Summary
使用 Tenebrio 诱饵， Galleria 诱饵以及选择性人造培养基（即富含氯霉素，噻苯达唑和环己酰亚胺（CTC培养基）的酵母提取物的马铃薯葡萄糖琼脂从热带土壤样品中分离出昆虫致病真菌菌落。
Abstract
本研究的目的是比较使用昆虫诱饵与人工选择性培养基从土壤样品中分离昆虫致病真菌（EPF）的有效性。土壤是微生物的丰富栖息地，包括EPF，特别是属于Metarhizium和Beauveria属，它们可以调节节肢动物害虫。市场上有基于真菌的生物制品，主要用于农业节肢动物害虫防治。然而，尽管地方性生物多样性很高，但全世界只有少数菌株用于商业生物制品。本研究在富含氯霉素、噻苯达唑和环己酰亚胺（CTC培养基）的酵母提取物的马铃薯葡萄糖琼脂上培养了524个土壤样品。观察真菌菌落的生长3周。所有Metarhizium和Beauveria EPF都在属水平上进行了形态学鉴定。此外，一些分离株在物种水平上被分子鉴定。在这524个土壤样本中，有24个也使用昆虫诱饵法（Mellonella和Tenebrio molitor）调查了EPF的发生率。从524个土壤样品中共分离出51个EPF菌株（41个Metarhizium spp.和10个Beauveria spp.）。所有真菌菌株都从农田或草原中分离出来。在选取比较的24个样本中，91.7%使用Glaeria诱饵的EPF阳性，62.5%使用Tenebrio诱饵，41.7%使用CTC。我们的结果表明，使用昆虫诱饵从土壤中分离出EPF比使用CTC培养基更有效。除了EPF的识别和保护之外，分离方法的比较还对生物多样性知识产生了积极影响。EPF收集的改进支持科学发展和技术创新。
Introduction
土壤是几种微生物的来源，包括昆虫致病真菌（EPF）。这种特殊的真菌群通过它们定殖并经常杀死节肢动物宿主的能力而得到认可，特别是昆虫1。经过分离、表征、杀伤性菌株的选择和注册后，EPF被大量生产用于节肢动物害虫控制，这支持了它们的经济相关性2。因此，分离EPF被认为是开发生物农药的第一步。 Beauveria spp.（Hypocreales：Cordycipitaceae）和 Metarhizium spp.（Hypocreales：Clavicipitaceae）是用于节肢动物害虫控制的最常见真菌3。EPF已成功从土壤，具有可见真菌病的节肢动物，定植植物和植物根际4，5中分离出来。
分离EPF也可用于研究该特定组的多样性，分布和生态学。最近的文献报道说，EPF的使用被低估了，引用了EPF的几个非常规应用，例如它们改善植物生长的能力4，从土壤中去除有毒污染物，以及用于医学6。本研究旨在比较使用昆虫诱饵从土壤中分离EPF与人工培养基的效率7，8，9。在EPF分离的背景下，使用 Galleria mellonella L.（鳞翅目：Phyralidae）作为昆虫诱饵已被广泛接受。这些幼虫被全世界科学界用作研究宿主 - 病原体相互作用的实验模型10，11。 Tenebrio molitor L.（鞘翅目：Tenebrionidae）幼虫被认为是涉及毒力和分离EPF的研究的另一种昆虫模型，因为这种昆虫在实验室中很容易以低成本稀有7，12。
与培养无关的方法，例如使用各种PCR技术，可用于检测和定量其基质上的EPF，包括土壤13，14。然而，为了正确分离这些真菌菌落，应将其基质培养到选择性人工培养基9上，或者可以使用敏感昆虫15对样品中存在的真菌进行诱饵。一方面，CTC是一种不含多定的人造培养基，由富含酵母提取物的马铃薯葡萄糖琼脂组成，并辅以氯霉素，噻苯达唑和环己酰亚胺。这种培养基是由费尔南德斯等人开发的。9 .以最大限度地从土壤中恢复天然存在的 Beauveria spp.和 Metarhizium spp.。另一方面， G. mellonella 和 T. molitor 幼虫也可以成功地用作诱饵，以从土壤中获得EPF分离物。然而，根据Sharma等人15的说法，报告伴随使用和比较这两种诱饵昆虫的研究较少。