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Biology

मिट्टी के नमूनों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक को अलग करने के तरीकों की तुलना

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63353
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1,3, 1,3
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Summary

एंटोमोपैथोजेनिक कवक कालोनियों को उष्णकटिबंधीय मिट्टी के नमूनों से अलग किया जाता है, जो टेनेब्रियो चारा, गैलेरिया चारा, साथ ही साथ चयनात्मक कृत्रिम माध्यम का उपयोग करते हैं, यानी, क्लोराम्फेनिकोल, थियाबेन्डाजोल और साइक्लोहेक्सिमाइड (सीटीसी माध्यम) के साथ पूरक खमीर निकालने से समृद्ध आलू डेक्सट्रोज आगर।

Abstract

वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य मिट्टी के नमूनों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) को अलग करने के लिए कीट चारा बनाम कृत्रिम चयनात्मक माध्यम का उपयोग करने की प्रभावशीलता की तुलना करना है। मिट्टी सूक्ष्मजीवों के लिए एक समृद्ध आवास है, जिसमें ईपीएफ विशेष रूप से जेनेरा मेटारिज़ियम और ब्यूवेरिया से संबंधित है, जो आर्थ्रोपोड कीटों को विनियमित कर सकता है। कवक पर आधारित जैविक उत्पाद मुख्य रूप से कृषि आर्थ्रोपोड कीट नियंत्रण के लिए बाजार में उपलब्ध हैं। फिर भी, उच्च स्थानिक जैव विविधता के बावजूद, दुनिया भर में वाणिज्यिक जैव उत्पादों में केवल कुछ उपभेदों का उपयोग किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, 524 मिट्टी के नमूनों को आलू डेक्सट्रोज आगर पर सुसंस्कृत किया गया था, जो क्लोरैम्फेनिकोल, थियाबेन्डाज़ोल और साइक्लोहेक्सिमाइड (सीटीसी माध्यम) के साथ पूरक खमीर निकालने से समृद्ध था। कवक उपनिवेशों की वृद्धि 3 सप्ताह के लिए देखी गई थी। सभी मेटाराइज़ियम और ब्यूवेरिया ईपीएफ को जीनस स्तर पर रूपात्मक रूप से पहचाना गया था। इसके अतिरिक्त, प्रजातियों के स्तर पर कुछ आइसोलेट्स को आणविक रूप से पहचाना गया था। इन 524 मिट्टी के नमूनों में से 24 का भी कीट चारा विधि (गैलेरिया मेलोनेला और टेनेब्रियो मोलिटर) का उपयोग करके ईपीएफ घटना के लिए सर्वेक्षण किया गया था। कुल 51 ईपीएफ उपभेदों को 524 मिट्टी के नमूनों से अलग किया गया था (41 मेटारिज़ियम एसपीपी और 10 ब्यूवेरिया एसपीपी)। सभी कवक उपभेदों को या तो क्रॉपलैंड्स या घास के मैदानों से अलग किया गया था। तुलना के लिए चुने गए 24 नमूनों में से, 91.7% गैलेरिया चारा का उपयोग करके ईपीएफ के लिए सकारात्मक थे, 62.5% टेनेब्रियो चारा का उपयोग कर रहे थे, और 41.7% सीटीसी का उपयोग कर रहे थे। हमारे परिणामों ने सुझाव दिया कि मिट्टी से ईपीएफ को अलग करने के लिए कीट चारा का उपयोग करना सीटीसी माध्यम का उपयोग करने की तुलना में अधिक कुशल है। ईपीएफ की पहचान और संरक्षण के अलावा अलगाव विधियों की तुलना का जैव विविधता के बारे में ज्ञान पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। ईपीएफ संग्रह में सुधार वैज्ञानिक विकास और तकनीकी नवाचार का समर्थन करता है।

Introduction

मिट्टी कई सूक्ष्मजीवों का स्रोत है, जिसमें एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) शामिल है। कवक के इस विशेष समूह को उपनिवेश बनाने और अक्सर आर्थ्रोपोड मेजबानों को मारने की उनकी क्षमता से पहचाना जाता है, विशेष रूप से कीड़े1। अलगाव, लक्षण वर्णन, विषैले उपभेदों के चयन, और पंजीकरण के बाद, ईपीएफ को आर्थ्रोपोड-कीट नियंत्रण के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादित किया जाता है, जो उनकी किफायती प्रासंगिकता का समर्थन करताहै 2। तदनुसार, ईपीएफ के अलगाव को बायोपेस्टीसाइड के विकास के लिए पहला कदम माना जाता है। Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) और Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) आर्थ्रोपोड-कीट नियंत्रण3 के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम कवक हैं। ईपीएफ को मिट्टी से सफलतापूर्वक अलग किया गया है, दिखाई देने वाले माइकोसिस के साथ आर्थ्रोपोड्स, उपनिवेशित पौधे, और पौधे राइजोस्फीयर 4,5।

