Summary
Entomopatogena svampkolonier isoleras från tropiska jordprover med Tenebrio bete, Galleria bete, liksom selektivt konstgjort medium, dvs potatis dextros agar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid (CTC-medium).
Abstract
Målet med föreliggande studie är att jämföra effektiviteten av att använda insektsbeten kontra artificiellt selektivt medium för att isolera entomopatogena svampar (EPF) från jordprover. Marken är en rik livsmiljö för mikroorganismer, inklusive EPF som särskilt tillhör släktena Metarhizium och Beauveria, som kan reglera leddjur skadedjur. Biologiska produkter baserade på svampar finns på marknaden främst för bekämpning av leddjur i jordbruket. Trots den höga endemiska biologiska mångfalden används dock endast ett fåtal stammar i kommersiella bioprodukter över hela världen. I den aktuella studien odlades 524 jordprover på potatisdextrosagar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid (CTC-medium). Tillväxten av svampkolonier observerades i 3 veckor. Alla Metarhizium och Beauveria EPF identifierades morfologiskt på släktnivå. Dessutom identifierades vissa isolat molekylärt på artnivå. Tjugofyra av dessa 524 jordprover undersöktes också för EPF-förekomst med insektsbetemetoden (Galleria mellonella och Tenebrio molitor). Totalt isolerades 51 EPF-stammar (41 Metarhizium spp. och 10 Beauveria spp.) från de 524 jordproverna. Alla svampstammar isolerades antingen från odlingsmarker eller gräsmarker. Av de 24 prover som valdes ut för jämförelse var 91,7% positiva för EPF med Galleria-bete , 62,5% med Tenebrio-bete och 41,7% med CTC. Våra resultat föreslog att det är effektivare att använda insektsbeten för att isolera EPF från jorden än att använda CTC-mediet. Jämförelsen av isoleringsmetoder utöver identifieringen och bevarandet av epf har en positiv inverkan på kunskapen om biologisk mångfald. Förbättringen av EPF-insamlingen stöder vetenskaplig utveckling och teknisk innovation.
Introduction
Jord är källan till flera mikroorganismer, inklusive entomopatogena svampar (EPF). Denna speciella grupp av svampar känns igen av deras förmåga att kolonisera och ofta döda leddjursvärdar, särskilt insekter1. Efter isolering, karakterisering, urval av virulenta stammar och registrering massproduceras EPF för bekämpning av leddjur-skadedjur, vilket stöder deras ekonomiska relevans2. Följaktligen anses isoleringen av EPF vara det första steget till utvecklingen av en biopesticid. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) och Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) är de vanligaste svamparna som används för arthropod-skadedjursbekämpning3. EPF har framgångsrikt isolerats från jord, leddjur med synlig mykos, koloniserade växter och växtrhizosfär 4,5.
Isolering av EPF kan också vara användbar för att studera mångfalden, distributionen och ekologin hos denna speciella grupp. Ny litteratur rapporterade att användningen av EPF är underskattad, med hänvisning till flera okonventionella tillämpningar av EPF, såsom deras förmåga att förbättra växttillväxten4, för att avlägsna giftiga föroreningar från jorden och för att användas i medicin6. Den föreliggande studien syftar till att jämföra effektiviteten av att isolera EPF från jord med insektsbeten jämfört med artificiellt odlingsmedium 7,8,9. Användningen av Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insektsbete i samband med EPF-isolering har accepterats väl. Dessa larver används över hela världen av det vetenskapliga samfundet som en experimentell modell för att studera värd-patogeninteraktioner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larv anses vara en annan insektsmodell för studier som involverar virulens och för isolering av EPF eftersom denna insekt är lätt att sällsynt i laboratoriet till en låg kostnad 7,12.
Kulturoberoende metoder som att använda en mängd olika PCR-tekniker kan tillämpas för att detektera och kvantifiera EPF på deras substrat, inklusive jord13,14. För att korrekt isolera dessa svampkolonier bör deras substrat odlas på ett selektivt konstgjort medium9, eller svamparna som finns i proverna kan agnas med känsliga insekter15. Å ena sidan är CTC ett dodinfritt konstgjort medium som består av potatisdextrosagar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid. Detta medium utvecklades av Fernandes et al. 9 för att maximera återhämtningen av naturligt förekommande Beauveria spp. och Metarhizium spp. från jorden. Å andra sidan kan G. mellonella och T. molitor larver också framgångsrikt användas som beten för att erhålla EPF-isolat från jorden. Men enligt Sharma et al.15 rapporterade färre studier samtidig användning och jämförelse av dessa två betesinsekter. Portugisiska vingårdar jordar uppvisade betydande återvinningar av Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin med T. molitor larver i jämförelse med G. mellonella larver; däremot Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolering var kopplad till användningen av G. mellonella beten15. Därför bör beslutet om vilken EPF-isoleringsmetod som ska användas (dvs. G. mellonella-bete, T. molitor-bete eller CTC-medium) övervägas i enlighet med studiens mål och laboratorieinfrastrukturen. Målet med föreliggande studie är att jämföra effektiviteten av att använda insektsbeten kontra artificiellt selektivt medium för att isolera EPF från markprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eftersom den aktuella studien fick tillgång till brasilianskt genetiskt arv registrerades forskningen vid National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) under koden AA47CB6.