葡萄牙葡萄园土壤对 Metarhizium robertsii（Metscn .）进行了显着恢复。索罗金使用 T。 与 G. mellonella 幼虫相比的molitor幼虫;相比之下， Beauveria bassiana （Bals. -Criv.）Vuill分离与使用 G. mellonella 诱饵15有关。因此，应根据研究目标和实验室基础设施来决定使用哪种EPF分离方法（即 ，G. mellonella-bait， T. molitor-bait或CTC培养基）。本研究的目的是比较使用昆虫诱饵与人工选择性培养基从土壤样品中分离EPF的有效性。
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Protocol
由于本研究涉及巴西遗传遗产，该研究在国家遗传遗产和相关传统知识管理系统（Sisgen）注册，代码为AA47CB6。
1. 土壤采样
- 使用小铲子将800克土壤（有或没有入射的次生植物根）收集到10厘米的深度。将它们在室温下储存在聚丙烯袋中，直到实验开始。
注意：小根也可以收集，因为据报道EPF具有根际能力。样品的处理速度越快越好，因为随着时间的推移，真菌孢子的存活率可能降低。在本研究中，样品在收集后不超过7天进行分析。 - 使用 GPS 以纬度和经度标识收集的样本的位置，并根据土壤类型（例如，草原、原生雨林、湖岸或农田）对收集的区域进行分类。
2. 昆虫致病真菌的分离方法
- 使用CTC选择性人工培养基进行分离。
- 制备CTC培养基[马铃薯葡萄糖琼脂加酵母提取物（PDAY）补充0.5g/L氯霉素，0.001g/L噻苯达唑和0.25g/L环己酰亚胺9]，分别称量所有试剂，在蒸馏水中混合，并在高压灭菌器中灭菌培养基。在生物安全柜中，将23 mL培养基板放入60 mm x 15 mm培养皿中。
注意：称量 CTC 试剂时，请使用实验室外套、面罩、手套和护目镜，因为环己酰亚胺和氯霉素有毒。 - 称取0.35±0.05g每个土壤样品（有根或不带根），并将其放入1.5 mL微管中。
- 在生物安全柜中，将1mL无菌的0.01%（vol / vol）聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯水悬浮液加入到含有土壤和涡流的微管中30秒。
- 除去50μL上清液，并用CTC培养基将其移液到培养皿的中心。使用无菌的Drigalski刮刀（直径6毫米）将悬浮液均匀地分散到培养基表面上。
注意：应为每个土壤样品准备至少三个重复。 - 在黑暗中将板在气候室（25±1°C，相对湿度≥80%）中孵育，并在孵育7，14和21天后观察真菌菌落的生长。
- 观察寻求EPF的真菌菌落的宏观形态和微观形态。将EPF培养物转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中加0.05%氯霉素（PDAC），直到获得纯培养物。
注意：使用下面步骤 3 中提供的描述键来识别 EPF 菌落。
- 制备CTC培养基[马铃薯葡萄糖琼脂加酵母提取物（PDAY）补充0.5g/L氯霉素，0.001g/L噻苯达唑和0.25g/L环己酰亚胺9]，分别称量所有试剂，在蒸馏水中混合，并在高压灭菌器中灭菌培养基。在生物安全柜中，将23 mL培养基板放入60 mm x 15 mm培养皿中。
- 使用昆虫诱饵进行隔离
- 使用表面消毒的 梅洛内拉 菌和 莫利托 锥虫晚期幼虫。将幼虫浸入0.5%次氯酸钠中1分钟进行灭菌。用无菌水清洗幼虫两次。
注意：本研究使用了第四阶段的 G. mellonella 幼虫。 T. molitor 幼虫阶段没有标准化。 - 使用塑料罐组装诱饵。向每个塑料盆中加入250克收集的土壤（98毫米宽x 47毫米高x 142毫米长）。分离每个物种的15个幼虫（T. molitor 和 G. mellonella），每个塑料盆沉积5个幼虫。将锅存放在25±1°C和相对湿度≥80%的黑暗中。
