데 저비용 및 고효율 대안으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고, 선택적 배지에 대한 곤충 미끼의 사용과 관련된 단점이 있습니다. 곤충을 사용하여 분석 할 토양의 양이 많기 때문에 샘플을 저장하고 냄비를 배양 할 수있는 더 많은 물리적 공간이 필요합니다. 곤충의 획득은 또한 한계가 될 수 있습니다. 예를 들어, 브라질에서는 G. mellonella가 상업적으로 이용 가능하지 않으므로이 곤충을 미끼로 사용하기 위해 실험실에 식민지를 설립해야합니다. EPF에 의한 자연 감염을 피하면서 곤충 식민지의 살브리티를 유지하는 것이 필수적입니다. 콜로니에서의 EPF 감염은 분리 결과를 신뢰할 수 없게 만들 수 있습니다. 따라서 무척추 동물 병리학 적 징후를 찾는 식민지에 남아있는 유충을 관찰해야합니다. 대안으로, 멸균 토양을 가진 대조 냄비는 곤충 유충의 건강 상태를 검사하기 위한 연구에 포함될 수 있다.
뛰어난 생물 방제 특성을 가진 새로운 곰팡이 분리 물을 찾는 것은 절지 동물 해충 방제에서 곰팡이의 효과를 높이는 데 중요합니다. 토양으로부터 분리된 진균류는 이러한 환경(22)에서 성장하는데 잘 적응될 수 있고, 이들은 높은 현장 지속성을 가질 가능성이 있으며, 이는 해충 방제(21)에서 성공적인 EPF의 필수적인 특성이다. 따라서, 국부적으로 분리된 EPF는 그들의 지리적 및 시간적 일치로 인해 국소 해충의 생물학적 방제를 향상시킬 수 있고, 성공 가능성을 증가시키고, 그렇지 않으면 합성 살충제의 적용에 의해 야기되는 환경 영향을 감소시킬 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 브라질의 Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Financial code 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (프로젝트 번호 E-26/010.001993/2015) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 브라질에서 자금을 조달했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