1. Markprovtagning
- Samla 800 g jord (med eller utan incident sekundära växtrötter) till ett djup av 10 cm med en liten spade. Förvara dem i polypropenpåsar vid rumstemperatur tills experimentet börjar.
OBS: Små rötter kan också samlas in eftersom EPF rapporteras ha rhizosfärkompetens. Ju snabbare bearbetning av proverna är, desto bättre eftersom svampsporerna kan vara mindre livskraftiga över tiden. I den aktuella studien analyserades prover inte mer än 7 dagar efter insamlingen. - Använd en GPS för att identifiera platsen för de insamlade proverna i latitud och longitud och klassificera det insamlade området efter jordtyp (till exempel gräsmarker, inhemsk regnskog, sjöstränder eller odlingsmarker).
2. Isoleringsmetoder för entomopatogena svampar
- Isolering med CTC-selektivt artificiellt medium.
- För att bereda CTC-mediet [potatisdextrosagar plus jästextrakt (PDAY) kompletterat med 0,5 g/l kloramfenikol, 0,001 g/l tiabendazol och 0,25 g/l cykloheximid9], väg alla reagens individuellt, blanda dem i destillerat vatten och sterilisera mediet i autoklav. I ett biosäkerhetsskåp, platta 23 ml av mediet i 60 mm x 15 mm Petri-plattor.
VARNING: När du väger CTC-reagens, använd en laboratorierock, mask, handskar och skyddsglasögon eftersom cykloheximid och kloramfenikol är giftiga. - Väg 0,35 ± 0,05 g av varje jordprov (med eller utan rötter) och placera det i ett 1,5 ml mikrorör.
- I ett biosäkerhetsskåp, tillsätt 1 ml steril 0,01% (vol / vol) polyoxietylensorbitatmonooleat vattenhaltig suspension till mikroröret som innehåller jord och virvel i 30 s.
- Ta bort 50 μL av supernatanten och pipettera den på mitten av Petri-plattorna med CTC-medium. Sprid suspensionerna homogent på mediets yta med en steril Drigalski-spatel (6 mm i diameter).
OBS: Minst tre replikat för varje jordprov bör utarbetas. - Inkubera plattorna i klimatkamrarna (25 ± 1 ° C, relativ fuktighet ≥80%) i mörkret och observera tillväxten av svampkolonier efter 7, 14 och 21 dagars inkubation.
- Observera makromorfologin och mikromorfologin hos svampkolonierna som söker EPF. Överför EPF-kulturerna till potatisdextrosagarmedium plus 0,05% kloramfenikol (PDAC) tills rena kulturer erhålls.
OBS: Använd beskrivningsnycklarna nedan i steg 3 för identifiering av EPF-kolonier.
- För att bereda CTC-mediet [potatisdextrosagar plus jästextrakt (PDAY) kompletterat med 0,5 g/l kloramfenikol, 0,001 g/l tiabendazol och 0,25 g/l cykloheximid9], väg alla reagens individuellt, blanda dem i destillerat vatten och sterilisera mediet i autoklav. I ett biosäkerhetsskåp, platta 23 ml av mediet i 60 mm x 15 mm Petri-plattor.
- Isolering med insektsbeten
- Använd ytdesinficerade G. mellonella och T. molitor larver i sent skede. Sänk ner larverna i 0,5% natriumhypoklorit i 1 min för sterilisering. Tvätta larverna två gånger med sterilt vatten.
OBS: G. mellonella larver från det fjärde steget användes i den aktuella studien. T. molitor larvstadier standardiserades inte. - Använd plastkrukor för att montera beten. Tillsätt 250 g uppsamlad jord till varje plastkruka (98 mm bredd x 47 mm höjd x 142 mm längd). Separera 15 larver av varje art (T. molitor och G. mellonella) och deponera fem larver per plastkruka. Förvara krukorna vid 25 ± 1 °C och relativ fuktighet ≥ 80 % i mörker.