注意：在锅盖上钻10个小孔（直径2毫米）以进行通风。可以使用锋利的加热铁装置来钻孔。 - 每隔一天对土壤进行一次均质化，以允许幼虫与土壤的最大接触。
注意：水分对于支持幼虫的真菌感染很重要。为了保持土壤中的水分，必要时在土壤表面喷洒无菌蒸馏水。不要将土壤样品浸泡在水中。 - 每天分析花盆寻找死昆虫。
注意：每天观察菌落中剩余的幼虫，寻找无脊椎动物的病理体征，以确保昆虫没有被感染。作为替代方案，可以将具有无菌土壤的对照盆包括在研究中，以检查昆虫幼虫的健康状况。 - 去除死昆虫，并用0.5%次氯酸钠对它们进行表面灭菌1分钟。将无菌昆虫置于潮湿的室内（相对湿度≥80%）中，在25±1°C下放置7天，以支持昆虫致病真菌（真菌病）的外化。
- 真菌病后，从昆虫表面收获分生孢子。使用微生物环将分生孢子放在立体显微镜下的PDAC培养基上。作为替代方案，将整个受感染的幼虫放在PDAC培养基上。将培养板在25±1°C和相对湿度≥80%的气候室中孵育。
- 观察平板上真菌菌落的宏观形态和微观形态，以确认EPF的身份。在PDAC上重复培养，直到获得纯真菌菌落。
注意：使用下面步骤 3 中提供的描述键来识别 EPF 菌落。
- 使用表面消毒的 梅洛内拉 菌和 莫利托 锥虫晚期幼虫。将幼虫浸入0.5%次氯酸钠中1分钟进行灭菌。用无菌水清洗幼虫两次。
3. EPF（Metarhizium spp. 和 Beauveria spp.） 的鉴定
- 在25±1°C和相对湿度≥80%下分析14天后平板上真菌培养物的宏观形态特征（即菌落的表面和反向，它们的形状，边缘，生长速率，颜色，质地，可扩散色素，渗出物和地上分生孢子）。
- 将地上分生孢子转移到载玻片培养物（微培养技术）16 中，在25±1°C和相对湿度≥80%下进行3天，并用乳酚蓝染色以观察微观特征（即分生孢子的排列，分生孢子的形状和大小）17，18，19，20。
- 使用光学显微镜以400x观察微观真菌结构以确认EPF鉴定。
注：EPF的形态学键在Bischoff等人，Rehner等人，Seifert等人和Humber17，18，19，20的报告中进行了描述。真菌菌落的宏观和微观形态是用于在属水平上鉴定丝状真菌的最常见标准。根据EPF的属，这些形态特征会发生变化。Humber20提出了真菌昆虫病原体主要属的识别密钥。例如，Metarhizium spp.菌落通常是圆形的，粉状的，表现出不同深浅的绿色，并且可以呈现渗出物。在显微镜下，这些菌落具有在广泛分枝，密集交织的分生孢子体上顶端的分生细胞，形成致密的处女膜，并且圆柱形至椭圆状分生孢子以平行链的形式形成柱状或板状肿块。Beauveria spp.菌落通常是白色，粉末状或棉花状。它们表现出分生性细胞，其扩张的基部在锯齿形方向上顶端延伸。Beauveria分生孢子形成密集的球形分生孢子簇。在物种一级鉴定EPF需要进行分子分析。 - 对分离株进行分子分析，以便在物种水平上进行分类学鉴定。对于本研究中分离的EPF菌株，即 Metarhizium spp.和 Beauveria spp.，根据Bischoff等人的报告进行分子分析，17 和Rehner等人18。
- 确认分离物为EPF后，将分离物沉积在真菌培养物的集合中。在本研究中，分离物沉积在里约热内卢联邦农村大学微生物控制实验室（LCM）的昆虫致病真菌培养物收集中。
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Representative Results
2015年至2018年间，巴西里约热内卢州共从草原收集了524个土壤样本：畜牧业（165个样本）、原生热带森林（90个样本）、湖畔（42个样本）和耕地/耕地（227个样本）。公积金阳性样本的地理坐标详情载于 补充表1。
