Summary
Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).
Abstract
L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Le sol est un habitat riche pour les micro-organismes, y compris l’EPF appartenant en particulier aux genres Metarhizium et Beauveria, qui peuvent réguler les arthropodes nuisibles. Les produits biologiques à base de champignons sont disponibles sur le marché principalement pour la lutte antiparasitaire des arthropodes agricoles. Néanmoins, malgré la grande biodiversité endémique, seules quelques souches sont utilisées dans les bioproduits commerciaux dans le monde entier. Dans la présente étude, 524 échantillons de sol ont été cultivés sur de la gélose de dextrose de pomme de terre enrichie d’extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC). La croissance des colonies fongiques a été observée pendant 3 semaines. Tous les Metarhizium et Beauveria EPF ont été identifiés morphologiquement au niveau du genre. De plus, certains isolats ont été identifiés moléculairement au niveau de l’espèce. Vingt-quatre de ces 524 échantillons de sol ont également été étudiés pour la présence de FPE à l’aide de la méthode des appâts à insectes (Galleria mellonella et Tenebrio molitor). Au total, 51 souches d’EPF ont été isolées (41 Metarhizium spp. et 10 Beauveria spp.) à partir des 524 échantillons de sol. Toutes les souches fongiques ont été isolées dans des terres cultivées ou des prairies. Sur les 24 échantillons sélectionnés à des fins de comparaison, 91,7 % étaient positifs pour l’EPF utilisant l’appât Galleria , 62,5 % utilisant l’appât Tenebrio et 41,7 % utilisant le CTC. Nos résultats suggèrent que l’utilisation d’appâts à insectes pour isoler le FPE du sol est plus efficace que l’utilisation du milieu CTC. La comparaison des méthodes d’isolement en plus de l’identification et de la conservation du FPE a un impact positif sur les connaissances sur la biodiversité. L’amélioration de la collecte du FPE soutient le développement scientifique et l’innovation technologique.
Introduction
Le sol est la source de plusieurs micro-organismes, dont les champignons entomopathogènes (EPF). Ce groupe particulier de champignons est reconnu par leur capacité à coloniser et souvent à tuer les hôtes arthropodes, en particulier les insectes1. Après isolement, caractérisation, sélection de souches virulentes et enregistrement, les EPF sont produits en masse pour la lutte contre les arthropodes nuisibles, ce qui confirme leur pertinence économique2. En conséquence, l’isolement du FPE est considéré comme la première étape du développement d’un biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) et Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sont les champignons les plus couramment utilisés pour la lutte contre les arthropodesnuisibles 3. Les EPF ont été isolés avec succès du sol, des arthropodes présentant une mycose visible, des plantes colonisées et de la rhizosphère végétale 4,5.
L’isolement de l’EPF peut également être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. La littérature récente a rapporté que l’utilisation de l’EPF est sous-estimée, citant plusieurs applications non conventionnelles de l’EPF telles que leur capacité à améliorer la croissance des plantes4, à éliminer les contaminants toxiques du sol et à être utilisée en médecine6. La présente étude vise à comparer l’efficacité de l’isolement de l’EPF du sol à l’aide d’appâts à insectes par rapport au milieu de culture artificiel 7,8,9. L’utilisation de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) comme appât pour insectes dans le contexte de l’isolement de la FPE a été bien acceptée. Ces larves sont utilisées dans le monde entier par la communauté scientifique comme modèle expérimental pour étudier les interactions hôte-pathogène10,11. La larve de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) est considérée comme un autre modèle d’insecte pour les études impliquant la virulence et pour l’isolement de l’EPF puisque cet insecte est facile à rarer en laboratoire à faible coût 7,12.
