Summary
Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.
Abstract
Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben zu vergleichen. Der Boden ist ein reicher Lebensraum für Mikroorganismen, darunter EPF, die insbesondere zu den Gattungen Metarhizium und Beauveria gehören, die Arthropodenschädlinge regulieren können. Biologische Produkte auf der Basis von Pilzen sind auf dem Markt hauptsächlich für die Schädlingsbekämpfung von landwirtschaftlichen Arthropoden erhältlich. Trotz der hohen endemischen Biodiversität werden weltweit nur wenige Stämme in kommerziellen Bioprodukten verwendet. In der vorliegenden Studie wurden 524 Bodenproben auf Kartoffeldextrose-Agar kultiviert, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium). Das Wachstum von Pilzkolonien wurde 3 Wochen lang beobachtet. Alle Metarhizium und Beauveria EPF wurden morphologisch auf Gattungsebene identifiziert. Darüber hinaus wurden einige Isolate molekular auf Speziesebene identifiziert. Vierundzwanzig dieser 524 Bodenproben wurden auch mit der Insektenködermethode (Galleria mellonella und Tenebrio molitor) auf EPF-Vorkommen untersucht. Aus den 524 Bodenproben wurden insgesamt 51 EPF-Stämme isoliert (41 Metarhizium spp. und 10 Beauveria spp.). Alle Pilzstämme wurden entweder aus Ackerland oder Grasland isoliert. Von den 24 zum Vergleich ausgewählten Proben waren 91,7% positiv auf EPF mit Galleria-Ködern , 62,5% mit Tenebrio-Köder und 41,7% mit CTC. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung von Insektenködern zur Isolierung der EPF aus dem Boden effizienter ist als die Verwendung des CTC-Mediums. Der Vergleich von Isolationsmethoden neben der Identifizierung und Konservierung von EPF wirkt sich positiv auf das Wissen über Biodiversität aus. Die Verbesserung der EPF-Sammlung unterstützt die wissenschaftliche Entwicklung und technologische Innovation.
Introduction
Der Boden ist die Quelle mehrerer Mikroorganismen, einschließlich entomopathogener Pilze (EPF). Diese besondere Gruppe von Pilzen wird durch ihre Fähigkeit erkannt, Arthropodenwirte, insbesondere Insekten, zu besiedeln und oft zu töten1. Nach Isolierung, Charakterisierung, Auswahl virulenter Stämme und Registrierung werden EPF für die Arthropoden-Schädlingsbekämpfung in Massenproduktion hergestellt, was ihre wirtschaftliche Relevanzunterstützt 2. Dementsprechend gilt die Isolierung von EPF als erster Schritt zur Entwicklung eines Biopestizids. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) und Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sind die häufigsten Pilze, die zur Arthropoden-Schädlingsbekämpfungeingesetzt werden 3. EPF wurden erfolgreich aus dem Boden, Arthropoden mit sichtbarer Mykose, kolonisierten Pflanzen und der Pflanzenrhizosphäre 4,5 isoliert.
Die Isolierung von EPF kann auch nützlich sein, um die Vielfalt, Verteilung und Ökologie dieser speziellen Gruppe zu untersuchen. Jüngste Literatur berichtete, dass die Verwendung von EPF unterschätzt wird, und zitierte mehrere unkonventionelle Anwendungen von EPF, wie ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu verbessern4, toxische Verunreinigungen aus dem Boden zu entfernen und in der Medizin verwendetzu werden 6. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Effizienz der Isolierung von EPF aus dem Boden mit Insektenködern im Vergleich zum künstlichen Kulturmedium 7,8,9 zu vergleichen. Die Verwendung von Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) als Insektenköder im Rahmen der EPF-Isolierung wurde gut angenommen. Diese Larven werden weltweit von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als experimentelles Modell zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionenverwendet 10,11. Die Larve Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) gilt als ein weiteres Insektenmodell für Studien mit Virulenz und zur Isolierung von EPF, da dieses Insekt im Labor zu geringen Kosten leicht bis selten ist 7,12.