在524个土壤样品中，仅使用CTC培养基分析了500个样品，并使用3种形式的分离（Galleria-bait， Tenebrio-bait和选择性CTC培养基）对24个样品进行了同时分析，因此可以评估这些方法的相对效率。从524个样本（41 个Metarhizium spp.和10 个Beauveria spp.）中共分离出51个EPF菌株。（图 1）。一些分离株的微形态学特征如图 2所示。从草原或农田中分离出所有真菌菌株（补充表1）。结果显示， Metarhizium spp.比 Beauveria spp.更普遍（补充表1）。九种 Metarhizium 分离物（LCM S01至LCM S09）使用ef1-a（真核翻译伸长因子1-α）基因21进行分子鉴定。其中，7株分离株（LCM S01-LCM S06和LCM S08）被鉴定为严格意义上 的异根 ，而2株分离株（LCM S07和LCM S09）被鉴定为 Metarhizium pingshaense21。
使用三种不同分离方法研究的24个土壤样品中EPF（阳性EPF样品的百分比）的发生情况如 表1所示。采用卡方检验法分析了EPF的回收率。如 表1所示， Galleria 诱饵在分离EPF（91.7%（22/24）阳性样品）后，其次是 T. molitor 诱饵（62.5%（15/24）的EPF阳性样品）和CTC培养基（41.7%（14/24）的EPF阳性样品）方面更有效。这24个土壤样本显示 Beauveria spp.没有恢复，只有 Metarhizium。
图1：从土壤样品中分离出的菌株的昆虫致病真菌菌落。 在CTC人工培养基上培养菌落。（1）在CTC选择性培养基上孵育14天后，在获得纯培养物之前，从土壤样品中显示出真菌菌落的培养皿;（2-42）纯 甲根 菌落;（43-52） 纯 美穗 属菌落。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从土壤样品中分离出的昆虫致病真菌的微观形态特征。将菌落在25±1°C和相对湿度≥80%的马铃薯葡萄糖琼脂上孵育3天。显微镜载玻片用乳酚蓝溶液染色。图像显示（A）狭义异叶茴香（s.s）分离LCM S01的分生孢子和分生孢子;（B） 异叶异翅目异翅目分离物 LCM S03;（C） 间根属分离液相色谱-S27;（D-F）Beauveria spp. 分别分离 LCM S23、LCM S24 和 LCM S20。这里代表的所有菌株都使用CTC培养基分离。LCM S27也使用昆虫诱饵从土壤中回收。*分生孢子和分生孢子。**分生孢子链在相邻链中显示出Metarhizium孢子的特征性并排放置。黑色箭头表示圆柱形至椭圆柱形的异根分生孢子。红色箭头表示博韦里亚球形分生孢子。请点击此处查看此图的大图。
| 隔离方法 | 昆虫致病真菌* | χ2** | |
| 阳性 | 阴性 | ||
| 长廊诱饵 | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| 特纳布里奥诱饵 | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| 四氯化碳选择性培养基 | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * 仅分离出 异根 属 | |||
| ** 卡方分析，DF2。 P = 0.0013 | |||
表1：使用不同分离方法的24个土壤样品中昆虫致病真菌的发生率（阳性样品的百分比）。
补充表1：昆虫致病性真菌阳性样本的地理坐标、分离方法、代码、收集年份和土地利用类型。请按此下载此表格。
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Discussion