OBS: Borra 10 små hål (2 mm i diameter) i kruklocken för att möjliggöra ventilation. En skarp uppvärmd järnanordning kan användas för att borra hålen. - Homogenisera jorden varannan dag för att möjliggöra maximal kontakt med larver med jord.
OBS: Fukt är viktigt för att stödja svampinfektion av larver. För att bibehålla fukt i jorden, spraya sterilt destillerat vatten på markytan vid behov. Blötlägg inte jordprovet i vatten. - Analysera krukorna dagligen och sök efter döda insekter.
OBS: Observera de återstående larverna i kolonin dagligen för ryggradslösa patologiska tecken för att se till att insekterna inte är infekterade. Som ett alternativ kan kontrollkrukor med steril jord ingå i studien för att kontrollera insektslarvernas hälsotillstånd. - Ta bort döda insekter och sterilisera dem ytligt med 0,5% natriumhypoklorit i 1 min. Placera de sterila insekterna i en fuktig kammare (relativ fuktighet ≥ 80%) vid 25 ± 1 ° C i 7 dagar för att gynna exteriöriseringen av entomopatogena svampar (mykos).
- Vid mykos, skörda konidierna från insektsytan. Använd en mikrobiologisk slinga för att placera konidierna på PDAC-medium under ett stereoskopiskt mikroskop. Som ett alternativ, placera hela de infekterade larverna på PDAC-mediet. Inkubera odlingsplattorna i en klimatkammare vid 25 ± 1 °C och relativ luftfuktighet ≥ 80 %.
- Observera makromorfologin och mikromorfologin hos svampkolonierna på plattorna för att bekräfta EPF: s identitet. Upprepa odlingen på PDAC tills rena svampkolonier erhålls.
OBS: Använd beskrivningsnycklarna nedan i steg 3 för identifiering av EPF-kolonier.
- Använd ytdesinficerade G. mellonella och T. molitor larver i sent skede. Sänk ner larverna i 0,5% natriumhypoklorit i 1 min för sterilisering. Tvätta larverna två gånger med sterilt vatten.
3. Identifiering av EPF (Metarhizium spp. och Beauveria spp.)
- Analysera de makromorfologiska egenskaperna hos svampkulturerna på plattorna (dvs. koloniernas yta och baksida, deras form, kant, tillväxthastighet, färg, struktur, diffusibla pigment, exsudater och luftkonidier) efter 14 dagar vid 25 ± 1 ° C och relativ fuktighet ≥ 80%.
- Överför luftkonidierna till glidkulturer (mikrokulturteknik)16 i 3 dagar vid 25 ± 1 °C och relativ fuktighet ≥ 80 % och fläck med laktofenolblå för att observera mikroskopiska egenskaper (dvs. arrangemang av konidier, konidioforer, form och storlek på konidier)17,18,19,20.
- Observera de mikroskopiska svampstrukturerna vid 400x med hjälp av ett optiskt mikroskop för att bekräfta EPF-identifieringen.
OBS: Morfologiska nycklar för EPF beskrivs i rapporterna av Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. och Humber 17,18,19,20. Makro- och mikromorfologin hos svampkolonier är de vanligaste kriterierna som används för att identifiera trådformiga svampar på släktnivå. Beroende på EPF: s släkt kommer dessa morfologiska egenskaper att förändras. Humber20 presenterar en identifieringsnyckel till stora släkten av svampentomopatogener. Metarhizium spp. kolonier, till exempel, är vanligtvis cirkulära, pulverformiga, uppvisar olika nyanser av grönt och kan presentera exsudat. Mikroskopiskt har dessa kolonier konidiogena celler apikala på brett grenade, tätt sammanflätade konidioforer som bildar ett kompakt hymenium och cylindriska till ellipsoida konidier i parallella kedjor som bildar kolonner eller plattliknande massor. Beauveria spp. kolonier är vanligtvis vita, pulverformiga eller bomullsliknande. De uppvisar konidiogena celler med en dilaterad basal del som sträcker sig apiskt i sicksackriktning. Beauveria conidiophores bildar täta kluster av klotformade konidier. Molekylära analyser behövs för att identifiera EPF på artnivå. - Utföra molekylära analyser på isolaten för taxonomisk identifiering på artnivå. För de EPF-stammar som isolerats i denna studie, nämligen Metarhizium spp. och Beauveria spp., utför molekylära analyser baserade på rapporterna från Bischoff et al.17 och Rehner et al.18.
