Summary
Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).
Abstract
Het doel van deze studie is om de effectiviteit van het gebruik van insectenaas te vergelijken met kunstmatig selectief medium voor het isoleren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. De bodem is een rijke habitat voor micro-organismen, waaronder EPF, met name behorend tot de geslachten Metarhizium en Beauveria, die geleedpotige plagen kunnen reguleren. Biologische producten op basis van schimmels zijn voornamelijk beschikbaar op de markt voor de bestrijding van geleedpotigen in de landbouw. Ondanks de hoge endemische biodiversiteit worden wereldwijd slechts enkele stammen gebruikt in commerciële bioproducten. In de huidige studie werden 524 bodemmonsters gekweekt op aardappel dextrose agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium). De groei van schimmelkolonies werd gedurende 3 weken waargenomen. Alle Metarhizium en Beauveria EPF werden morfologisch geïdentificeerd op geslachtsniveau. Bovendien werden sommige isolaten moleculair geïdentificeerd op soortniveau. Vierentwintig van deze 524 bodemmonsters werden ook onderzocht op EPF-voorkomen met behulp van de insectenaasmethode (Galleria mellonella en Tenebrio molitor). In totaal werden 51 EPF-stammen geïsoleerd (41 Metarhizium spp. en 10 Beauveria spp.) uit de 524 bodemmonsters. Alle schimmelstammen werden geïsoleerd uit akkerland of graslanden. Van de 24 monsters die ter vergelijking werden geselecteerd, was 91,7% positief voor EPF met Galleria-aas , 62,5% met Tenebrio-aas en 41,7% met CTC. Onze resultaten suggereerden dat het gebruik van insectenaas om de EPF uit de grond te isoleren efficiënter is dan het gebruik van het CTC-medium. De vergelijking van isolatiemethoden naast de identificatie en conservering van EPF heeft een positieve invloed op de kennis over biodiversiteit. De verbetering van de EPF-collectie ondersteunt wetenschappelijke ontwikkeling en technologische innovatie.
Introduction
De bodem is de bron van verschillende micro-organismen, waaronder entomopathogene schimmels (EPF). Deze specifieke groep schimmels wordt herkend aan hun vermogen om geleedpotige gastheren, vooral insecten, te koloniseren en vaak te doden1. Na isolatie, karakterisering, selectie van virulente stammen en registratie worden EPF massaal geproduceerd voor geleedpotige plaagbestrijding, wat hun economische relevantie ondersteunt2. Dienovereenkomstig wordt de isolatie van EPF beschouwd als de eerste stap naar de ontwikkeling van een biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) en Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) zijn de meest voorkomende schimmels die worden gebruikt voor geleedpotige plaagbestrijding3. EPF is met succes geïsoleerd uit de bodem, geleedpotigen met zichtbare mycose, gekoloniseerde planten en planten rhizosfeer 4,5.
Isolatie van EPF kan ook nuttig zijn om de diversiteit, verspreiding en ecologie van deze specifieke groep te bestuderen. Recente literatuur meldde dat het gebruik van EPF wordt onderschat, onder verwijzing naar verschillende onconventionele toepassingen van EPF, zoals hun vermogen om de plantengroei te verbeteren4, om giftige verontreinigingen uit de bodem te verwijderen en om te worden gebruikt in de geneeskunde6. Deze studie heeft tot doel de efficiëntie van het isoleren van EPF uit de bodem met behulp van insectenaas te vergelijken met kunstmatig kweekmedium 7,8,9. Het gebruik van Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) als insectenaas in de context van EPF-isolatie is goed geaccepteerd. Deze larven worden wereldwijd door de wetenschappelijke gemeenschap gebruikt als een experimenteel model om gastheer-pathogeen interactieste bestuderen 10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve wordt beschouwd als een ander insectenmodel voor studies met virulentie en voor isolatie van EPF, omdat dit insect gemakkelijk te zeldzaam is in het laboratorium tegen lage kosten 7,12.