ईपीएफ का अलगाव इस विशेष समूह की विविधता, वितरण और पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है। हाल के साहित्य ने बताया कि ईपीएफ के उपयोग को कम करके आंका गया है, ईपीएफ के कई अपरंपरागत अनुप्रयोगों का हवाला देते हुए, जैसे कि पौधे के विकास में सुधार करने की उनकी क्षमता4, मिट्टी से विषाक्त संदूषकों को हटाने के लिए, और दवा6 में उपयोग किया जाना है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य कीट चारा बनाम कृत्रिम संस्कृति माध्यम 7,8,9 का उपयोग करके मिट्टी से ईपीएफ को अलग करने की दक्षता की तुलना करना है। ईपीएफ अलगाव के संदर्भ में एक कीट चारा के रूप में गैलेरिया मेलोनेला एल (लेपिडोप्टेरा: Phyralidae) का उपयोग अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है। इन लार्वा का उपयोग वैज्ञानिक समुदाय द्वारा मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन10,11 का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में दुनिया भर में किया जाता है। Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) लार्वा को वायरस से जुड़े अध्ययनों के लिए और ईपीएफ के अलगाव के लिए एक और कीट मॉडल माना जाता है क्योंकि यह कीट प्रयोगशाला में कम लागत 7,12 पर दुर्लभ होना आसान है।

संस्कृति-स्वतंत्र तरीकों जैसे कि विभिन्न प्रकार की पीसीआर तकनीकों का उपयोग करने के लिए उनके सब्सट्रेट पर ईपीएफ का पता लगाने और मापने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें मिट्टी13,14 भी शामिल है। फिर भी, इन कवक उपनिवेशों को ठीक से अलग करने के लिए, उनके सब्सट्रेट को एक चयनात्मक कृत्रिम माध्यम9 पर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, या नमूनों में मौजूद कवक को संवेदनशील कीड़ोंका उपयोग करके चारा दिया जा सकता है। एक तरफ, सीटीसी एक डोडीन-मुक्त कृत्रिम माध्यम है जिसमें क्लोरैम्फेनिकोल, थियाबेन्डाज़ोल और साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ पूरक खमीर निकालने के साथ समृद्ध आलू डेक्सट्रोज अगर होता है। इस माध्यम को फर्नांडिस एट अल द्वारा विकसित किया गया था। 9 मिट्टी से स्वाभाविक रूप से होने वाले Beauveria spp. और Metarhizium spp. की वसूली को अधिकतम करने के लिए। दूसरी ओर, जी मेलोनेला और टी मोलिटर लार्वा को भी मिट्टी से ईपीएफ आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए चारा के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। फिर भी, शर्मा एट अल.15 के अनुसार, कम अध्ययनों ने इन दो चारा कीटों के सहवर्ती उपयोग और तुलना की सूचना दी। पुर्तगाली दाख की बारियां मिट्टी Metarhizium robertsii (Metscn. टी का उपयोग करके सोरोकिन। जी मेलोनेला लार्वा की तुलना में मोलिटर लार्वा; इसके विपरीत, Beauveria basiana (Bals. -Criv.) Vuill अलगाव जी mellonella चारा15 के उपयोग से जुड़ा हुआ था. इसलिए, यह निर्णय कि ईपीएफ अलगाव विधि का उपयोग करने के लिए किस (यानी, जी मेलोनेला-चारा, टी मोलिटर-चारा या सीटीसी माध्यम) पर अध्ययन के लक्ष्य और प्रयोगशाला बुनियादी ढांचे के अनुसार विचार किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य मिट्टी के नमूनों से ईपीएफ को अलग करने के लिए कीट चारा बनाम कृत्रिम चयनात्मक माध्यम का उपयोग करने की प्रभावशीलता की तुलना करना है।

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Protocol

जैसा कि वर्तमान अध्ययन ने ब्राजील की आनुवंशिक विरासत तक पहुंच बनाई, अनुसंधान को कोड AA47CB6 के तहत आनुवंशिक विरासत और संबद्ध पारंपरिक ज्ञान (Sisgen) के प्रबंधन के लिए राष्ट्रीय प्रणाली में पंजीकृत किया गया था।

