Summary
Entomopathogene soppkolonier er isolert fra tropiske jordprøver ved hjelp av Tenebrio agn, Galleria agn, samt selektivt kunstig medium, det vil si potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid (CTC-medium).
Abstract
Målet med den nåværende studien er å sammenligne effektiviteten av å bruke insekt baits versus kunstig selektivt medium for å isolere entomopathogene sopp (EPF) fra jordprøver. Jorden er et rikt habitat for mikroorganismer, inkludert EPF som spesielt tilhører slekten Metarhizium og Beauveria, som kan regulere leddyr. Biologiske produkter basert på sopp er tilgjengelige i markedet hovedsakelig for landbruks leddyr skadedyrsbekjempelse. Likevel, til tross for det høye endemiske biologiske mangfoldet, brukes bare noen få stammer i kommersielle bioprodukter over hele verden. I den nåværende studien ble 524 jordprøver dyrket på potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid (CTC-medium). Veksten av soppkolonier ble observert i 3 uker. Alle Metarhizium og Beauveria EPF ble morfologisk identifisert på slektsnivå. I tillegg ble noen isolasjoner molekylært identifisert på artsnivå. 24 av disse 524 jordprøvene ble også kartlagt for EPF-forekomst ved hjelp av insektets agnmetode (Galleria mellonella og Tenebrio molitor). Totalt 51 EPF-stammer ble isolert (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) fra de 524 jordprøvene. Alle soppstammer ble isolert enten fra jordbruksområder eller gressletter. Av de 24 utvalgene som ble valgt for sammenligning, var 91,7% positive for EPF ved hjelp av Galleria agn, 62,5% ved hjelp av Tenebrio agn og 41,7% ved hjelp av CTC. Våre resultater antydet at bruk av insektagn for å isolere EPF fra jorda er mer effektivt enn å bruke CTC-mediet. Sammenligningen av isolasjonsmetoder i tillegg til identifisering og bevaring av EPF har en positiv innvirkning på kunnskapen om biologisk mangfold. Forbedringen av EPF-samlingen støtter vitenskapelig utvikling og teknologisk innovasjon.
Introduction
Jord er kilden til flere mikroorganismer, inkludert entomopathogene sopp (EPF). Denne spesielle gruppen sopp er anerkjent av deres evne til å kolonisere og ofte drepe leddyr verter, spesielt insekter1. Etter isolasjon, karakterisering, utvalg av virulente stammer og registrering er EPF masseprodusert for leddyr-skadedyrskontroll, som støtter deres økonomiske relevans2. Følgelig anses isolasjonen av EPF som det første skrittet til utviklingen av et biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) og Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) er de vanligste soppene som brukes til leddyr-skadedyrskontroll3. EPF har blitt vellykket isolert fra jord, leddyr med synlig mykose, koloniserte planter og plante rhizosphere 4,5.
Isolering av EPF kan også være nyttig for å studere mangfoldet, fordelingen og økologien til denne gruppen. Nyere litteratur rapporterte at bruken av EPF er undervurdert, med henvisning til flere ukonvensjonelle anvendelser av EPF som deres evne til å forbedre planteveksten4, for å fjerne giftige forurensninger fra jorda, og som skal brukes i medisin6. Den nåværende studien tar sikte på å sammenligne effektiviteten ved å isolere EPF fra jord ved hjelp av insekt baits versus kunstig kultur medium 7,8,9. Bruken av Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insekt agn i sammenheng med EPF-isolasjon har blitt godt akseptert. Disse larvene brukes over hele verden av det vitenskapelige samfunnet som en eksperimentell modell for å studere vertspatogeninteraksjoner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve regnes som en annen insektmodell for studier som involverer virulens og for isolasjon av EPF siden dette insektet er lett å sjelden i laboratoriet til en lav pris 7,12.