Des méthodes indépendantes de la culture, telles que l’utilisation de diverses techniques de PCR, peuvent être appliquées pour détecter et quantifier l’EPF sur leurs substrats, y compris le sol13,14. Néanmoins, pour isoler correctement ces colonies fongiques, leur substrat doit être cultivé sur un milieu artificiel sélectif9, ou les champignons présents dans les échantillons peuvent être appâtés à l’aide d’insectes sensibles15. D’une part, le CTC est un milieu artificiel sans dodine qui se compose de gélose au dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide. Ce médium a été développé par Fernandes et al. 9 pour maximiser la récupération de Beauveria spp. et Metarhizium spp. naturels du sol. D’autre part, les larves de G. mellonella et de T. molitor peuvent également être utilisées avec succès comme appâts pour obtenir des isolats d’EPF du sol. Néanmoins, selon Sharma et al.15, moins d’études ont rapporté l’utilisation concomitante et la comparaison de ces deux insectes appâts. Les sols des vignobles portugais ont montré des récupérations importantes de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin utilisant T. larves de molitor par rapport aux larves de G. mellonella; en revanche, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L’isolement de Vuill était lié à l’utilisation d’appâts G. mellonella 15. Par conséquent, la décision sur la méthode d’isolement EPF à utiliser (c.-à-d. G. mellonella-appât, T. molitor-appât ou milieu CTC) devrait être envisagée en fonction de l’objectif de l’étude et de l’infrastructure du laboratoire. L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler le FPE à partir d’échantillons de sol.
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Protocol
Comme la présente étude a accédé au patrimoine génétique brésilien, la recherche a été enregistrée auprès du Système national de gestion du patrimoine génétique et des connaissances traditionnelles associées (Sisgen) sous le code AA47CB6.
1. Échantillonnage du sol
- Prélever 800 g de terre (avec ou sans racines secondaires incidentes) à une profondeur de 10 cm à l’aide d’une petite pelle. Conservez-les dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience.
REMARQUE: Les petites racines peuvent également être collectées car les FPE auraient une compétence en matière de rhizosphère. Plus le traitement des échantillons est rapide, mieux c’est, car les spores fongiques peuvent être moins viables au fil du temps. Dans la présente étude, les échantillons ont été analysés au plus tard 7 jours après le prélèvement. - Utilisez un GPS pour identifier l’emplacement des échantillons prélevés en latitude et longitude et classez la zone collectée en fonction du type de sol (par exemple, prairies, forêt tropicale indigène, rives de lacs ou terres cultivées).
2. Méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes
- Isolement à l’aide d’un milieu artificiel sélectif CTC.
- Pour préparer le milieu CTC [gélose au dextrose de pomme de terre plus extrait de levure (PDAY) complété par 0,5 g/L de chloramphénicol, 0,001 g/L de thiabendazole et 0,25 g/L de cycloheximide9], peser tous les réactifs individuellement, les mélanger dans de l’eau distillée et stériliser le milieu en autoclave. Dans une armoire de biosécurité, plaquer 23 mL du milieu dans des plaques de Petri de 60 mm x 15 mm.
ATTENTION : Lorsque vous pesez les réactifs CTC, utilisez une blouse de laboratoire, un masque, des gants et des lunettes, car le cycloheximide et le chloramphénicol sont toxiques. - Peser 0,35 ± 0,05 g de chaque échantillon de sol (avec ou sans racines) et le placer dans un microtube de 1,5 mL.
- Dans une armoire de biosécurité, ajouter 1 mL de suspension aqueuse stérile de polyoxyéthylène sorbitan monooléate de 0,01 % (vol/vol) au microtube contenant du sol et du vortex pendant 30 s.
- Retirer 50 μL du surnageant et le pipeter sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu à l’aide d’une spatule stérile Drigalski (6 mm de diamètre).
REMARQUE : Au moins trois répliques pour chaque échantillon de sol doivent être préparées. - Incuber les plaques dans des chambres climatiques (25 ± 1 °C, humidité relative ≥80%) dans l’obscurité et observer la croissance des colonies fongiques après 7, 14 et 21 jours d’incubation.
- Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques à la recherche d’EPF. Transférer les cultures EPF dans un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre plus 0,05 % de chloramphénicol (PDAC) jusqu’à l’obtention de cultures pures.
REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.
- Pour préparer le milieu CTC [gélose au dextrose de pomme de terre plus extrait de levure (PDAY) complété par 0,5 g/L de chloramphénicol, 0,001 g/L de thiabendazole et 0,25 g/L de cycloheximide9], peser tous les réactifs individuellement, les mélanger dans de l’eau distillée et stériliser le milieu en autoclave. Dans une armoire de biosécurité, plaquer 23 mL du milieu dans des plaques de Petri de 60 mm x 15 mm.
- Isolement à l’aide d’appâts à insectes
- Utilisez des larves de G. mellonella et de T. molitor à un stade avancé désinfectées en surface. Immerger les larves dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min pour la stérilisation. Lavez les larves deux fois à l’aide d’eau stérile.
NOTE: Les larves de G. mellonella du quatrième stade ont été utilisées dans la présente étude. Les stades larvaires de T. molitor n’étaient pas normalisés. - Utilisez des pots en plastique pour assembler les appâts. Ajouter 250 g de terre collectée à chaque pot en plastique (98 mm de largeur x 47 mm de hauteur x 142 mm de longueur). Séparer 15 larves de chaque espèce (T. molitor et G. mellonella) et déposer cinq larves par pot en plastique. Conservez les pots à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % dans l’obscurité.
REMARQUE: Percez 10 petits trous (2 mm de diamètre) dans les couvercles du pot pour permettre la ventilation. Un dispositif de fer chauffé tranchant peut être utilisé pour percer les trous. - Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol.
REMARQUE: L’humidité est importante pour soutenir l’infection fongique des larves. Pour maintenir l’humidité dans le sol, vaporisez de l’eau distillée stérile à la surface du sol chaque fois que nécessaire. Ne pas tremper l’échantillon de sol dans l’eau. - Analysez quotidiennement les pots à la recherche d’insectes morts.
REMARQUE: Observez quotidiennement les larves restantes dans la colonie à la recherche de signes pathologiques d’invertébrés pour vous assurer que les insectes ne sont pas infectés. Comme alternative, des pots de contrôle avec un sol stérile peuvent être inclus dans l’étude pour vérifier l’état de santé des larves d’insectes. - Enlevez les insectes morts et stérilisez-les superficiellement avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min. Placer les insectes stériles dans une chambre humide (humidité relative ≥ 80%) à 25 ± 1 °C pendant 7 jours pour favoriser l’extériorisation des champignons entomopathogènes (mycose).
- En cas de mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte. Utilisez une boucle microbiologique pour placer les conidies sur un milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Incuber les plaques de culture dans une chambre climatique à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.
- Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques sur les plaques pour confirmer l’identité de l’EPF. Répéter la culture sur PDAC jusqu’à ce que des colonies fongiques pures soient obtenues.
REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.
- Utilisez des larves de G. mellonella et de T. molitor à un stade avancé désinfectées en surface. Immerger les larves dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min pour la stérilisation. Lavez les larves deux fois à l’aide d’eau stérile.
3. Identification des EPF (Metarhizium spp. et Beauveria spp.)
- Analyser les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques (c.-à-d. la surface et l’inverse des colonies, leur forme, leur bord, leur taux de croissance, leur couleur, leur texture, leur pigment diffusible, les exsudats et les conidies aériennes) après 14 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.
- Transférer les conidies aériennes dans des cultures sur lames (technique de microculture)16 pendant 3 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % et tacher avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques (c.-à-d. disposition des conidies, des conidiophores, de la forme et de la taille des conidies)17,18,19,20.
- Observez les structures fongiques microscopiques à 400x à l’aide d’un microscope optique pour confirmer l’identification EPF.