Kulturunabhängige Methoden wie die Verwendung einer Vielzahl von PCR-Techniken können angewendet werden, um EPF auf ihren Substraten, einschließlich Boden13,14, nachzuweisen und zu quantifizieren. Um diese Pilzkolonien jedoch richtig zu isolieren, sollte ihr Substrat auf ein selektives künstliches Medium9 kultiviert werden, oder die in den Proben vorhandenen Pilze können mit empfindlichen Insekten15 geködert werden. Auf der einen Seite ist CTC ein dodinfreies künstliches Medium, das aus Kartoffeldextrose-Agar besteht, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid. Dieses Medium wurde von Fernandes et al. entwickelt. 9 zur Maximierung der Erholung von natürlich vorkommenden Beauveria spp. und Metarhizium spp. aus dem Boden. Auf der anderen Seite können G. mellonella und T. molitor Larven auch erfolgreich als Köder verwendet werden, um EPF-Isolate aus dem Boden zu gewinnen. Laut Sharma et al.15 berichteten jedoch weniger Studien über die gleichzeitige Verwendung und den Vergleich dieser beiden Köderinsekten. Portugiesische Weinbergsböden zeigten signifikante Gewinnungsraten von Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin mit T. Molitorlarven im Vergleich zu G. mellonella Larven; im Gegensatz dazu Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Die Vivill-Isolierung war mit der Verwendung von G. mellonella-Ködern 15 verbunden. Daher sollte die Entscheidung, welche EPF-Isolationsmethode verwendet werden soll (d. h. G. mellonella-Köder, T. molitor-köder oder CTC-Medium), entsprechend dem Ziel der Studie und der Laborinfrastruktur berücksichtigt werden. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung von EPF aus Bodenproben zu vergleichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Als die vorliegende Studie auf das brasilianische genetische Erbe zugriff, wurde die Forschung beim National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) unter dem Code AA47CB6 registriert.
1. Bodenprobenahme
- Sammeln Sie 800 g Erde (mit oder ohne einfallende sekundäre Pflanzenwurzeln) bis zu einer Tiefe von 10 cm mit einer kleinen Schaufel. Lagern Sie sie in Polypropylenbeuteln bei Raumtemperatur bis zum Beginn des Experiments.
HINWEIS: Kleine Wurzeln können auch gesammelt werden, da EPF über Rhizosphärenkompetenz verfügt. Je schneller die Verarbeitung der Proben ist, desto besser, da die Pilzsporen im Laufe der Zeit möglicherweise weniger lebensfähig sind. In der vorliegenden Studie wurden Proben nicht mehr als 7 Tage nach der Entnahme analysiert. - Verwenden Sie ein GPS, um den Standort der gesammelten Proben in Breiten- und Längengrad zu identifizieren und das gesammelte Gebiet nach der Art des Bodens zu klassifizieren (z. B. Grasland, einheimischer Regenwald, Seeufer oder Ackerland).
2. Isolationsverfahren für entomopathogene Pilze
- Isolierung mit CTC-selektivem künstlichem Medium.
- Zur Herstellung des CTC-Mediums [Kartoffeldextrose-Agar plus Hefeextrakt (PDAY), ergänzt mit 0,5 g/L Chloramphenicol, 0,001 g/L Thiabendazol und 0,25 g/L Cycloheximid9], wiegen Sie alle Reagenzien einzeln, mischen Sie sie in destilliertem Wasser und sterilisieren Sie das Medium im Autoklaven. In einer Biosicherheitswerkbank werden 23 mL des Mediums in 60 mm x 15 mm Petriplatten geklebt.
VORSICHT: Verwenden Sie beim Wiegen von CTC-Reagenzien einen Laborkittel, eine Maske, Handschuhe und eine Schutzbrille, da Cycloheximid und Chloramphenicol giftig sind. - Von jeder Bodenprobe (mit oder ohne Wurzeln) werden 0,35 ± 0,05 g gewogen und in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gegeben.