Kulturuavhengige metoder som bruk av en rekke PCR-teknikker kan brukes til å oppdage og kvantifisere EPF på deres substrater, inkludert jord13,14. Likevel, for å isolere disse soppkoloniene riktig, bør deres substrat dyrkes på et selektivt kunstig medium9, eller soppene som er tilstede i prøvene, kan baited ved hjelp av følsomme insekter15. På den ene siden er CTC et dodinefritt kunstig medium som består av potetdekstrose agar beriket med gjærekstrakt supplert med kloramfenikol, tiabendazol og cycloheximid. Dette mediet ble utviklet av Fernandes et al. 9 for å maksimere utvinningen av naturlig forekommende Beauveria spp. og Metarhizium spp. fra jorda. På den annen side kan G. mellonella og T. molitor larver også med hell brukes som agn for å få EPF-isolasjoner fra jorda. Likevel, ifølge Sharma et al.15, rapporterte færre studier samtidig bruk og sammenligning av disse to agninsektene. Portugisiske vingårder jord viste betydelige utvinninger av Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin bruker T. molitor larver i forhold til G. mellonella larver; I kontrast, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuillisolasjon var knyttet til bruk av G. mellonella agn15. Derfor bør beslutningen om hvilken EPF-isolasjonsmetode som skal brukes (dvs. G. mellonella-agn, T. molitor-agn eller CTC-medium) vurderes i henhold til studiens mål og laboratorieinfrastrukturen. Målet med den nåværende studien er å sammenligne effektiviteten av å bruke insekt baits versus kunstig selektivt medium for å isolere EPF fra jordprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Da den nåværende studien fikk tilgang til brasiliansk genetisk arv, ble forskningen registrert ved National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) under koden AA47CB6.
1. Jordprøvetaking
- Samle 800 g jord (med eller uten hendelser sekundære planterøtter) til en dybde på 10 cm ved hjelp av en liten spade. Oppbevar dem i polypropylenposer ved romtemperatur til starten av eksperimentet.
MERK: Små røtter kan også samles inn ettersom EPF rapporteres å ha rhizosfærekompetanse. Jo raskere behandlingen av prøvene er, jo bedre fordi soppsporene kan være mindre levedyktige over tid. I den nåværende studien ble prøver analysert ikke mer enn 7 dager etter samlingen. - Bruk en GPS til å identifisere plasseringen av de innsamlede prøvene i breddegrad og lengdegrad og klassifisere det oppsamlede området i henhold til jordtypen (for eksempel gressletter, innfødt regnskog, innsjøer eller avlinger).
2. Isolasjonsmetoder for entomopathogene sopp
- Isolasjon ved hjelp av CTC selektivt kunstig medium.
- For å forberede CTC-mediet [potetdekstrose agar pluss gjærekstrakt (PDAY) supplert med 0,5 g/l kloramfenikol, 0,001 g/l tiabendazol og 0,25 g/l cykloheksimid9], vei alle reagensene individuelt, bland dem i destillert vann og steriliser mediet i autoklavering. I et biosikkerhetsskap, plate 23 ml av mediet i 60 mm x 15 mm Petri plater.
FORSIKTIG: Når du veier CTC-reagenser, bruk en labfrakk, maske, hansker og vernebriller fordi cycloheximid og kloramfenikol er giftige. - Vei 0,35 ± 0,05 g av hver jordprøve (med eller uten røtter) og legg den i en 1,5 ml mikrotube.
- I et biosikkerhetsskap, tilsett 1 ml steril 0,01% (vol / vol) polyoksyetylen sorbitan monooleat vandig suspensjon til mikrorøret som inneholder jord og virvel i 30 s.
- Fjern 50 μL av supernatanten og pipette den på midten av Petri-plater med CTC-medium. Spred suspensjonene homogent på overflaten av mediet ved hjelp av en steril Drigalski-spatel (6 mm i diameter).
MERK: Minst tre replikeringer for hver jordprøve bør utarbeides. - Inkuber platene i klimakamre (25 ± 1 °C, relativ fuktighet ≥80 %) i mørket og observere veksten av soppkolonier etter 7, 14 og 21 dager med inkubasjon.