NOTE: Les clés morphologiques pour l’EPF sont décrites dans les rapports de Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., et Humber 17,18,19,20. La macro et la micromorphologie des colonies fongiques sont les critères les plus fréquemment utilisés pour identifier les champignons filamenteux au niveau du genre. Selon le genre de l’EPF, ces caractéristiques morphologiques vont changer. Humber20 présente une clé d’identification des principaux genres d’entomopathogènes fongiques. Les colonies de Metarhizium spp., par exemple, sont généralement circulaires, poudreuses, présentant différentes nuances de vert et peuvent présenter de l’exsudat. Au microscope, ces colonies ont des cellules conidiogènes apicales sur des conidiophores largement ramifiés, densément entrelacés formant un hyménium compact, et des conidies cylindriques à ellipsoïdes en chaînes parallèles formant des colonnes ou des masses en forme de plaque. Les colonies de Beauveria spp. sont généralement blanches, poudreuses ou cotonnières. Ils présentent des cellules conidiogènes avec une partie basale dilatée s’étendant apicalement dans une direction en zigzag. Les conidiophores de Beauveria forment des amas denses de conidies en forme de globe. Des analyses moléculaires sont nécessaires pour l’identification de la FPE au niveau de l’espèce. - Effectuer des analyses moléculaires sur les isolats pour l’identification taxonomique au niveau de l’espèce. Pour les souches EPF isolées dans cette étude, à savoir Metarhizium spp. et Beauveria spp., effectuer des analyses moléculaires basées sur les rapports de Bischoff et al.17 et Rehner et al.18.
- Après avoir confirmé que les isolats sont des EPF, déposez les isolats dans une collection de cultures fongiques. Dans la présente étude, les isolats ont été déposés dans la collection de cultures fongiques entomopathogènes du Laboratoire de contrôle microbien (LCM) de l’Université rurale fédérale de Rio de Janeiro.
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Representative Results
Au total, 524 échantillons de sol ont été prélevés dans des prairies : pâturages pour le bétail (165 échantillons), forêts tropicales indigènes (90 échantillons), lacs (42 échantillons) et terres cultivées/cultivées (227 échantillons) entre 2015 et 2018 dans l’État de Rio de Janeiro, au Brésil. Les coordonnées géographiques des échantillons positifs pour le FPE sont donnés dans le tableau supplémentaire 1.
Sur les 524 échantillons de sol, 500 échantillons ont été analysés uniquement à l’aide d’un milieu CTC, et 24 échantillons ont été analysés simultanément à l’aide de trois formes d’isolement (Galleria-appât, Tenebrio-appât et milieu de culture sélectif CTC), de sorte que l’efficacité relative de ces méthodes a pu être évaluée. Au total, 51 souches d’EPF ont été isolées à partir de 524 échantillons (41 Metarhizium spp. et 10 Beauveria spp.) (Figure 1). Les caractéristiques micromorphologiques de certains isolats sont illustrées à la figure 2. Toutes les souches fongiques ont été isolées dans des prairies ou des terres cultivées (tableau supplémentaire 1). Les résultats ont révélé que Metarhizium spp. est plus répandu que Beauveria spp. (tableau supplémentaire 1). Neuf des isolats de Metarhizium (LCM S01 à LCM S09) ont été identifiés moléculairement à l’aide du gène ef1-a (eucaryote translation elongation factor 1-alpha)21. Parmi ceux-ci, sept isolats (LCM S01-LCM S06 et LCM S08) ont été identifiés comme Metarhizium anisopliae sensu stricto tandis que deux isolats (LCM S07 et LCM S09) ont été identifiés comme Metarhizium pingshaense21.
La présence d’EPF (% d’échantillons positifs de PEF) dans les 24 échantillons de sol étudiés à l’aide des trois différentes méthodes d’isolement est indiquée dans le tableau 1. Les taux de récupération de l’EPF ont été analysés par un test du chi carré. Comme le montre le tableau 1, l’appât Galleria s’est avéré plus efficace dans l’isolement de l’EPF (91,7 % (22/24) des échantillons positifs), suivi de l’appât T. molitor (62,5 % (15/24) des échantillons positifs de l’EPF) et du milieu CTC (41,7 % (14/24) des échantillons positifs au FEP). Ces 24 échantillons de sol n’ont montré aucune récupération de Beauveria spp., mais seulement metarhizium.