- In einer Biosicherheitskabine 1 ml sterile 0,01% (vol/vol) Polyoxyethylensorbitanmonooleat-wässrige Suspension für 30 s in das Mikroröhrchen geben, das Boden und Wirbel enthält.
- Entfernen Sie 50 μL des Überstands und pipettieren Sie ihn mit CTC-Medium auf die Mitte der Petriplatten. Dispergieren Sie die Suspensionen homogen auf die Oberfläche des Mediums mit einem sterilen Drigalski-Spatel (6 mm Durchmesser).
HINWEIS: Für jede Bodenprobe sollten mindestens drei Replikate vorbereitet werden. - Inkubieren Sie die Platten in Klimakammern (25 ± 1 °C, relative Luftfeuchtigkeit ≥80%) im Dunkeln und beobachten Sie das Wachstum von Pilzkolonien nach 7, 14 und 21 Tagen Inkubation.
- Beobachten Sie die Makromorphologie und Mikromorphologie der Pilzkolonien, die EPF suchen. Die EPF-Kulturen werden auf Kartoffeldextrose-Agar-Medium plus 0,05% Chloramphenicol (PDAC) übertragen, bis Reinkulturen erhalten sind.
HINWEIS: Verwenden Sie die unten in Schritt 3 dargestellten Beschreibungsschlüssel zur Identifizierung von EPF-Kolonien.
- Zur Herstellung des CTC-Mediums [Kartoffeldextrose-Agar plus Hefeextrakt (PDAY), ergänzt mit 0,5 g/L Chloramphenicol, 0,001 g/L Thiabendazol und 0,25 g/L Cycloheximid9], wiegen Sie alle Reagenzien einzeln, mischen Sie sie in destilliertem Wasser und sterilisieren Sie das Medium im Autoklaven. In einer Biosicherheitswerkbank werden 23 mL des Mediums in 60 mm x 15 mm Petriplatten geklebt.
- Isolierung mit Insektenködern
- Verwenden Sie oberflächendesinfizierte Larven von G. mellonella und T. molitor. Tauchen Sie die Larven für 1 min zur Sterilisation in 0,5% Natriumhypochlorit. Waschen Sie die Larven zweimal mit sterilem Wasser.
HINWEIS: G. mellonella Larven aus dem vierten Stadium wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die Larvenstadien von T. molitor waren nicht standardisiert. - Verwenden Sie Plastiktöpfe, um die Köder zusammenzubauen. Geben Sie 250 g gesammelte Erde zu jedem Kunststofftopf (98 mm Breite x 47 mm Höhe x 142 mm Länge). Trennen Sie 15 Larven jeder Art (T. molitor und G. mellonella) und deponieren Sie fünf Larven pro Plastiktopf. Lagern Sie die Töpfe bei 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit ≥ 80% im Dunkeln.
HINWEIS: Bohren Sie 10 kleine Löcher (2 mm Durchmesser) in die Topfdeckel, um eine Belüftung zu ermöglichen. Ein scharf erhitztes Eisengerät kann verwendet werden, um die Löcher zu bohren. - Homogenisieren Sie den Boden jeden zweiten Tag, um maximalen Kontakt der Larven mit dem Boden zu ermöglichen.
HINWEIS: Feuchtigkeit ist wichtig, um die Pilzinfektion von Larven zu unterstützen. Um die Feuchtigkeit im Boden zu erhalten, sprühen Sie steriles destilliertes Wasser bei Bedarf auf die Bodenoberfläche. Weichen Sie die Bodenprobe nicht in Wasser ein. - Analysiere die Töpfe täglich auf der Suche nach toten Insekten.