- Vær oppmerksom på makromorfologien og mikromorfologien til soppkoloniene som søker EPF. Overfør EPF-kulturene til potetdekstrose agar medium pluss 0,05% kloramfenikol (PDAC) til rene kulturer er oppnådd.
MERK: Bruk beskrivelsesnøklene som presenteres nedenfor i trinn 3 for identifisering av EPF-kolonier.
- For å forberede CTC-mediet [potetdekstrose agar pluss gjærekstrakt (PDAY) supplert med 0,5 g/l kloramfenikol, 0,001 g/l tiabendazol og 0,25 g/l cykloheksimid9], vei alle reagensene individuelt, bland dem i destillert vann og steriliser mediet i autoklavering. I et biosikkerhetsskap, plate 23 ml av mediet i 60 mm x 15 mm Petri plater.
- Isolasjon ved hjelp av insekt baits
- Bruk overflatedesinfeksjonsmiddel G. mellonella og T. molitor senfase larver. Senk larvene ned i 0,5% natriumhypokloritt i 1 min for sterilisering. Vask larvene to ganger ved hjelp av sterilt vann.
MERK: G. mellonella larver fra fjerde fase ble brukt i den nåværende studien. T. molitor larval stadier ble ikke standardisert. - Bruk plastpotter for å montere agnene. Tilsett 250 g samlet jord til hver plastkanne (98 mm bredde x 47 mm høyde x 142 mm lengde). Skill 15 larver av hver art (T. molitor og G. mellonella) og deponer fem larver per plastkanne. Oppbevar grytene ved 25 ± 1 °C og relativ fuktighet ≥ 80 % i mørket.
MERK: Bor 10 små hull (2 mm i diameter) i grytelokkene for å tillate ventilasjon. En skarp oppvarmet jernenhet kan brukes til å bore hullene. - Homogeniser jorda annenhver dag for å tillate maksimal kontakt av larver med jord.
MERK: Fuktighet er viktig for å støtte soppinfeksjonen av larver. For å opprettholde fuktighet i jorda, spray sterilt destillert vann på jordoverflaten når det er nødvendig. Ikke suge jordprøven i vann. - Analyser pottene daglig søker døde insekter.
MERK: Observer de resterende larver i kolonien daglig for hvirvelløse patologiske tegn for å sikre at insekter ikke er smittet. Som et alternativ kan kontrollpotter med steril jord inkluderes i studien for å sjekke insekt larvers helsestatus. - Fjern døde insekter og steriliser dem overfladisk med 0,5% natriumhypokloritt i 1 min. Plasser de sterile insekter i et fuktig kammer (relativ fuktighet ≥ 80%) ved 25 ± 1 °C i 7 dager for å favorisere eksteriørisering av entomopathogene sopp (mykose).
- Ved mykose, høst conidia fra insektoverflaten. Bruk en mikrobiologisk sløyfe til å plassere konidiaen på PDAC-mediet under et stereoskopisk mikroskop. Som et alternativ, plasser hele infiserte larver på PDAC-mediet. Inkuber kulturplatene i et klimakammer ved 25 ± 1 °C og relativ fuktighet ≥ 80 %.
- Observer makromorfologien og mikromorfologien til soppkoloniene på platene for å bekrefte identiteten til EPF. Gjenta dyrking på PDAC til rene soppkolonier er oppnådd.
MERK: Bruk beskrivelsesnøklene som presenteres nedenfor i trinn 3 for identifisering av EPF-kolonier.
- Bruk overflatedesinfeksjonsmiddel G. mellonella og T. molitor senfase larver. Senk larvene ned i 0,5% natriumhypokloritt i 1 min for sterilisering. Vask larvene to ganger ved hjelp av sterilt vann.