Figure 1 : Colonies fongiques entomopathogènes de souches isolées à partir d’échantillons de sol. Les colonies ont été cultivées sur un milieu artificiel CTC. (1) Plaque de Petri présentant des colonies fongiques provenant d’échantillons de sol 14 jours après l’incubation sur milieu sélectif CTC avant l’obtention de cultures pures; (2-42) Colonies de Metarhizium spp. pur; (43-52) Pure Beauveria spp. colonies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractéristiques micromorphologiques des champignons entomopathogènes isolés à partir d’échantillons de sol. Les colonies ont été incubées pendant 3 jours sur une gélose au dextrose de pomme de terre à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %. La lame du microscope a été colorée avec une solution de bleu de lactophénol. Les images montrent des conidiophores et des conidies de (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolat LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. isolat LCM S03; C) Metarhizium sp. isolat LCM S27; (D-F) Beauveria spp. isole respectivement LCM S23, LCM S24 et LCM S20. Toutes les souches représentées ici ont été isolées à l’aide du milieu CTC. Le LCM S27 a également été récupéré dans le sol à l’aide d’appâts à insectes. * Conidiophores et conidies. ** Les chaînes conidiales montrent le placement côte à côte caractéristique des spores de Metarhizium dans les chaînes adjacentes. Les flèches noires indiquent Metarhizium cylindrique à ellipsoïde conidie. Les flèches rouges indiquent les conidies en forme de globe de Beauveria. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Méthode d’isolement | Champignons entomopathogènes* | χ2** | |
| Positif | Négatif | ||
| Galleria-appât | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-appât | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| Milieu sélectif CTC | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Seuls Metarhizium spp. ont été isolés | |||
| ** Analyse du chi carré, DF2. P = 0,0013 | |||
Tableau 1 : Présence de champignons entomopathogènes (% des échantillons positifs) dans 24 échantillons de sol utilisant différentes méthodes d’isolement.
Tableau supplémentaire 1 : Coordonnées géographiques, méthode d’isolement, code, année de collecte et types d’échantillons d’utilisation des terres positifs pour les champignons entomopathogènes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Les habitats naturels et agricoles des sols sont des environnements typiques de l’EPF22 et constituent un excellent réservoir naturel. Dans la présente étude, deux méthodes d’isolement de la FPE à l’aide d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif ont été abordées. La première étape de l’isolement est la collecte des échantillons de sol. Un stockage et une identification appropriés des échantillons de sol sont essentiels. L’information sur la latitude, la longitude, le type de sol et le biome est essentielle pour les études impliquant des sujets épidémiologiques, de modélisation et géospatiaux23,24. Après le prélèvement, il est recommandé que les échantillons soient traités le plus tôt possible (de préférence dans les 7 jours) car la viabilité des conidies dans ces échantillons de sol peut éventuellement diminuer. Les étapes critiques de l’isolement de l’EPF à l’aide du CTC comprennent : a) l’étude des plaques CTC 1 et 2 semaines après l’incubation (les premières semaines sont critiques car, à des stades ultérieurs, d’autres colonies fongiques peuvent limiter le développement du FPE), et b) l’identification précise des colonies de FPE en fonction de leur macromorphologie et de leur micromorphologie. Pour l’isolement à l’aide d’appâts à insectes, il est essentiel de garder l’échantillon de sol humide mais pas de le tremper dans l’eau.