HINWEIS: Beobachten Sie die verbleibenden Larven in der Kolonie täglich auf pathologische Anzeichen von Wirbellosen, um sicherzustellen, dass die Insekten nicht infiziert sind. Alternativ können Kontrolltöpfe mit steriler Erde in die Studie einbezogen werden, um den Gesundheitszustand der Insektenlarven zu überprüfen. - Entfernen Sie tote Insekten und sterilisieren Sie sie oberflächlich mit 0,5% Natriumhypochlorit für 1 min. Legen Sie die sterilen Insekten 7 Tage lang in eine feuchte Kammer (relative Luftfeuchtigkeit ≥ 80%) bei 25 ± 1 ° C, um die Exteriorisierung entomopathogener Pilze (Mykose) zu begünstigen.
- Bei Mykose die Konidien von der Insektenoberfläche ernten. Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um die Konidien auf PDAC-Medium unter einem stereoskopischen Mikroskop zu platzieren. Als Alternative legen Sie die gesamte infizierte Larve auf das PDAC-Medium. Inkubieren Sie die Kulturplatten in einer Klimakammer bei 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit ≥ 80%.
- Beobachten Sie die Makromorphologie und Mikromorphologie der Pilzkolonien auf den Platten, um die Identität der EPF zu bestätigen. Wiederholen Sie die Kultivierung auf PDAC, bis reine Pilzkolonien erhalten sind.
HINWEIS: Verwenden Sie die unten in Schritt 3 dargestellten Beschreibungsschlüssel zur Identifizierung von EPF-Kolonien.
- Verwenden Sie oberflächendesinfizierte Larven von G. mellonella und T. molitor. Tauchen Sie die Larven für 1 min zur Sterilisation in 0,5% Natriumhypochlorit. Waschen Sie die Larven zweimal mit sterilem Wasser.
3. Identifizierung von EPF (Metarhizium spp. und Beauveria spp.)
- Analysieren Sie die makromorphologischen Eigenschaften der Pilzkulturen auf den Platten (d. H. Oberfläche und Rückseite der Kolonien, ihre Form, Kante, Wachstumsrate, Farbe, Textur, diffusibles Pigment, Exsudate und Luftkonidien) nach 14 Tagen bei 25 ± 1 ° C und relativer Luftfeuchtigkeit ≥ 80%.
- Übertragen Sie die Luftkonidien für 3 Tage bei 25 ± 1 °C und relativer Luftfeuchtigkeit ≥ 80% auf Objektträgerkulturen (Mikrokulturtechnik)16 und färben Sie sie mit Lactophenolblau, um die mikroskopischen Merkmale (d. H. Anordnung der Konidien, Konidiophoren, Form und Größe der Konidien) zu beobachten)17,18,19,20.
- Beobachten Sie die mikroskopisch kleinen Pilzstrukturen bei 400x mit einem optischen Mikroskop, um die EPF-Identifizierung zu bestätigen.
HINWEIS: Morphologische Schlüssel für EPF werden in den Berichten von Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. und Humber17,18,19,20 beschrieben. Die Makro- und Mikromorphologie von Pilzkolonien sind die häufigsten Kriterien, um fadenförmige Pilze auf Gattungsebene zu identifizieren. Je nach Gattung der EPF ändern sich diese morphologischen Eigenschaften. Humber20 stellt einen Identifizierungsschlüssel für die wichtigsten Gattungen pilzlicher Entomopathogene dar. Metarhizium spp. Kolonien zum Beispiel sind normalerweise kreisförmig, pudrig, weisen unterschiedliche Grüntöne auf und können Exsudat aufweisen. Mikroskopisch gesehen haben diese Kolonien konidiogene Zellen, die auf breit verzweigten, dicht verflochtenen Konidiophoren, die ein kompaktes Hymenium bilden, apikal sind, und zylindrische bis ellipsoide Konidien in parallelen Ketten, die Säulen oder plattenartige Massen bilden. Beauveria spp. Kolonien sind normalerweise weiß, pudrig oder baumwollartig. Sie zeigen konidiogene Zellen mit einem erweiterten Basalanteil, der sich apikal in Zickzackrichtung erstreckt. Beauveria conidiophores bilden dichte Gruppen von kugelförmigen Konidien. Molekulare Analysen sind für die Identifizierung von EPF auf Speziesebene erforderlich. - Führen Sie molekulare Analysen der Isolate zur taxonomischen Identifizierung auf Artebene durch. Für die in dieser Studie isolierten EPF-Stämme, nämlich Metarhizium spp. und Beauveria spp., führen molekulare Analysen auf der Grundlage der Berichte von Bischoff et al.17 und Rehner et al.18 durch.
- Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Isolate EPF sind, deponieren Sie die Isolate in einer Sammlung von Pilzkulturen. In der vorliegenden Studie wurden die Isolate in der entomopathogenen Pilzkultursammlung aus dem Labor für mikrobielle Kontrolle (LCM) an der Föderalen Ländlichen Universität von Rio de Janeiro deponiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insgesamt 524 Bodenproben wurden zwischen 2015 und 2018 aus Grünland entnommen: Viehweideland (165 Proben), einheimischer Tropenwald (90 Proben), Seeland (42 Proben) und Kultur-/Ackerland (227 Proben) im brasilianischen Bundesstaat Rio de Janeiro. Einzelheiten zu den geografischen Koordinaten der für EPF positiven Proben sind der ergänzenden Tabelle 1 zu entnehmen.
Von den 524 Bodenproben wurden 500 Proben nur mit CTC-Medium analysiert, und 24 Proben wurden gleichzeitig mit drei Formen der Isolierung (Galleria-Köder, Tenebrio-Köder und das selektive CTC-Kulturmedium) analysiert, so dass die relative Effizienz dieser Methoden bewertet werden konnte. Insgesamt wurden 51 EPF-Stämme aus 524 Proben (41 Metarhizium spp. und 10 Beauveria spp.) isoliert. (Abbildung 1). Die mikromorphologischen Eigenschaften einiger Isolate sind in Abbildung 2 dargestellt. Alle Pilzstämme wurden aus Grünland oder Ackerland isoliert (Ergänzende Tabelle 1). Die Ergebnisse zeigten, dass Metarhizium spp. häufiger vorkommt als Beauveria spp. (Ergänzende Tabelle 1). Neun der Metarhizium-Isolate (LCM S01 bis LCM S09) wurden molekular mit dem ef1-a-Gen21 (eukaryotic translation elongation factor 1-alpha) identifiziert. Von diesen wurden sieben Isolate (LCM S01-LCM S06 und LCM S08) als Metarhizium anisopliae sensu stricto identifiziert, während zwei Isolate (LCM S07 und LCM S09) als Metarhizium pingshaense21 identifiziert wurden.
Das Vorkommen von EPF (% der positiven EPF-Proben) in den 24 Bodenproben, die mit den drei verschiedenen Methoden der Isolierung untersucht wurden, ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Wiederherstellungsraten von EPF wurden durch einen Chi-Quadrat-Test analysiert. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, erwiesen sich Galleria-Köder als effizienter bei der Isolierung von EPF (91,7% (22/24) der positiven Proben), gefolgt von T. molitor-Ködern (62,5% (15/24) der EPF-positiven Proben) und CTC-Medium (41,7% (14/24) der EPF-positiven Proben). Diese 24 Bodenproben zeigten keine Erholung von Beauveria spp., sondern nur Metarhizium.