- Efter att ha bekräftat att isolaten är EPF, deponera isolaten i en samling svampkulturer. I den aktuella studien deponerades isolaten i samlingen av entomopatogena svampkulturer från Laboratory of Microbial Control (LCM) vid Federal Rural University of Rio de Janeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 524 jordprover samlades in från gräsmark: betesmark för boskap (165 prover), inhemsk tropisk skog (90 prover), sjö (42 prover) och odlad / odlingsmark (227 prover) mellan 2015 och 2018 i Rio de Janeiro-staten, Brasilien. Närmare uppgifter om geografiska koordinater för prover som är positiva för EPF finns i kompletterande tabell 1.
Av de 524 jordproverna analyserades 500 prover endast med CTC-medium och 24 prover analyserades samtidigt med användning av tre former av isolering (Galleria-bete, Tenebrio-bete och det selektiva CTC-odlingsmediet), så den relativa effektiviteten hos dessa metoder kunde utvärderas. Totalt 51 EPF-stammar isolerades från 524 prover (41 Metarhizium spp. och 10 Beauveria spp.) (Figur 1). Mikromorfologiska egenskaper hos vissa isolat visas i figur 2. Alla svampstammar isolerades från gräsmark eller åkermark (kompletterande tabell 1). Resultaten avslöjade att Metarhizium spp. är vanligare än Beauveria spp. (Kompletterande tabell 1). Nio av Metarhiziumisolaten (LCM S01 till LCM S09) identifierades molekylärt med hjälp av genen ef1-a (eukaryot translation elongation factor 1-alpha)21. Av dessa identifierades sju isolat (LCM S01-LCM S06 och LCM S08) som Metarhizium anisopliae sensu stricto medan två isolat (LCM S07 och LCM S09) identifierades som Metarhizium pingshaense21.
Förekomsten av EPF (% av positiva EPF-prover) i de 24 jordprover som studerats med de tre olika isoleringsmetoderna visas i tabell 1. Återvinningsgraden för EPF analyserades med chi-kvadrattest. Som framgår av tabell 1 visade sig Galleria bete vara effektivare vid isolering av EPF (91,7 % (22/24) av positiva prover) följt av T. molitorbete (62,5 % (15/24) av EPF-positiva prover) och CTC-medium (41,7 % (14/24) av EPF-positiva prover). Dessa 24 jordprover visade ingen återvinning av Beauveria spp., utan endast Metarhizium.
Figur 1: Entomopatogena svampkolonier av stammar isolerade från jordprover. Kolonier odlades på CTC artificiellt medium. (1) Petriplatta som uppvisar svampkolonier från jordprover 14 dagar efter inkubation på CTC-selektivt medium innan rena kulturer erhålls. (2-42) Rena Metarhizium spp. kolonier; (43-52) Rena Beauveria spp. kolonier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikromorfologiska egenskaper hos entomopatogena svampar isolerade från jordprover. Kolonierna inkuberades i 3 dagar på potatisdextrosagar vid 25 ± 1 °C och relativ fuktighet ≥ 80 %. Mikroskopbilden färgades med laktofenolblå lösning. Bilder visar konidioforer och konidier av (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolera LCM S01; B) Metarhizium anisopliae s.s. isolera LCM S03. isolera LCM S27. (D-F) beauveria spp. isolerar LCM S23, LCM S24 respektive LCM S20. Alla stammar som representeras här isolerades med CTC-mediet. LCM S27 återfanns också från marken med insektsbeten. * Konidioforer och konidier. ** Konidiala kedjor visar den karakteristiska sida vid sida placeringen av Metarhiziumsporer i intilliggande kedjor. Svarta pilar indikerar Metarhizium cylindrisk till ellipsoid konidier. Röda pilar indikerar Beauveria klotformade konidier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Metod för isolering | Entomopatogena svampar* | χ2** | |
| Positiv | Negativ | ||
| Galleria-bete | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-bete | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC selektivt medium | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Endast Metarhizium spp. isolerades | |||
| ** Chi-kvadratisk analys, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabell 1: Förekomst av entomopatogena svampar (% av positiva prover) i 24 jordprover med olika isoleringsmetoder.