3. Identifikasjon av EPF (Metarhizium spp. og Beauveria spp.)
- Analyser de makromorfologiske egenskapene til soppkulturene på platene (dvs. overflate og revers av kolonier, deres form, kant, vekstrate, farge, tekstur, diffusibel pigment, eksudater og luftfuktighet) etter 14 dager ved 25 ± 1 °C og relativ fuktighet ≥ 80%.
- Overfør luftfuktighet til lysbildekulturer (mikrokulturteknikk)16 i 3 dager ved 25 ± 1 °C og relativ fuktighet ≥ 80 % og flekk med laktofenolblått for å observere de mikroskopiske egenskapene (dvs. arrangement av conidia, konidioforer, form og størrelse på conidia)17,18,19,20.
- Vær oppmerksom på de mikroskopiske soppstrukturene ved 400x ved hjelp av et optisk mikroskop for å bekrefte EPF-identifikasjonen.
MERK: Morfologiske nøkler for EPF er beskrevet i rapportene fra Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., og Humber 17,18,19,20. Makro- og mikromorfologien til soppkolonier er de hyppigste kriteriene som brukes til å identifisere filamentøse sopp på slektsnivå. Avhengig av slekten til EPF, vil disse morfologiske egenskapene endres. Humber20 presenterer en identifikasjonsnøkkel til store slekter av sopp entomopathogener. Metarhizium spp. kolonier, for eksempel, er vanligvis sirkulære, pulveraktige, viser varierende nyanser av grønt, og kan presentere ekssudat. Mikroskopisk har disse koloniene konidigene celler apikale på bredt forgrenede, tett sammenflettede conidiophores som danner et kompakt hymenium, og sylindrisk til ellipsoid conidia i parallelle kjeder som danner kolonner eller platelignende masser. Beauveria spp. kolonier er vanligvis hvite, pulveraktige eller bomullslignende. De viser konidigene celler med en utvidet basaldel som strekker seg apically i en sikksakkretning. Beauveria conidiophores danner tette klynger av globusformet conidia. Molekylære analyser er nødvendig for identifisering av EPF på artsnivå. - Utføre molekylære analyser av isolasjonene for taksonomisk identifikasjon på artsnivå. For EPF-stammene isolert i denne studien, nemlig Metarhizium spp. og Beauveria spp., utfører molekylære analyser basert på rapporter fra Bischoff et al.17 og Rehner et al.18.
- Etter å ha bekreftet isolatene for å være EPF, deponer isolasjonene i en samling soppkulturer. I den nåværende studien ble isolasjonene deponert i entomopathogenic soppkultursamlingen fra Laboratory of Microbial Control (LCM) ved Federal Rural University of Rio de Janeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt ble det samlet inn 524 jordprøver fra gressletter: husdyrbeite (165 prøver), innfødt tropisk skog (90 prøver), innsjø (42 prøver) og dyrket/avling (227 prøver) mellom 2015 og 2018 i Rio de Janeiro-staten, Brasil. Detaljer om geografiske koordinater for prøver som er positive for EPF er gitt i supplerende tabell 1.
Av de 524 jordprøvene ble 500 prøver analysert bare ved hjelp av CTC-medium, og 24 prøver ble samtidig analysert ved hjelp av tre former for isolasjon (Galleria-agn, Tenebrio-agn og det selektive CTC-kulturmediet), slik at den relative effektiviteten til disse metodene kunne evalueres. Totalt 51 EPF-stammer ble isolert fra 524 prøver (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) (Figur 1). Mikromorfologiske egenskaper ved noen isolasjoner er vist i figur 2. Alle soppstammer ble isolert fra gressletter eller jordbruksområder (supplerende tabell 1). Resultatene viste at Metarhizium spp. er mer utbredt enn Beauveria spp. (Supplerende tabell 1). Ni av Metarhizium-isolasjonene (LCM S01 til LCM S09) ble molekylært identifisert ved hjelp av ef1-a (eukaryotisk translasjonsforlengelsesfaktor 1-alfa) gen21. Av disse ble syv isolasjoner (LCM S01-LCM S06 og LCM S08) identifisert som Metarhizium anisopliae sensu stricto mens to isolasjoner (LCM S07 og LCM S09) ble identifisert som Metarhizium pingshaense21.