Les résultats rapportés par plusieurs études ont conduit à une interprétation selon laquelle M. anisopliae est plus commun dans les sols cultivés que dans les écosystèmes naturels 8,25,26. Des différences dans la distribution et l’occurrence de ces champignons peuvent se produire. Dans la présente étude, toutes les souches ont été isolées soit à partir de sols cultivés (cultures) ou de prairies, et il y avait une prédominance de Metarhizium spp. sur Beauveria spp. Il est suggéré que les pratiques culturales et la teneur élevée en matière organique favorisent la présence de champignons saprophytes dans le sol27. Par conséquent, des techniques d’isolement efficaces à la recherche de FPE devraient envisager de réduire les contaminants fongiques.
Les milieux artificiels sélectifs sont couramment utilisés pour l’isolement parce qu’ils sont faciles à utiliser et se sont révélés efficaces pour isoler les champignons entomopathogènes, principalement Metarhizium spp. et Beauveria spp.28. Ces milieux sélectifs utilisent des produits chimiques spécifiques pour réduire la croissance des contaminants. Dans les années 1980 et 1990, le fongicide dodine est devenu un milieu sélectif largement utilisé pour isoler Metarhizium spp. et Beauveria spp.29,30. Bien que ces milieux artificiels soient efficaces, certaines espèces de FPE telles que Metarhizium acridum peuvent être sensibles à la dodine31. C’est pourquoi le milieu CTC sans dodine a été choisi dans la présente étude. Selon Fernandes et coll.9, le CTC a été mis au point pour maximiser l’isolement des champignons entomopathogènes naturels, y compris M. acridum. L’utilisation d’un milieu sélectif plutôt que d’appâts à insectes dans l’isolement de l’EPF est pratique car le premier nécessite moins d’espace dans le traitement de l’échantillon. Le principal inconvénient de l’utilisation du CTC repose sur le fait que certains de ses composants (c.-à-d. le cycloheximide et le chloramphénicol) sont toxiques, de sorte que l’utilisation d’équipement de protection individuelle est obligatoire.
Comme observé dans la présente étude, un pourcentage plus élevé d’échantillons positifs a été rapporté avec des appâts à insectes par rapport aux milieux sélectifs artificiels pour l’isolement de l’EPF 15,32,33,34,35. L’utilisation d’appâts à insectes est considérée comme une alternative peu coûteuse et à haute efficacité dans la recherche d’un nouveau FPE. Malgré cela, il existe des inconvénients associés à l’utilisation d’appâts à insectes par rapport aux milieux sélectifs. Comme la quantité de sol à analyser à l’aide d’insectes est plus élevée, il est également nécessaire d’avoir plus d’espace physique pour stocker les échantillons et incuber les pots. L’acquisition d’insectes peut également être une limitation. Au Brésil, par exemple, G. mellonella n’est pas disponible dans le commerce, il est donc nécessaire d’établir une colonie en laboratoire pour utiliser cet insecte comme appât. Il est essentiel de maintenir la salubrité des colonies d’insectes, en évitant l’infection naturelle par l’EPF. Une infection à EPF dans la colonie peut rendre les résultats de l’isolement peu fiables. Par conséquent, il faut observer les larves restantes dans la colonie à la recherche de signes pathologiques d’invertébrés. Comme alternative, des pots de contrôle avec un sol stérile peuvent être inclus dans l’étude pour vérifier l’état de santé des larves d’insectes.
La recherche de nouveaux isolats fongiques avec des caractéristiques de biocontrôle exceptionnelles est cruciale pour augmenter l’efficacité des champignons dans la lutte contre les arthropodes nuisibles. Les champignons isolés du sol peuvent être bien adaptés à la croissance dans cet environnement22, et ils sont susceptibles d’avoir une persistance élevée sur le terrain, ce qui est une caractéristique essentielle du succès du FPE dans la lutte antiparasitaire21. En conséquence, les PEF isolés localement peuvent améliorer la lutte biologique contre les ravageurs locaux en raison de leur congruence géographique et temporelle, augmentant les chances de succès et réduisant les impacts environnementaux autrement causés par l’application d’insecticides synthétiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par la Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) du Brésil, code financier 001, fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numéro de projet E-26/010.001993/2015), et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) du Brésil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
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