自然和农业土壤生境是EPF22 的典型环境，也是一个极好的天然水库。在本研究中，讨论了使用昆虫诱饵与选择性培养基分离的两种EPF方法。分离的第一步是收集土壤样本。正确储存和鉴定土壤样品至关重要。关于纬度、经度、土壤类型和生物群落的信息对于涉及流行病学、建模和地理空间主题的研究至关重要23，24.收集后，建议尽快处理样品（最好在7天内），因为这些土壤样品中分生孢子的生存能力最终会降低。使用CTC分离EPF的关键步骤包括：a）孵育后1周和2周研究CTC板（前几周是关键的，因为在后期阶段，其他真菌菌落可以缩小EPF的发育），以及b）根据其宏观形态和微观形态准确鉴定EPF菌落。为了使用昆虫诱饵进行隔离，必须保持土壤样品潮湿，但不要将其浸泡在水中。
几项研究报告的结果导致一种解释，即 M. anisopliae 在耕地土壤中比自然生态系统更常见8，25，26。这些真菌的分布和发生可能会发生差异。在本研究中，所有菌株均从耕作土壤（作物）或草原中分离出来，并且 Metarhizium spp.优于 Beauveria spp.结果表明， 栽培方法和高含量的有机质有利于土壤中腐生真菌的存在27.因此，寻求EPF的有效分离技术应考虑减少真菌污染物。
选择性人工培养基通常用于分离，因为它们易于使用，并且已被证明在分离昆虫致病真菌方面是有效的，主要是Metarhizium spp.和Beauveria spp.28。这些选择性培养基使用特定的化学物质来减少污染物的生长。在20世纪80年代和90年代，杀菌剂多定成为分离Metarhizium spp.和Beauveria spp.29，30的广泛使用的选择性培养基。虽然这些人工培养基是有效的，但一些EPF物种如Metarhizium acridum可能对dodine31敏感。这就是为什么在本研究中选择了不含多定的CTC培养基。根据Fernandes等人9，开发CTC是为了最大限度地分离天然存在的昆虫致病真菌，包括M. acridum。在分离EPF时使用选择性培养基而不是昆虫诱饵很方便，因为前者在样品处理中需要的空间更少。CTC使用的主要缺点依赖于其某些成分（即环己酰亚胺和氯霉素）有毒的事实，因此必须使用个人防护设备。
如本研究所观察到的，与人工选择性培养基相比，使用昆虫诱饵分离EPF的阳性样品比例更高，为15，32，33，34，35。在寻求新的EPF时，使用昆虫诱饵被认为是一种低成本和高效率的替代方案。尽管如此，使用昆虫诱饵而不是选择性培养基仍然存在缺点。由于使用昆虫分析的土壤量较高，因此还需要有更多的物理空间来储存样品和孵化盆。昆虫的习得也可能是一个限制。例如，在巴西， G. mellonella 没有商业上可用，因此有必要在实验室中建立一个殖民地以使用这种昆虫作为诱饵。保持昆虫群落的有益性至关重要，避免EPF的自然感染。菌落中的EPF感染会使分离结果不可靠。因此，人们必须观察殖民地中剩余的幼虫，寻找无脊椎动物的病理体征。作为替代方案，可以将具有无菌土壤的对照盆包括在研究中，以检查昆虫幼虫的健康状况。
寻找具有突出生物控制性状的新真菌分离物对于提高真菌在节肢动物害虫控制中的有效性至关重要。从土壤中分离出的真菌22可以很好地适应于在这种环境中生长，并且它们很可能具有很高的田间持久性，这是EPF在害虫控制21中成功的基本特征。因此，由于当地和时间上的一致性，当地分离的公积金可以改善对当地害虫的生物控制，增加成功的机会，并减少使用合成杀虫剂造成的环境影响。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究部分由巴西的Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior（CAPES），财务代码001，Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Rio de Janeiro（FAPERJ）（项目编号E-26/010.001993/2015）和巴西国家电子和技术委员会（CNPq）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
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