Cultuuronafhankelijke methoden zoals het gebruik van verschillende PCR-technieken kunnen worden toegepast om EPF op hun substraten, waaronder bodem13,14, te detecteren en te kwantificeren. Niettemin, om deze schimmelkolonies goed te isoleren, moet hun substraat worden gekweekt op een selectief kunstmatig medium9, of de schimmels die in de monsters aanwezig zijn, kunnen worden gelokt met behulp van gevoelige insecten15. Aan de ene kant is CTC een dodinevrij kunstmatig medium dat bestaat uit aardappel dextrose agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide. Dit medium is ontwikkeld door Fernandes et al. 9 om het herstel van natuurlijk voorkomende Beauveria spp. en Metarhizium spp. uit de bodem te maximaliseren. Aan de andere kant kunnen G. mellonella en T. molitorlarven ook met succes worden gebruikt als aas om EPF-isolaten uit de bodem te verkrijgen. Niettemin, volgens Sharma et al.15, rapporteerden minder studies het gelijktijdige gebruik en de vergelijking van deze twee aasinsecten. Portugese wijngaarden bodems vertoonden aanzienlijke herstel van Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin met behulp van T. molitorlarven in vergelijking met G. mellonella-larven; daarentegen Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolatie werd in verband gebracht met het gebruik van G. mellonella aas15. Daarom moet de beslissing welke EPF-isolatiemethode moet worden gebruikt (d.w.z. G. mellonella-bait, T. molitor-bait of CTC-medium) worden overwogen op basis van het doel van de studie en de laboratoriuminfrastructuur. Het doel van deze studie is om de effectiviteit van het gebruik van insectenaas te vergelijken met kunstmatig selectief medium voor het isoleren van EPF uit bodemmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Omdat de huidige studie toegang had tot Braziliaans genetisch erfgoed, werd het onderzoek geregistreerd bij het National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) onder de code AA47CB6.
1. Bodembemonstering
- Verzamel 800 g grond (met of zonder invallende secundaire plantenwortels) tot een diepte van 10 cm met behulp van een kleine schop. Bewaar ze in polypropyleen zakken bij kamertemperatuur tot het begin van het experiment.
OPMERKING: Kleine wortels kunnen ook worden verzameld omdat EPF naar verluidt rhizosfeercompetentie heeft. Hoe sneller de verwerking van de monsters, hoe beter omdat de schimmelsporen na verloop van tijd minder levensvatbaar kunnen zijn. In de huidige studie werden monsters niet meer dan 7 dagen na de verzameling geanalyseerd. - Gebruik een GPS om de locatie van de verzamelde monsters in lengte- en breedtegraad te identificeren en het verzamelde gebied te classificeren op basis van het type grond (bijvoorbeeld graslanden, inheems regenwoud, meeroevers of akkerlanden).
2. Isolatiemethoden voor entomopathogene schimmels
- Isolatie met behulp van CTC selectief kunstmatig medium.
- Om het CTC-medium [aardappeldextrose-agar plus gistextract (PDAY) aangevuld met 0,5 g / L chlooramfenicol, 0,001 g / L thiabendazool en 0,25 g / L cycloheximide9] te bereiden, weegt u alle reagentia afzonderlijk, mengt u ze in gedestilleerd water en steriliseert u het medium in autoclaaf. In een bioveiligheidskast, plaat 23 ml van het medium in 60 mm x 15 mm petriplaten.
LET OP: Gebruik tijdens het wegen van CTC-reagentia een laboratoriumjas, masker, handschoenen en een bril omdat cycloheximide en chlooramfenicol giftig zijn. - Weeg 0,35 ± 0,05 g van elk bodemmonster (met of zonder wortels) en plaats het in een microbuisje van 1,5 ml.
- Voeg in een bioveiligheidskast 1 ml steriele 0,01% (vol / vol) polyoxyethyleensorbitaanmonooleaat waterige suspensie toe aan de microbuis met aarde en vortex gedurende 30 s.
- Verwijder 50 μL van het supernatant en pipetteer het op het midden van petriplaten met CTC-medium. Dispergeer de suspensies homogeen op het oppervlak van het medium met behulp van een steriele Drigalski-spatel (diameter van 6 mm).
OPMERKING: Voor elk bodemmonster moeten ten minste drie replicaties worden voorbereid. - Incubeer de platen in klimaatkamers (25 ± 1 °C, relatieve vochtigheid ≥80%) in het donker en observeer de groei van schimmelkolonies na 7, 14 en 21 dagen incubatie.
- Observeer de macromorfologie en micromorfologie van de schimmelkolonies die op zoek zijn naar EPF. Breng de EPF-culturen over naar aardappel dextrose agar medium plus 0,05% chlooramfenicol (PDAC) totdat zuivere culturen zijn verkregen.