Abbildung 1: Entomopathogene Pilzkolonien von Stämmen, die aus Bodenproben isoliert wurden. Kolonien wurden auf künstlichem CTC-Medium kultiviert. (1) Petriplatte mit Pilzkolonien aus Bodenproben 14 Tage nach Inkubation auf CTC-selektivem Medium, bevor Reinkulturen gewonnen werden; (2-42) Reine Metarhizium spp. Kolonien; (43-52) Reine Beauveria spp. Kolonien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikromorphologische Eigenschaften entomopathogener Pilze, die aus Bodenproben isoliert wurden. Die Kolonien wurden 3 Tage lang mit Kartoffeldextrose-Agar bei 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit ≥ 80% inkubiert. Der Objektträger wurde mit Lactophenolblaulösung gefärbt. Die Bilder zeigen Konidiophoren und Konidien von (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolieren LCM S01; B) Metarhizium anisopliae s.s. Isolat LCM S03; (C) Metarhizium sp. isolieren LCM S27; (D-F) Beauveria spp. isoliert LCM S23, LCM S24 bzw. LCM S20. Alle hier dargestellten Stämme wurden mit dem CTC-Medium isoliert. LCM S27 wurde auch mit Insektenködern aus dem Boden gewonnen. * Konidiophoren und Konidien. ** Konidiale Ketten zeigen die charakteristische nebeneinander liegende Platzierung von Metarhizium-Sporen in benachbarten Ketten. Schwarze Pfeile zeigen Metarhizium zylindrisch bis ellipsoide Konidien an. Rote Pfeile zeigen die kugelförmigen Konidien von Beauveria an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Methode der Isolierung | Entomopathogene Pilze* | χ2** | |
| Positiv | Negativ | ||
| Galleria-Köder | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-Köder | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC-selektives Medium | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Nur Metarhizium spp. wurden isoliert | |||
| ** Chi-Quadrat-Analyse, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabelle 1: Vorkommen entomopathogener Pilze (% positiver Proben) in 24 Bodenproben unter Verwendung verschiedener Isolationsmethoden.
Ergänzende Tabelle 1: Geografische Koordinaten, Isolationsmethode, Code, Entnahmejahr und Landnutzungsarten von Proben, die für entomopathogene Pilze positiv sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Natürliche und landwirtschaftliche Bodenlebensräume sind typische Umgebungen für EPF22 und ein ausgezeichnetes natürliches Reservoir. In der vorliegenden Studie wurden zwei Methoden der EPF-Isolierung mit Insektenködern im Vergleich zu selektivem Medium untersucht. Der erste Schritt zur Isolierung ist die Entnahme der Bodenproben. Die ordnungsgemäße Lagerung und Identifizierung von Bodenproben ist von entscheidender Bedeutung. Informationen über Breitengrad, Längengrad, Bodentyp und Biom sind für Studien mit epidemiologischen, modellierenden und georäumlichen Probandenunerlässlich 23,24. Nach der Entnahme wird empfohlen, die Proben so schnell wie möglich (vorzugsweise innerhalb von 7 Tagen) zu verarbeiten, da die Lebensfähigkeit der Konidien in diesen Bodenproben schließlich abnehmen kann. Zu den kritischen Schritten bei der EPF-Isolierung mit CTC gehören: a) Untersuchung von CTC-Platten 1 und 2 Wochen nach der Inkubation (die ersten Wochen sind kritisch, da andere Pilzkolonien in späteren Stadien die EPF-Entwicklung einschränken können) und b) genaue Identifizierung von EPF-Kolonien basierend auf ihrer Makromorphologie und Mikromorphologie. Für die Isolierung mit Insektenködern ist es wichtig, die Bodenprobe feucht zu halten, aber nicht in Wasser einzuweichen.
Die Ergebnisse mehrerer Studien haben zu einer Interpretation geführt, dass M. anisopliae in kultivierten Böden häufiger vorkommt als in natürlichen Ökosystemen8,25,26. Unterschiede in der Verbreitung und dem Vorkommen dieser Pilze können auftreten. In der vorliegenden Studie wurden alle Stämme entweder aus kultivierten Böden (Kulturpflanzen) oder aus Grasland isoliert, und es gab eine Vorherrschaft von Metarhizium spp. gegenüber Beauveria spp. Es wird vermutet, dass die Anbaupraktiken und der hohe Gehalt an organischer Substanz das Vorhandensein von saprophytischen Pilzen im Boden begünstigen27. Dementsprechend sollten wirksame Isolationstechniken, die EPF suchen, die Reduzierung von Pilzkontaminanten in Betracht ziehen.