1. मिट्टी का नमूना

  1. एक छोटे से फावड़ा का उपयोग करके 10 सेमी की गहराई तक 800 ग्राम मिट्टी (घटना माध्यमिक पौधे की जड़ों के साथ या बिना) एकत्र करें। प्रयोग की शुरुआत तक उन्हें कमरे के तापमान पर पॉलीप्रोपाइलीन बैग में स्टोर करें।
    नोट: छोटी जड़ों को भी एकत्र किया जा सकता है क्योंकि ईपीएफ में राइजोस्फीयर क्षमता होने की सूचना दी जाती है। नमूनों का प्रसंस्करण जितनी तेजी से होता है, उतना ही बेहतर होता है क्योंकि फंगल बीजाणु समय के साथ कम व्यवहार्य हो सकते हैं। वर्तमान अध्ययन में, संग्रह के 7 दिनों से अधिक समय बाद नमूनों का विश्लेषण नहीं किया गया था।
  2. अक्षांश और देशांतर में एकत्र किए गए नमूनों के स्थान की पहचान करने के लिए एक जीपीएस का उपयोग करें और मिट्टी के प्रकार के अनुसार एकत्र किए गए क्षेत्र को वर्गीकृत करें (उदाहरण के लिए, घास के मैदान, देशी वर्षावन, झील के किनारे, या क्रॉपलैंड्स)।

2. entomopathogenic कवक के लिए अलगाव विधियों

  1. सीटीसी चयनात्मक कृत्रिम माध्यम का उपयोग करके अलगाव।
    1. सीटीसी माध्यम तैयार करने के लिए [आलू डेक्सट्रोज आगर प्लस खमीर निकालने (PDAY) क्लोरैम्फेनिकोल के 0.5 ग्राम / एल, थियाबेंडाज़ोल के 0.001 ग्राम / एल, और साइक्लोहेक्सिमाइड9 के 0.25 ग्राम / एल के साथ पूरक] , सभी अभिकर्मकों को व्यक्तिगत रूप से तौलें, उन्हें आसुत पानी में मिलाएं, और आटोक्लेव में माध्यम को निष्फल करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्लेट 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री प्लेटों में माध्यम के 23 मिलीलीटर।
      सावधानी: सीटीसी अभिकर्मकों का वजन करते समय, एक प्रयोगशाला कोट, मुखौटा, दस्ताने और चश्मे का उपयोग करें क्योंकि साइक्लोहेक्सिमाइड और क्लोरैम्फेनिकोल विषाक्त हैं।
    2. प्रत्येक मिट्टी के नमूने (जड़ों के साथ या बिना) के 0.35 ± 0.05 ग्राम वजन करें और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में रखें।
    3. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 30 s के लिए मिट्टी और भंवर युक्त माइक्रोट्यूब के लिए बाँझ 0.01% (vol / vol) polyoxyethylene sorbitan monooleate जलीय निलंबन के 1 mL जोड़ें।
    4. Supernatant के 50 μL निकालें और सीटीसी माध्यम के साथ पेट्री प्लेटों के केंद्र पर यह pipette. समरूप रूप से एक बाँझ Drigalski spatula (व्यास में 6 मिमी) का उपयोग कर माध्यम की सतह पर निलंबन तितर-बितर.
      नोट: प्रत्येक मिट्टी के नमूने के लिए कम से कम तीन प्रतिकृति तैयार की जानी चाहिए।
    5. अंधेरे में जलवायु कक्षों (25 ± 1 डिग्री सेल्सियस, सापेक्ष आर्द्रता ≥80%) में प्लेटों को इनक्यूबेट करें और 7, 14 और 21 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद कवक कॉलोनियों के विकास का निरीक्षण करें।
    6. ईपीएफ की मांग करने वाले कवक कालोनियों के मैक्रोमॉर्फोलॉजी और माइक्रोमॉर्फोलॉजी का निरीक्षण करें। ईपीएफ संस्कृतियों को आलू डेक्सट्रोज आगर माध्यम प्लस 0.05% क्लोराम्फेनिकोल (पीडीएसी) में स्थानांतरित करें जब तक कि शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त नहीं किया जाता है।
      नोट:: EPF कालोनियों की पहचान के लिए चरण 3 में नीचे प्रस्तुत विवरण कुंजियों का उपयोग करें।