Forekomsten av EPF (% av positive EPF-prøver) i de 24 jordprøvene som studeres ved hjelp av de tre forskjellige isolasjonsmetodene, er vist i tabell 1. Utvinningsgraden av EPF ble analysert av kjikvadrattest. Som vist i tabell 1 viste Galleria agn seg å være mer effektiv i isolasjonen av EPF (91,7% (22/24) positive prøver) etterfulgt av T. molitor agn (62,5% (15/24) epf positive prøver) og CTC-medium (41,7% (14/24) epf positive prøver). Disse 24 jordprøvene viste ingen utvinning av Beauveria spp., men bare Metarhizium.
Figur 1: Entomopathogene soppkolonier av stammer isolert fra jordprøver. Kolonier ble dyrket på CTC kunstig medium. (1) Petri plate som viser soppkolonier fra jordprøver 14 dager etter inkubasjon på CTC selektivt medium før rene kulturer oppnås; (2-42) Rene Metarhizium spp. kolonier; (43-52) Rene Beauveria spp. kolonier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikromorfologiske egenskaper ved entomopathogene sopp isolert fra jordprøver. Kolonier ble inkubert i 3 dager på potet dextrose agar ved 25 ± 1 °C og relativ fuktighet ≥ 80%. Mikroskopskredet ble farget med laktoppfenolblå løsning. Bilder viser conidiophores og conidia av (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolere LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. isolere LCM S03; (C) Metarhizium sp. isolereR LCM S27; (D-F) Beauveria spp. isolerer henholdsvis LCM S23, LCM S24 og LCM S20. Alle stammer representert her ble isolert ved hjelp av CTC-mediet. LCM S27 ble også gjenvunnet fra jord ved hjelp av insekt baits. * Conidiophores og conidia. ** Konidiale kjeder viser den karakteristiske sidestilte plasseringen av Metarhizium-sporer i tilstøtende kjeder. Svarte piler indikerer Metarhizium sylindrisk til ellipsoid conidia. Røde piler indikerer Beauveria globusformet conidia. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Isolasjonsmetode | Entomopathogene sopp* | χ2** | |
| Positiv | Negativ | ||
| Galleria-agn | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-agn | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC selektivt medium | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Bare Metarhizium spp. ble isolert | |||
| ** Kjikvadratanalyse, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabell 1: Forekomst av entomopathogene sopp (% av positive prøver) i 24 jordprøver ved hjelp av forskjellige isolasjonsmetoder.
Supplerende tabell 1: Geografiske koordinater, isolasjonsmetode, kode, innsamlingsår og arealbrukstyper av prøver som er positive for entomopathogene sopp. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naturlige og landbruksjord habitater er typiske miljøer for EPF22 og et utmerket naturlig reservoar. I den nåværende studien ble to metoder for EPF-isolasjon ved hjelp av insektagn kontra selektivt medium adressert. Det første trinnet for isolasjon er samlingen av jordprøvene. Riktig lagring og identifisering av jordprøver er avgjørende. Informasjon om breddegrad, lengdegrad, jordtype og biome er avgjørende for studier som involverer epidemiologiske, modellerings- og geospatiale fag23,24. Etter innsamling anbefales det at prøvene behandles så snart som mulig (helst innen 7 dager) fordi levedyktigheten av conidia i disse jordprøvene til slutt kan reduseres. Kritiske trinn i EPF-isolasjonen ved hjelp av CTC inkluderer: a) undersøkelse av CTC-plater 1 og 2 uker etter inkubasjon (de første ukene er kritiske fordi andre soppkolonier på senere stadier kan begrense EPF-utviklingen), og b) nøyaktig identifisere EPF-kolonier basert på deres makromorfologi og mikromorfologi. For isolasjon ved hjelp av insektagn er det viktig å holde jordprøven fuktig, men ikke suge den i vann.