OPMERKING: Gebruik de beschrijvingssleutels hieronder in stap 3 voor de identificatie van EPF-kolonies.
- Om het CTC-medium [aardappeldextrose-agar plus gistextract (PDAY) aangevuld met 0,5 g / L chlooramfenicol, 0,001 g / L thiabendazool en 0,25 g / L cycloheximide9] te bereiden, weegt u alle reagentia afzonderlijk, mengt u ze in gedestilleerd water en steriliseert u het medium in autoclaaf. In een bioveiligheidskast, plaat 23 ml van het medium in 60 mm x 15 mm petriplaten.
- Isolatie met behulp van insectenaas
- Gebruik oppervlakte-gedesinfecteerde G. mellonella en T. molitor late-stage larven. Dompel de larven gedurende 1 minuut onder in 0,5% natriumhypochloriet voor sterilisatie. Was de larven twee keer met steriel water.
OPMERKING: G. mellonella-larven uit de vierde fase werden in dit onderzoek gebruikt. T. molitor larvale stadia waren niet gestandaardiseerd. - Gebruik plastic potten om het aas in elkaar te zetten. Voeg 250 g verzameld aarde toe aan elke plastic pot (98 mm breedte x 47 mm hoogte x 142 mm lengte). Scheid 15 larven van elke soort (T. molitor en G. mellonella) en zet vijf larven per plastic pot af. Bewaar de potten bij 25 ± 1 °C en relatieve vochtigheid ≥ 80% in het donker.
OPMERKING: Boor 10 kleine gaatjes (2 mm in diameter) in de potdeksels om ventilatie mogelijk te maken. Een scherp verwarmd ijzeren apparaat kan worden gebruikt om de gaten te boren. - Homogeniseer de grond om de andere dag om maximaal contact van larven met grond mogelijk te maken.
OPMERKING: Vocht is belangrijk om de schimmelinfectie van larven te ondersteunen. Om vocht in de grond te houden, spuit steriel gedestilleerd water op het bodemoppervlak wanneer dat nodig is. Week het bodemmonster niet in water. - Analyseer de potten dagelijks op zoek naar dode insecten.
OPMERKING: Observeer de resterende larven in de kolonie dagelijks voor ongewervelde pathologische tekenen om ervoor te zorgen dat de insecten niet worden geïnfecteerd. Als alternatief kunnen controlepotten met steriele grond in het onderzoek worden opgenomen om de gezondheidsstatus van de insectenlarven te controleren. - Verwijder dode insecten en steriliseer ze oppervlakkig met 0,5% natriumhypochloriet gedurende 1 minuut. Plaats de steriele insecten in een vochtige kamer (relatieve vochtigheid ≥ 80%) bij 25 ± 1 °C gedurende 7 dagen om de externalisatie van entomopathogene schimmels (mycose) te bevorderen.
- Oogst bij mycose de conidia van het insectenoppervlak. Gebruik een microbiologische lus om de conidia op PDAC-medium onder een stereoscopische microscoop te plaatsen. Plaats als alternatief de hele geïnfecteerde larven op het PDAC-medium. Incubeer de kweekplaten in een klimaatkamer bij 25 ± 1 °C en de relatieve vochtigheid ≥ 80%.
- Observeer de macromorfologie en micromorfologie van de schimmelkolonies op de platen om de identiteit van EPF te bevestigen. Herhaal het kweken op PDAC totdat zuivere schimmelkolonies zijn verkregen.
OPMERKING: Gebruik de beschrijvingssleutels hieronder in stap 3 voor de identificatie van EPF-kolonies.
- Gebruik oppervlakte-gedesinfecteerde G. mellonella en T. molitor late-stage larven. Dompel de larven gedurende 1 minuut onder in 0,5% natriumhypochloriet voor sterilisatie. Was de larven twee keer met steriel water.
3. Identificatie van EPF (Metarhizium spp. en Beauveria spp.)
- Analyseer de macromorfologische kenmerken van de schimmelculturen op de platen (d.w.z. oppervlak en achterkant van kolonies, hun vorm, rand, groeisnelheid, kleur, textuur, diffuus pigment, exsudaten en luchtconidia) na 14 dagen bij 25 ± 1 ° C en relatieve vochtigheid ≥ 80%.