  2. कीट चारा का उपयोग कर अलगाव
    1. सतह-कीटाणुरहित जी मेलोनेला और टी मोलिटर देर से चरण लार्वा का उपयोग करें। नसबंदी के लिए लार्वा को 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट में 1 मिनट के लिए विसर्जित करें। बाँझ पानी का उपयोग करके लार्वा को दो बार धोएं।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में चौथे चरण से जी मेलोनेला लार्वा का उपयोग किया गया था। टी मोलिटर लार्वा चरणों को मानकीकृत नहीं किया गया था।
    2. चारा इकट्ठा करने के लिए प्लास्टिक के बर्तनों का उपयोग करें। प्रत्येक प्लास्टिक के बर्तन में 250 ग्राम एकत्र की गई मिट्टी जोड़ें (98 मिमी चौड़ाई x 47 मिमी ऊंचाई x 142 मिमी लंबाई)। प्रत्येक प्रजाति के 15 लार्वा (टी मोलिटर और जी मेलोनेला) को अलग करें और प्रति प्लास्टिक पॉट पांच लार्वा जमा करें। बर्तनों को 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और सापेक्ष आर्द्रता को अंधेरे में 80% ≥ रखें।
      नोट: वेंटिलेशन की अनुमति देने के लिए पॉट ढक्कन में 10 छोटे छेद (व्यास में 2 मिमी) ड्रिल करें। छेद ड्रिल करने के लिए एक तेज गर्म लोहे के उपकरण का उपयोग किया जा सकता है।
    3. मिट्टी के साथ लार्वा के अधिकतम संपर्क की अनुमति देने के लिए हर दूसरे दिन मिट्टी को homogenize।
      नोट: नमी लार्वा के फंगल संक्रमण का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है। मिट्टी में नमी बनाए रखने के लिए, जब भी आवश्यक हो मिट्टी की सतह पर बाँझ आसुत जल का छिड़काव करें। मिट्टी के नमूने को पानी में न भिगोएं।
    4. मृत कीड़ों की मांग करने वाले बर्तनों का दैनिक विश्लेषण करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़े संक्रमित नहीं हैं, अकशेरुकी रोग संबंधी संकेतों के लिए कॉलोनी में दैनिक रूप से शेष लार्वा का निरीक्षण करें। एक विकल्प के रूप में, कीट लार्वा की स्वास्थ्य स्थिति की जांच करने के लिए बाँझ मिट्टी के साथ नियंत्रण बर्तनों को अध्ययन में शामिल किया जा सकता है।
    5. मृत कीड़ों को निकालें और सतही रूप से उन्हें 1 मिनट के लिए 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ निष्फल करें। बाँझ कीड़ों को एक आर्द्र कक्ष (सापेक्ष आर्द्रता ≥ 80%) में 7 दिनों के लिए 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि एंटोमोपैथोजेनिक कवक (माइकोसिस) के बाहरीकरण का पक्ष लिया जा सके।
    6. माइकोसिस पर, कीट की सतह से कोनिडिया की कटाई करें। एक स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत पीडीएसी माध्यम पर conidia जगह करने के लिए एक सूक्ष्मजीवविज्ञानी पाश का उपयोग करें। एक विकल्प के रूप में, पूरे संक्रमित लार्वा को पीडीएसी माध्यम पर रखें। 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस और सापेक्ष आर्द्रता 80% ≥ जलवायु कक्ष में संस्कृति प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    7. ईपीएफ की पहचान की पुष्टि करने के लिए प्लेटों पर फंगल कॉलोनियों के मैक्रोमॉर्फोलॉजी और माइक्रोमॉर्फोलॉजी का निरीक्षण करें। PDAC पर culturing दोहराएँ जब तक शुद्ध कवक उपनिवेशों प्राप्त कर रहे हैं.
      नोट:: EPF कालोनियों की पहचान के लिए चरण 3 में नीचे प्रस्तुत विवरण कुंजियों का उपयोग करें।