Selektive künstliche Medien werden häufig zur Isolierung verwendet, da sie einfach zu verwenden sind und sich bei der Isolierung entomopathogener Pilze, hauptsächlich Metarhizium spp. und Beauveria spp.28, als wirksam erwiesen haben. Diese selektiven Medien verwenden spezifische Chemikalien, um das Wachstum von Verunreinigungen zu reduzieren. In den 1980er und 1990er Jahren wurde das Fungizid Dodine zu einem weit verbreiteten selektiven Medium zur Isolierung von Metarhizium spp. und Beauveria spp.29,30. Obwohl diese künstlichen Medien wirksam sind, können einige EPF-Spezies wie Metarhizium acridum anfällig für Dodine31 sein. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie das dodinfreie CTC-Medium gewählt. Laut Fernandes et al.9 wurde CTC entwickelt, um die Isolierung von natürlich vorkommenden entomopathogenen Pilzen, einschließlich M. acridum, zu maximieren. Die Verwendung eines selektiven Mediums anstelle von Insektenködern in der Isolierung von EPF ist praktisch, da erstere weniger Platz in der Probenverarbeitung benötigt. Der Hauptnachteil bei der CTC-Verwendung beruht auf der Tatsache, dass einige seiner Bestandteile (z. B. Cycloheximid und Chloramphenicol) giftig sind, so dass die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung obligatorisch ist.
Wie in der vorliegenden Studie beobachtet, wurde ein höherer Prozentsatz positiver Proben mit Insektenködern im Vergleich zu künstlichen selektiven Medien zur Isolierung von EPF 15,32,33,34,35 berichtet. Die Verwendung von Insektenködern gilt als kostengünstige und hocheffiziente Alternative bei der Suche nach neuen EPF. Trotzdem gibt es Nachteile, die mit der Verwendung von Insektenködern gegenüber selektiven Medien verbunden sind. Da die Menge an Boden, die mit Insekten analysiert werden soll, höher ist, ist es auch notwendig, mehr physischen Platz zu haben, um die Proben zu lagern und die Töpfe zu inkubieren. Der Erwerb von Insekten kann auch eine Einschränkung sein. In Brasilien zum Beispiel ist G. mellonella nicht im Handel erhältlich, daher ist es notwendig, eine Kolonie im Labor zu gründen, um dieses Insekt als Köder zu verwenden. Es ist wichtig, die Gesundheit der Insektenkolonien zu erhalten und eine natürliche Infektion durch EPF zu vermeiden. Eine EPF-Infektion in der Kolonie kann die Isolationsergebnisse unzuverlässig machen. Daher muss man die verbleibenden Larven in der Kolonie beobachten, die pathologische Anzeichen für wirbellose Tiere suchen. Alternativ können Kontrolltöpfe mit steriler Erde in die Studie einbezogen werden, um den Gesundheitszustand der Insektenlarven zu überprüfen.
Die Suche nach neuen Pilzisolaten mit hervorragenden Biokontrolleigenschaften ist entscheidend, um die Wirksamkeit von Pilzen bei der Arthropoden-Schädlingsbekämpfung zu erhöhen. Aus dem Boden isolierte Pilze können gut an das Wachstum in dieser Umgebung angepasst werden22, und sie haben wahrscheinlich eine hohe Feldpersistenz, was ein wesentliches Merkmal einer erfolgreichen EPF bei der Schädlingsbekämpfungist 21. Dementsprechend kann lokal isolierte EPF die biologische Bekämpfung lokaler Schädlinge aufgrund ihrer geografischen und zeitlichen Kongruenz verbessern, die Erfolgschancen erhöhen und die Umweltauswirkungen reduzieren, die sonst durch den Einsatz synthetischer Insektizide verursacht werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde zum Teil vom Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Projektnummer E-26/010.001993/2015) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) aus Brasilien finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