- Breng de luchtconidia over naar diaculturen (microcultuurtechniek)16 gedurende 3 dagen bij 25 ± 1 °C en relatieve vochtigheid ≥ 80% en kleur met lactofenolblauw om de microscopische kenmerken te observeren (d.w.z. rangschikking van conidia, conidioforen, vorm en grootte van conidia)17,18,19,20.
- Observeer de microscopische schimmelstructuren op 400x met behulp van een optische microscoop om de EPF-identificatie te bevestigen.
OPMERKING: Morfologische sleutels voor EPF worden beschreven in de rapporten van Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., en Humber 17,18,19,20. De macro- en micromorfologie van schimmelkolonies zijn de meest voorkomende criteria die worden gebruikt om filamenteuze schimmels op geslachtsniveau te identificeren. Afhankelijk van het geslacht van de EPF zullen deze morfologische kenmerken veranderen. Humber20 presenteert een identificatiesleutel voor belangrijke geslachten van schimmelentomopathogenen. Metarhizium spp. kolonies zijn bijvoorbeeld meestal cirkelvormig, poederachtig, vertonen verschillende tinten groen en kunnen exsudaat vertonen. Microscopisch gezien hebben deze kolonies conidiogene cellen die apicale zijn op breed vertakte, dicht met elkaar verweven conidioforen die een compact hymenium vormen, en cilindrisch tot ellipsoïde conidia in parallelle ketens die kolommen of plaatachtige massa's vormen. Beauveria spp. kolonies zijn meestal wit, poederachtig of katoenachtig. Ze vertonen conidiogene cellen met een verwijd basaal gedeelte dat zich aapisch in zigzagrichting uitstrekt. Beauveria conidioforen vormen dichte clusters van bolvormige conidia. Moleculaire analyses zijn nodig voor de identificatie van EPF op soortniveau. - Uitvoeren van moleculaire analyses op de isolaten voor taxonomische identificatie op soortniveau. Voor de EPF-stammen die in deze studie zijn geïsoleerd, namelijk Metarhizium spp. en Beauveria spp., voeren moleculaire analyses uit op basis van de rapporten van Bischoff et al.17 en Rehner et al.18.
- Nadat u hebt bevestigd dat de isolaten EPF zijn, deponeert u de isolaten in een verzameling schimmelculturen. In de huidige studie werden de isolaten afgezet in de entomopathogene schimmelculturencollectie van het Laboratory of Microbial Control (LCM) aan de Federal Rural University of Rio de Janeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een totaal van 524 bodemmonsters werden verzameld van grasland: veeweide (165 monsters), inheems tropisch bos (90 monsters), meer (42 monsters) en gecultiveerd / akkerland (227 monsters) tussen 2015 en 2018 in de staat Rio de Janeiro, Brazilië. Details over de geografische coördinaten van monsters die positief zijn voor EPF zijn gegeven in aanvullende tabel 1.
Van de 524 bodemmonsters werden 500 monsters alleen geanalyseerd met behulp van CTC-medium en 24 monsters werden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van drie vormen van isolatie (Galleria-bait, Tenebrio-bait en het selectieve CTC-kweekmedium), zodat de relatieve efficiëntie van deze methoden kon worden geëvalueerd. Een totaal van 51 EPF-stammen werden geïsoleerd uit 524 monsters (41 Metarhizium spp. en 10 Beauveria spp.) (Figuur 1). Micromorfologische kenmerken van sommige isolaten zijn weergegeven in figuur 2. Alle schimmelstammen werden geïsoleerd uit grasland of akkerland (aanvullende tabel 1). Uit de resultaten bleek dat Metarhizium spp. vaker voorkomt dan Beauveria spp. (aanvullende tabel 1). Negen van de Metarhizium isolaten (LCM S01 tot LCM S09) werden moleculair geïdentificeerd met behulp van het ef1-a (eukaryote translatie-rekfactor 1-alfa) gen21. Hiervan werden zeven isolaten (LCM S01-LCM S06 en LCM S08) geïdentificeerd als Metarhizium anisopliae sensu stricto, terwijl twee isolaten (LCM S07 en LCM S09) werden geïdentificeerd als Metarhizium pingshaense21.