3. ईपीएफ की पहचान (Metarhizium spp. और Beauveria spp.)

  1. प्लेटों पर कवक संस्कृतियों की मैक्रोमोर्फोलॉजिकल विशेषताओं का विश्लेषण करें (यानी, कालोनियों की सतह और रिवर्स, उनके आकार, किनारे, विकास दर, रंग, बनावट, डिफ्यूसिबल पिगमेंट, एक्सुडेट्स और एरियल कोनिडिया) 14 दिनों के बाद 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस और सापेक्ष आर्द्रता 80% ≥ सापेक्ष आर्द्रता।
  2. स्लाइड संस्कृतियों (माइक्रोकल्चर तकनीक) 16 के लिए स्लाइड संस्कृतियों (माइक्रोकल्चर तकनीक) 16 के लिए 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर और सापेक्ष आर्द्रता ≥ 80% और लैक्टोफेनोल नीले रंग के साथ दाग सूक्ष्म विशेषताओं का निरीक्षण करने के लिए (यानी, कोनिडिया की व्यवस्था, कोनिडियोफोर, आकार, और कोनिडिया के आकार) 17,18,19,20।
  3. ईपीएफ पहचान की पुष्टि करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 400x पर माइक्रोस्कोपिक कवक संरचनाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: EPF के लिए रूपात्मक कुंजियों Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., और Humber 17,18,19,20 द्वारा रिपोर्ट में वर्णित हैं। कवक उपनिवेशों के मैक्रो और माइक्रोमॉर्फोलॉजी जीनस स्तर पर फिलामेंटस कवक की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे लगातार मानदंड हैं। ईपीएफ के जीनस के आधार पर, ये रूपात्मक विशेषताएं बदल जाएंगी। हंबर20 कवक entomopathogens के प्रमुख जेनेरा के लिए एक पहचान कुंजी प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, मेटारिज़ियम एसपीपी कॉलोनियां आमतौर पर परिपत्र, पाउडर, हरे रंग के अलग-अलग रंगों को प्रदर्शित करती हैं, और एक्सूडेट पेश कर सकती हैं। माइक्रोस्कोपिक रूप से, इन उपनिवेशों में व्यापक रूप से शाखित, घनी रूप से अंतर्निहित कोनिडियोफोर पर एपिकल कोशिकाएं होती हैं, जो एक कॉम्पैक्ट हाइमेनियम बनाती हैं, और समानांतर श्रृंखलाओं में अंडाकार कोनिडिओडिया के लिए बेलनाकार स्तंभ या प्लेट जैसे द्रव्यमान बनाती हैं। Beauveria spp. उपनिवेश आमतौर पर सफेद, पाउडर, या कपास की तरह होते हैं। वे एक फैला हुआ बेसल भाग के साथ शंकुजन कोशिकाओं को प्रदर्शित करते हैं जो एक ज़िगज़ैग दिशा में एपिकली रूप से विस्तारित होता है। ब्यूवेरिया कोनिडियोफोर ग्लोब के आकार के कोनिडिया के घने समूह बनाते हैं। प्रजातियों के स्तर पर ईपीएफ की पहचान के लिए आणविक विश्लेषण की आवश्यकता होती है।
  4. प्रजातियों के स्तर पर टैक्सोनोमिक पहचान के लिए आइसोलेट्स पर आणविक विश्लेषण करें। इस अध्ययन में अलग-थलग किए गए ईपीएफ उपभेदों के लिए, अर्थात्, मेटारिज़ियम एसपीपी और ब्यूवेरिया एसपीपी, बिस्कॉफ एट अल.17 और रेहनर एट अल.18 की रिपोर्टों के आधार पर आणविक विश्लेषण करते हैं।
  5. ईपीएफ होने के लिए आइसोलेट्स की पुष्टि करने के बाद, फंगल संस्कृतियों के संग्रह में आइसोलेट्स जमा करें। वर्तमान अध्ययन में, आइसोलेट्स को रियो डी जनेरियो के संघीय ग्रामीण विश्वविद्यालय में माइक्रोबियल कंट्रोल (एलसीएम) की प्रयोगशाला से एंटोमोपैथोजेनिक फंगल संस्कृतियों के संग्रह में जमा किया गया था।

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Representative Results

घास के मैदान से कुल 524 मिट्टी के नमूने एकत्र किए गए थे: पशुधन चरागाह (165 नमूने), देशी उष्णकटिबंधीय वन (90 नमूने), झील के किनारे (42 नमूने), और रियो डी जनेरियो राज्य, ब्राजील में 2015 और 2018 के बीच खेती / क्रॉपलैंड (227 नमूने)। ईपीएफ के लिए सकारात्मक नमूनों के भौगोलिक निर्देशांकों के ब्यौरे अनुपूरक सारणी 1 में दिए गए हैं।

524 मिट्टी के नमूनों में से, 500 नमूनों का विश्लेषण केवल सीटीसी माध्यम का उपयोग करके किया गया था, और 24 नमूनों को अलगाव के तीन रूपों (गैलेरिया-चारा, टेनेब्रियो-चारा, और चयनात्मक सीटीसी संस्कृति माध्यम) का उपयोग करके सहवर्ती रूप से विश्लेषण किया गया था, इसलिए इन तरीकों की सापेक्ष दक्षता का मूल्यांकन किया जा सकता है। कुल 51 ईपीएफ उपभेदों को 524 नमूनों (41 मेटारिज़ियम एसपीपी और 10 ब्यूवेरिया एसपीपी) से अलग किया गया था। (चित्र 1)। कुछ आइसोलेट्स की माइक्रोमोर्फोलॉजिकल विशेषताओं को चित्र 2 में दिखाया गया है। सभी कवक उपभेदों को घास के मैदान या क्रॉपलैंड से अलग किया गया था (पूरक तालिका 1)। परिणामों से पता चला है कि Metarhizium spp. Beauveria spp की तुलना में अधिक प्रचलित है। मेटारिज़ियम आइसोलेट्स (एलसीएम एस01 से एलसीएम एस09) के नौ को ef1-a (यूकेरियोटिक अनुवाद बढ़ाव कारक 1-अल्फा) जीन21 का उपयोग करके आणविक रूप से पहचाना गया था। इनमें से, सात आइसोलेट्स (LCM S01-LCM S06 और LCM S08) को Metarhizium anisopliae sensu stricto के रूप में पहचाना गया था, जबकि दो आइसोलेट्स (LCM S07 और LCM S09) को Metarhizium pingshaense21 के रूप में पहचाना गया था।