Resultatene rapportert av flere studier har ført til en tolkning av at M. anisopliae er mer vanlig i dyrket jord enn naturlige økosystemer 8,25,26. Forskjeller i fordelingen og forekomsten av disse soppene kan forekomme. I den nåværende studien ble alle stammer isolert enten fra dyrket jord (avlinger) eller gressletter, og det var en overvekt av Metarhizium spp. over Beauveria spp. Det foreslås at dyrkingspraksis og det høye innholdet av organisk materiale favoriserer tilstedeværelsen av saprofytiske sopp i jorda27. Følgelig bør effektive isolasjonsteknikker som søker EPF vurdere å redusere soppforurensninger.
Selektive kunstige medier brukes ofte til isolasjon fordi de er enkle å bruke og har vist seg effektive for å isolere entomopathogene sopp, hovedsakelig Metarhizium spp. og Beauveria spp.28. Disse selektive mediene bruker spesifikke kjemikalier for å redusere veksten av forurensninger. På 1980- og 1990-tallet ble fungicid dodine et mye brukt selektivt medium for å isolere Metarhizium spp. og Beauveria spp.29,30. Selv om disse kunstige mediene er effektive, kan noen EPF-arter som Metarhizium acridum være utsatt for dodine31. Derfor ble det dodinefrie CTC-mediet valgt i den nåværende studien. Ifølge Fernandes et al.9 ble CTC utviklet for å maksimere isolasjonen av naturlig forekommende entomopathogene sopp, inkludert M. acridum. Å bruke et selektivt medium i stedet for insekt baits i isolasjon av EPF er praktisk fordi førstnevnte krever mindre plass i prøvebehandlingen. Den største ulempen ved CTC-bruk er avhengig av at noen av komponentene (dvs. cycloheximid og kloramfenikol) er giftige, så bruk av personlig verneutstyr er obligatorisk.
Som observert i denne studien er det rapportert en høyere prosentandel positive prøver med insektagn sammenlignet med kunstige selektive medier for isolering av EPF 15,32,33,34,35. Bruken av insekt baits regnes som et rimelig og høyeffektivt alternativ i søket etter ny EPF. Til tross for dette er det ulemper forbundet med bruk av insekt baits over selektive medier. Siden mengden jord å analysere ved hjelp av insekter er høyere, er det også nødvendig å ha mer fysisk plass til å lagre prøvene og inkubere pottene. Oppkjøpet av insekter kan også være en begrensning. I Brasil er for eksempel G. mellonella ikke kommersielt tilgjengelig, så det er nødvendig å etablere en koloni i laboratoriet for å bruke dette insektet som agn. Det er viktig å holde salubrity av insektenes kolonier, unngå naturlig infeksjon av EPF. En EPF-infeksjon i kolonien kan gjøre isolasjonsresultatene upålitelige. Derfor må man observere de resterende larver i kolonien som søker hvirvelløse patologiske tegn. Som et alternativ kan kontrollpotter med steril jord inkluderes i studien for å sjekke insekt larvers helsestatus.
Å søke nye soppisolasjoner med fremragende biokontrollegenskaper er avgjørende for å øke effektiviteten av sopp i leddyr-skadedyrskontroll. Sopp isolert fra jord kan tilpasses godt til å vokse i dette miljøet22, og de vil sannsynligvis ha høy feltvarighet, noe som er en viktig egenskap ved vellykket EPF i skadedyrskontroll21. Følgelig kan lokalt isolert EPF forbedre den biologiske kontrollen av lokale på grunn av deres geografiske og temporale kongruens, øke sjansene for suksess og redusere miljøpåvirkningene ellers forårsaket av anvendelsen av syntetiske insektmidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis finansiert av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasil, finanskode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (prosjektnummer E-26/010.001993/2015) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) fra Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