Het voorkomen van EPF (% van de positieve EPF-monsters) in de 24 onderzochte bodemmonsters met behulp van de drie verschillende isolatiemethoden is weergegeven in tabel 1. Herstelpercentages van EPF werden geanalyseerd door chi-kwadraattest. Zoals te zien is in tabel 1, bleek Galleria-aas efficiënter te zijn in de isolatie van EPF (91,7% (22/24) positieve monsters), gevolgd door T. molitor-aas (62,5% (15/24) epf-positieve monsters) en CTC-medium (41,7% (14/24) epf-positieve monsters). Deze 24 bodemmonsters toonden geen herstel van Beauveria spp., maar alleen Metarhizium.
Figuur 1: Entomopathogene schimmelkolonies van stammen geïsoleerd uit bodemmonsters. Kolonies werden gekweekt op CTC kunstmatig medium. (1) Petriplaat met schimmelkolonies uit bodemmonsters 14 dagen na incubatie op CTC-selectief medium voordat zuivere culturen worden verkregen; (2-42) Zuivere Metarhizium spp. kolonies; (43-52) Pure Beauveria spp. kolonies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Micromorfologische kenmerken van entomopathogene schimmels geïsoleerd uit bodemmonsters. Kolonies werden gedurende 3 dagen geïncubeerd op aardappel dextrose agar bij 25 ± 1 °C en de relatieve vochtigheid ≥ 80%. Het microscoopglaasje was gekleurd met lactofenolblauwe oplossing. Afbeeldingen tonen conidioforen en conidia van (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolaat LCM S01; B) metarhizium anisopliae s.s. isolaat LCM S03; C) metarhizium sp. isolaat LCM S27; (D-F) Beauveria spp. isoleert respectievelijk LCM S23, LCM S24 en LCM S20. Alle hier afgebeelde stammen werden geïsoleerd met behulp van het CTC-medium. LCM S27 werd ook teruggewonnen uit de grond met behulp van insectenaas. * Conidiophores en conidia. ** Conidiale ketens vertonen de karakteristieke zij-aan-zij plaatsing van Metarhizium sporen in aangrenzende ketens. Zwarte pijlen geven Metarhizium cilindrisch tot ellipsoïde conidia aan. Rode pijlen duiden op Beauveria bolvormige conidia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Methode van isolatie | Entomopathogene schimmels* | χ2** | |
| Positief | Negatief | ||
| Galleria-aas | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-aas | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC selectief medium | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Alleen Metarhizium spp. werden geïsoleerd | |||
| ** Chi-kwadraatanalyse, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabel 1: Voorkomen van entomopathogene schimmels (% positieve monsters) in 24 bodemmonsters met behulp van verschillende isolatiemethoden.
Aanvullende tabel 1: Geografische coördinaten, isolatiemethode, code, jaar van verzameling en soorten monsters voor landgebruik die positief zijn voor entomopathogene schimmels. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Natuurlijke en agrarische bodemhabitats zijn typische omgevingen voor EPF22 en een uitstekend natuurlijk reservoir. In de huidige studie werden twee methoden van EPF-isolatie met behulp van insectenaas versus selectief medium behandeld. De eerste stap voor isolatie is het verzamelen van de bodemmonsters. Een goede opslag en identificatie van bodemmonsters zijn cruciaal. Informatie over de breedtegraad, lengtegraad, bodemtype en bioom is essentieel voor studies met epidemiologische, modellerings- en geospatiale proefpersonen23,24. Na het verzamelen wordt aanbevolen om de monsters zo snel mogelijk (bij voorkeur binnen 7 dagen) te verwerken, omdat de levensvatbaarheid van conidia in deze bodemmonsters uiteindelijk kan afnemen. Kritieke stappen in de EPF-isolatie met behulp van CTC omvatten: a) onderzoek van CTC-platen 1 en 2 weken na incubatie (de eerste weken zijn van cruciaal belang omdat, in latere stadia, andere schimmelkolonies de EPF-ontwikkeling kunnen vernauwen), en b) het nauwkeurig identificeren van EPF-kolonies op basis van hun macromorfologie en micromorfologie. Voor isolatie met behulp van insectenaas is het essentieel om het bodemmonster vochtig te houden, maar niet in water te weken.