अलगाव के तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके अध्ययन किए गए 24 मिट्टी के नमूनों में ईपीएफ (सकारात्मक ईपीएफ नमूनों का%) की घटना को तालिका 1 में दिखाया गया है। ची-स्क्वायर परीक्षण द्वारा ईपीएफ की वसूली दरों का विश्लेषण किया गया था। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, गैलेरिया चारा ईपीएफ (सकारात्मक नमूनों का 91.7% (22/24) ) के अलगाव में अधिक कुशल साबित हुआ, इसके बाद टी मोलिटर चारा (ईपीएफ सकारात्मक नमूनों का 62.5% (15/24) ) और सीटीसी माध्यम (ईपीएफ सकारात्मक नमूनों का 41.7% (14/24) था। इन 24 मिट्टी के नमूनों ने Beauveria spp., लेकिन केवल Metarhizium की कोई वसूली नहीं दिखाई।

Figure 1
चित्रा 1: मिट्टी के नमूनों से अलग उपभेदों के Entomopathogenic कवक उपनिवेशों. कालोनियों की खेती सीटीसी कृत्रिम माध्यम पर की जाती थी। (1) शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने से पहले सीटीसी चयनात्मक माध्यम पर इनक्यूबेशन के 14 दिन बाद मिट्टी के नमूनों से कवक कालोनियों का प्रदर्शन करने वाली पेट्री प्लेट; (2-42) शुद्ध मेटारिज़ियम एसपीपी कालोनियों; (43-52) शुद्ध Beauveria spp. उपनिवेशों. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मिट्टी के नमूनों से अलग entomopathogenic कवक की माइक्रोमोर्फोलॉजिकल विशेषताएं। कालोनियों को आलू डेक्सट्रोज आगर पर 3 दिनों के लिए 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस और सापेक्ष आर्द्रता ≥ 80% पर इनक्यूबेट किया गया था। माइक्रोस्कोप स्लाइड लैक्टोफेनोल नीले समाधान के साथ दाग दिया गया था। छवियों को conidiophores और (ए) Metarhizium anisopliae sensu stricto (एसएस) अलग LCM S01 के conidias से पता चलता है; (बी) मेटारिज़ियम एनिसोप्लिया एस.एस. एलसीएम एस 03 को अलग करें; (C) मेटारिज़ियम एसपी एलसीएम एस 27 को अलग करें; (D-F) Beauveria spp. क्रमशः LCM S23, LCM S24, और LCM S20 को अलग करता है। यहां प्रतिनिधित्व किए गए सभी उपभेदों को सीटीसी माध्यम का उपयोग करके अलग किया गया था। एलसीएम एस 27 को भी कीट चारा का उपयोग करके मिट्टी से बरामद किया गया था। * Conidiophores और conidia. ** कोनिडियाल चेन आसन्न श्रृंखलाओं में मेटारिज़ियम बीजाणुओं की विशेषता साइड-बाय-साइड प्लेसमेंट दिखाते हैं। काले तीर मेटारिज़ियम बेलनाकार से अंडाकार कोनिडिया को इंगित करते हैं। लाल तीर Beauveria ग्लोब के आकार के conidia इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अलगाव की विधि एंटोमोपैथोजेनिक कवक * π2**
पॉज़िटीव नेगटिव
गैलेरिया-चारा 91.7% (22/24) 8.3% (2/24) 13.4
टेनेब्रियो-चारा 62.5% (15/24) 37.2% (9/24)
CTC चयनात्मक माध्यम 41.7% (10/24) 58.3% (14/24)
* केवल Metarhizium spp. अलग कर रहे थे
** ची वर्ग विश्लेषण, डीएफ2. P = 0.0013

तालिका 1: विभिन्न अलगाव विधियों का उपयोग करके 24 मिट्टी के नमूनों में एंटोमोपैथोजेनिक कवक (सकारात्मक नमूनों का%) की घटना।