Kompletterande tabell 1: Geografiska koordinater, isoleringsmetod, kod, insamlingsår och markanvändningstyper av prover som är positiva för entomopatogena svampar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Livsmiljöer för natur- och jordbruksmark är typiska miljöer för EPF22 och en utmärkt naturreservat. I den aktuella studien behandlades två metoder för EPF-isolering med insektsbeten kontra selektivt medium. Det första steget för isolering är insamlingen av markproverna. Korrekt lagring och identifiering av markprover är avgörande. Information om latitud, longitud, jordtyp och biom är avgörande för studier som involverar epidemiologiska, modellerande och geospatiala ämnen23,24. Efter insamling rekommenderas att proverna bearbetas så snart som möjligt (helst inom 7 dagar) eftersom livskraften hos konidier i dessa jordprover så småningom kan minska. Kritiska steg i EPF-isoleringen med CTC inkluderar: a) undersökning av CTC-plattor 1 och 2 veckor efter inkubation (de första veckorna är kritiska eftersom andra svampkolonier i senare skeden kan begränsa EPF-utvecklingen) och b) exakt identifiera EPF-kolonier baserat på deras makromorfologi och mikromorfologi. För isolering med insektsbeten är det viktigt att hålla jordprovet fuktigt men inte blötlägga det i vatten.
Resultaten som rapporterats av flera studier har lett till en tolkning att M. anisopliae är vanligare i odlade jordar än naturliga ekosystem 8,25,26. Skillnader i fördelningen och förekomsten av dessa svampar kan uppstå. I den aktuella studien isolerades alla stammar antingen från odlad jord (grödor) eller gräsmarker, och det fanns en övervägande metarhizium spp. över Beauveria spp. Det föreslås att odlingsmetoder och det höga innehållet av organiskt material gynnar närvaron av saprofytiska svampar i jorden27. Följaktligen bör effektiva isoleringstekniker som söker EPF överväga att minska svampföroreningar.
Selektiva konstgjorda medier används ofta för isolering eftersom de är lätta att använda och har visat sig vara effektiva för att isolera entomopatogena svampar, främst Metarhizium spp. och Beauveria spp.28. Dessa selektiva medier använder specifika kemikalier för att minska tillväxten av föroreningar. På 1980- och 1990-talet blev fungiciden dodin ett allmänt använt selektivt medium för att isolera Metarhizium spp. och Beauveria spp.29,30. Även om dessa konstgjorda medier är effektiva kan vissa EPF-arter som Metarhizium acridum vara mottagliga för dodin31. Därför valdes det dodinfria CTC-mediet i den aktuella studien. Enligt Fernandes et al.9 utvecklades CTC för att maximera isoleringen av naturligt förekommande entomopatogena svampar, inklusive M. acridum. Att använda ett selektivt medium snarare än insektsbeten i isoleringen av EPF är bekvämt eftersom det förra kräver mindre utrymme i provbearbetningen. Den största nackdelen med CTC-användning beror på det faktum att vissa av dess komponenter (dvs cykloheximid och kloramfenikol) är giftiga, så användningen av personlig skyddsutrustning är obligatorisk.
Som observerats i föreliggande studie har en högre andel positiva prover rapporterats med insektsbeten jämfört med artificiella selektiva medier för isolering av EPF 15,32,33,34,35. Användningen av insektsbeten anses vara ett billigt och högeffektivt alternativ i sökandet efter ny EPF. Trots detta finns det nackdelar förknippade med användningen av insektsbeten över selektiva medier. Eftersom mängden jord att analysera med insekter är högre är det också nödvändigt att ha mer fysiskt utrymme för att lagra proverna och inkubera krukorna. Förvärv av insekter kan också vara en begränsning. I Brasilien är till exempel G. mellonella inte kommersiellt tillgänglig, så det är nödvändigt att etablera en koloni i labbet för att använda denna insekt som bete. Det är viktigt att hålla hälsningen hos insekternas kolonier och undvika naturlig infektion med EPF. En EPF-infektion i kolonin kan göra isoleringsresultaten opålitliga. Därför måste man observera de återstående larverna i kolonin som söker ryggradslösa patologiska tecken. Som ett alternativ kan kontrollkrukor med steril jord ingå i studien för att kontrollera insektslarvernas hälsotillstånd.
Att söka nya svampisolat med enastående biologiska kontrollegenskaper är avgörande för att öka effektiviteten hos svampar vid leddjur-skadedjursbekämpning. Svampar isolerade från jord kan vara väl anpassade till odling i denna miljö22, och de kommer sannolikt att ha hög fältpersistens, vilket är ett viktigt kännetecken för framgångsrik EPF i skadedjursbekämpning21. Följaktligen kan lokalt isolerad EPF förbättra den biologiska bekämpningen av lokala skadegörare på grund av deras geografiska och tidsmässiga kongruens, vilket ökar chanserna för framgång och minskar den miljöpåverkan som annars orsakas av applicering av syntetiska insekticider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie finansierades delvis av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) från Brasilien, finanskod 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projektnummer E-26/010.001993/2015) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) från Brasilien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