De resultaten gerapporteerd door verschillende studies hebben geleid tot een interpretatie dat M. anisopliae vaker voorkomt in gecultiveerde bodems dan natuurlijke ecosystemen 8,25,26. Er kunnen verschillen optreden in de verspreiding en het voorkomen van deze schimmels. In de huidige studie werden alle stammen geïsoleerd uit gecultiveerde grond (gewassen) of graslanden, en er was een overwicht van Metarhizium spp. over Beauveria spp. Er wordt gesuggereerd dat teeltpraktijken en het hoge gehalte aan organisch materiaal de aanwezigheid van saprofytische schimmels in de bodem bevorderen27. Dienovereenkomstig moeten effectieve isolatietechnieken die EPF zoeken, overwegen schimmelverontreinigingen te verminderen.
Selectieve kunstmatige media worden vaak gebruikt voor isolatie omdat ze gemakkelijk te gebruiken zijn en efficiënt zijn gebleken bij het isoleren van entomopathogene schimmels, voornamelijk Metarhizium spp. en Beauveria spp.28. Deze selectieve media gebruiken specifieke chemicaliën om de groei van verontreinigingen te verminderen. In de jaren 1980 en 1990 werd het fungicide dodine een veelgebruikt selectief medium om Metarhizium spp. en Beauveria spp.29,30 te isoleren. Hoewel deze kunstmatige media effectief zijn, kunnen sommige EPF-soorten zoals Metarhizium acridum gevoelig zijn voor dodine31. Daarom is in het onderhavige onderzoek gekozen voor het dodinevrije CTC-medium. Volgens Fernandes et al.9 werd CTC ontwikkeld om de isolatie van natuurlijk voorkomende entomopathogene schimmels, waaronder M. acridum, te maximaliseren. Het gebruik van een selectief medium in plaats van insectenaas in de isolatie van EPF is handig omdat de eerste minder ruimte nodig heeft in de monsterverwerking. Het grootste nadeel bij CTC-gebruik is afhankelijk van het feit dat sommige componenten (d.w.z. cycloheximide en chlooramfenicol) giftig zijn, dus het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen is verplicht.
Zoals waargenomen in de huidige studie, is een hoger percentage positieve monsters gemeld met insectenaas in vergelijking met kunstmatige selectieve media voor isolatie van EPF 15,32,33,34,35. Het gebruik van insectenaas wordt beschouwd als een goedkoop en zeer efficiënt alternatief in de zoektocht naar nieuwe EPF. Desondanks zijn er nadelen verbonden aan het gebruik van insectenaas ten opzichte van selectieve media. Omdat de hoeveelheid grond om te analyseren met behulp van insecten hoger is, is het ook noodzakelijk om meer fysieke ruimte te hebben om de monsters op te slaan en de potten te incuberen. De verwerving van insecten kan ook een beperking zijn. In Brazilië is G. mellonella bijvoorbeeld niet commercieel verkrijgbaar, dus het is noodzakelijk om een kolonie in het laboratorium te vestigen om dit insect als aas te gebruiken. Het is essentieel om de salubriteit van de kolonies van de insecten te behouden en natuurlijke infectie door EPF te voorkomen. Een EPF-infectie in de kolonie kan de isolatieresultaten onbetrouwbaar maken. Daarom moet men de resterende larven in de kolonie observeren op zoek naar ongewervelde pathologische tekenen. Als alternatief kunnen controlepotten met steriele grond in het onderzoek worden opgenomen om de gezondheidsstatus van de insectenlarven te controleren.
Het zoeken naar nieuwe schimmelisolaten met uitstekende biocontrole-eigenschappen is cruciaal om de effectiviteit van schimmels in geleedpotige plaagbestrijding te vergroten. Schimmels geïsoleerd uit de bodem kunnen goed worden aangepast aan het groeien in deze omgeving22, en ze hebben waarschijnlijk een hoge veldpersistentie, wat een essentieel kenmerk is van succesvolle EPF bij ongediertebestrijding21. Dienovereenkomstig kan lokaal geïsoleerde EPF de biologische bestrijding van lokale plagen verbeteren vanwege hun geografische en temporele congruentie, waardoor de kans op succes toeneemt en de milieueffecten die anders worden veroorzaakt door de toepassing van synthetische insecticiden worden verminderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) uit Brazilië, financieringscode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projectnummer E-26/010.001993/2015), en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) uit Brazilië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