अनुपूरक तालिका 1: भौगोलिक निर्देशांक, अलगाव विधि, कोड, संग्रह का वर्ष, और एंटोमोपैथोजेनिक कवक के लिए सकारात्मक नमूनों के भूमि-उपयोग प्रकार। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्राकृतिक और कृषि मिट्टी के आवास ईपीएफ22 और एक उत्कृष्ट प्राकृतिक जलाशय के लिए विशिष्ट वातावरण हैं। वर्तमान अध्ययन में, कीट चारा बनाम चयनात्मक माध्यम का उपयोग करके ईपीएफ अलगाव के दो तरीकों को संबोधित किया गया था। अलगाव के लिए पहला कदम मिट्टी के नमूनों का संग्रह है। मिट्टी के नमूनों का उचित भंडारण और पहचान महत्वपूर्ण है। अक्षांश, देशांतर, मिट्टी के प्रकार और बायोम पर जानकारी महामारी विज्ञान, मॉडलिंग और भू-स्थानिक विषयों23,24 से जुड़े अध्ययनों के लिए आवश्यक है। संग्रह के बाद, यह सिफारिश की जाती है कि नमूनों को जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाता है (अधिमानतः 7 दिनों के भीतर) क्योंकि इन मिट्टी के नमूनों में कोनिडिया की व्यवहार्यता अंततः कम हो सकती है। सीटीसी का उपयोग करके ईपीएफ अलगाव में महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं: ए) इनक्यूबेशन के बाद 1 और 2 सप्ताह बाद सीटीसी प्लेटों की जांच (पहले सप्ताह महत्वपूर्ण हैं क्योंकि, बाद के चरणों में, अन्य कवक उपनिवेश ईपीएफ विकास को संकीर्ण कर सकते हैं), और बी) सटीक रूप से ईपीएफ कॉलोनियों की पहचान करना उनके मैक्रोमॉर्फोलॉजी और माइक्रोमॉर्फोलॉजी के आधार पर। कीट चारा का उपयोग करके अलगाव के लिए, मिट्टी के नमूने को आर्द्र रखना आवश्यक है लेकिन इसे पानी में नहीं भिगोना चाहिए।

कई अध्ययनों द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणामों ने एक व्याख्या को जन्म दिया है कि एम एनिसोप्लिया प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र 8,25,26 की तुलना में खेती की गई मिट्टी में अधिक आम है। इन कवक के वितरण और घटना में अंतर हो सकता है। वर्तमान अध्ययन में, सभी उपभेदों को या तो खेती की गई मिट्टी (फसलों) या घास के मैदानों से अलग किया गया था, और ब्यूवेरिया एसपीपी पर मेटारिज़ियम एसपीपी की प्रबलता थी। यह सुझाव दिया जाता है कि खेती की प्रथाओं और कार्बनिक पदार्थों की उच्च सामग्री मिट्टी में सैप्रोफाइटिक कवक की उपस्थिति का पक्षलेती है। तदनुसार, ईपीएफ की मांग करने वाली प्रभावी अलगाव तकनीकों को फंगल संदूषकों को कम करने पर विचार करना चाहिए।

चयनात्मक कृत्रिम मीडिया आमतौर पर अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि वे उपयोग करने में आसान होते हैं और एंटोमोपैथोजेनिक कवक को अलग करने में कुशल साबित होते हैं, मुख्य रूप से मेटाराइज़ियम एसपीपी और ब्यूवेरिया एसपीपी.28। ये चयनात्मक मीडिया संदूषकों के विकास को कम करने के लिए विशिष्ट रसायनों का उपयोग करते हैं। 1980 और 1990 के दशक में, कवकनाशी डोडिन मेटारिज़ियम एसपीपी और ब्यूवेरिया एसपीपी.29,30 को अलग करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला चयनात्मक माध्यम बन गया। हालांकि ये कृत्रिम मीडिया प्रभावी हैं, कुछ ईपीएफ प्रजातियां जैसे मेटारिज़ियम एक्रिडम डोडिन31 के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती हैं। यही कारण है कि वर्तमान अध्ययन में डोडिन-मुक्त सीटीसी माध्यम को चुना गया था। फर्नांडिस एट अल.9 के अनुसार, सीटीसी को स्वाभाविक रूप से होने वाले एंटोमोपैथोजेनिक कवक के अलगाव को अधिकतम करने के लिए विकसित किया गया था, जिसमें एम. एक्रिडम भी शामिल है। ईपीएफ के अलगाव में कीट चारा के बजाय एक चयनात्मक माध्यम का उपयोग करना सुविधाजनक है क्योंकि पूर्व को नमूना प्रसंस्करण में कम स्थान की आवश्यकता होती है। सीटीसी उपयोग में मुख्य नुकसान इस तथ्य पर निर्भर करता है कि इसके कुछ घटक (यानी, साइक्लोहेक्सिमाइड और क्लोरैम्फेनिकोल) विषाक्त हैं, इसलिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग अनिवार्य है।

जैसा कि वर्तमान अध्ययन में देखा गया है, ईपीएफ15,32,33,34,35 के अलगाव के लिए कृत्रिम चयनात्मक मीडिया की तुलना में कीट चारा के साथ सकारात्मक नमूनों का एक उच्च प्रतिशत बताया गया है। कीट चारा का उपयोग नए ईपीएफ की खोज में एक कम लागत और उच्च दक्षता विकल्प माना जाता है। इसके बावजूद, चयनात्मक मीडिया पर कीट चारा के उपयोग से जुड़े नुकसान हैं। चूंकि कीड़ों का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए मिट्टी की मात्रा अधिक है, इसलिए नमूनों को स्टोर करने और बर्तनों को इनक्यूबेट करने के लिए अधिक भौतिक स्थान होना भी आवश्यक है। कीड़ों का अधिग्रहण भी एक सीमा हो सकती है। ब्राजील में, उदाहरण के लिए, जी मेलोनेला व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, इसलिए इस कीट को चारा के रूप में उपयोग करने के लिए प्रयोगशाला में एक कॉलोनी स्थापित करना आवश्यक है। ईपीएफ द्वारा प्राकृतिक संक्रमण से बचने के लिए कीड़ों की कॉलोनियों की शिथिलता को बनाए रखना आवश्यक है। कॉलोनी में एक ईपीएफ संक्रमण अलगाव परिणामों को अविश्वसनीय बना सकता है। इसलिए, किसी को अकशेरुकी रोग संबंधी संकेतों की मांग करने वाले कॉलोनी में शेष लार्वा का निरीक्षण करना होगा। एक विकल्प के रूप में, कीट लार्वा की स्वास्थ्य स्थिति की जांच करने के लिए बाँझ मिट्टी के साथ नियंत्रण बर्तनों को अध्ययन में शामिल किया जा सकता है।

बकाया biocontrol लक्षणों के साथ नए कवक आइसोलेट्स की मांग आर्थ्रोपोड-कीट नियंत्रण में कवक की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। मिट्टी से अलग कवक को इस वातावरण में बढ़ने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है22, और उनके पास उच्च क्षेत्र दृढ़ता होने की संभावना है, जो कीट नियंत्रण21 में सफल ईपीएफ की एक आवश्यक विशेषता है। तदनुसार, स्थानीय रूप से अलग-थलग ईपीएफ स्थानीय कीटों के जैविक नियंत्रण में सुधार कर सकता है क्योंकि उनकी भौगोलिक और अस्थायी अनुरूपता, सफलता की संभावना बढ़ जाती है और सिंथेटिक कीटनाशकों के आवेदन के कारण अन्यथा पर्यावरणीय प्रभावों को कम करती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को ब्राजील से Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), वित्त कोड 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (परियोजना संख्या E-26/010.001993/2015) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था, और Conselho Nacional de DeSnolgico (Conselho Nacional de DeSnogico)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave Phoenix Luferco 9451
Biosafety cabinet Airstream ESCO AC2-4E3
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Climate chambers Eletrolab EL212/3
Coverslip RBR 3871
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Drigalski spatula Marienfeld 1800024
GPS app Geolocation app 2.1.2005
Lactophenol blue solution Sigma-Aldrich 61335
Microscope Zeiss Axio star plus 1169 149
Microscope camera Zeiss Axiocam 105 color 426555-0000-000
Microscope softwere Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide Olen k5-7105-1
Microtube BRAND Z336769-1PAK
Petri plates Kasvi K30-6015
Pipette tip Vatten VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette HTL - Labmatepro LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots Prafesta descartáveis 8314
Polypropylene bags Extrusa 38034273/5561
Potato dextrose agar Kasvi K25-1022
Prism software 9.1.2 Graph Pad
Shovel Tramontina 77907009
Tenebrio mollitor Safari QP98DLZ36
Thiabendazole Sigma-Aldrich T8904
Tween 80 Vetec 60REAVET003662
Vortex Biomixer QL-901
Yeast extract Kasvi K25-1702

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जीव विज्ञान अंक 179 Metarhizium Beauveria मिट्टी माइक्रोबायोटा कीट चारा जैविक नियंत्रण bioprospecting Tenebrio Galleria चयनात्मक माध्यम
मिट्टी के नमूनों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक को अलग करने के तरीकों की तुलना
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Correa, T. A., Santos, F. S., Camargo, M. G., Quinelato, S., Bittencourt, V. R. E. P., Golo, P. S. Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples. J. Vis. Exp. (179), e63353, doi:10.3791/63353 (2022).

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