Läkemedelsinducerad leverskada (DILI) är en viktig orsak till läkemedelssvikt. Ett protokoll har utvecklats för att exakt förutsäga DILI-ansvaret för en förening med hjälp av ett levermikrofysiologiskt system (MPS). Levermodellen använder samkulturen av primära leverceller och translationellt relevanta effektmått för att bedöma cellulära svar på behandlingen.
DILI är en viktig orsak till utmattning i läkemedelsutveckling med över 1000 FDA-godkända läkemedel som är kända för att potentiellt orsaka DILI hos människor. Tyvärr upptäcks DILI ofta inte förrän läkemedel har nått kliniska stadier, vilket riskerar patienternas säkerhet och leder till betydande förluster för läkemedelsindustrin. Med tanke på att standard 2D-modeller har begränsningar när det gäller att upptäcka DILI är det viktigt att utveckla in vitro-modeller som är mer förutsägbara för att förbättra dataöversättningsbarheten. För att förstå kausalitet och mekanistiska aspekter av DILI i detalj har en human lever-MPS bestående av humana primära leverparenkymala och icke-parenkymala celler (NPC) och odlade i 3D-mikrovävnader på en konstruerad byggnadsställning under perfusion utvecklats. Kryokonserverade primära humana hepatocyter (PHH) och Kupffer-celler (HKK) odlades som mikrovävnader i MPS-plattformen i upp till två veckor, och varje förening av intresse doserades upprepade gånger på levermikrotvävnader vid sju testkoncentrationer i upp till fyra dagar. Funktionella leverspecifika effektmått analyserades (inklusive kliniska biomarkörer såsom alaninaminotransferas, ALT) för att utvärdera leverfunktionen. Akut och kronisk exponering för föreningar med olika DILI-svårighetsgrader kan bedömas genom att jämföra svar med enstaka och flerdoserade mikrovävnader. Metoden har validerats med en bred uppsättning svåra och milt hepatotoxiska föreningar. Här visar vi data för pioglitazon och troglitazon, välkända hepatotoxiska föreningar som dragits tillbaka från marknaden för att orsaka leversvikt. Sammantaget har det visat sig att lever-MPS-modellen kan vara ett användbart verktyg för att bedöma DILI och dess samband med förändringar i leverfunktionen. Modellen kan dessutom användas för att bedöma hur nya föreningar beter sig i distinkta patientundergrupper och hur toxicitetsprofiler kan påverkas av leversjukdomstillstånd (t.ex. viral hepatit, fettlever).
DILI är fortfarande den vanligaste orsaken till akut leversvikt i USA och Europa och är en ledande orsak till utmattning av föreningar i läkemedelsutvecklingsprocessen1. Nästan alla klasser av läkemedel kan orsaka levertoxicitet, med medel och antibiotika i centrala nervsystemet som de absolut vanligaste behandlingarna som orsakar DILI hos patienter2. Läkemedelsinducerad levertoxicitet orsakas av en komplex interaktion mellan genetiska, icke-genetiska och miljömässiga faktorer, vilket leder till döden av hepatocyter och andra levercelltyper, inklusive kolangiocyter och endotelceller 1,3.
DILI-orsakande medel kan klassificeras på två sätt: de som orsakar förutsägbar dosberoende leverskada eller de som orsakar idiosynkratisk DILI som är sällsynt och utvecklas oberoende av läkemedelsdos, eller administreringsväg eller administreringstid, men som är ansvarig för upp till en sjättedel av alla akuta leversvikt i USA endast4. Tyvärr upptäcks DILI ofta inte förrän läkemedel har nått de kliniska stadierna i läkemedelsutvecklingsprocessen. Läkemedelsinducerad leverskada rang (eller DILIrank) består av mer än tusen FDA-godkända läkemedel som är indelade i fyra klasser beroende på deras potential att orsaka DILI, och deras användning hos patienter måste övervakas noggrant5.
Att studera mekanismer för läkemedelshepatotoxicitet är fortfarande mycket utmanande, och därför har många prekliniska modeller utvecklats för att utforska mekanismer för DILI. Nuvarande in vitro– och in vivo-modeller som används för att förutsäga DILI i preklinisk utveckling har flera begränsningar för att ge insikter om de komplexa, mångfacetterade interaktionerna i en levande mänsklig kropp. Cancerösa levercellinjer (dvs. HepG2, HepaRG) odlade i 2D används fortfarande i de tidiga stadierna av läkemedelsutveckling för att utvärdera toxiciteten hos kandidatföreningar6. Trots det kommer dessa cellinjer från enstaka givare och visar onormala nivåer av leverfunktion och uppvisar inte alltid hög känslighet för detektion av DILI 7,8. Som ett alternativ till cancerösa levercellinjer representerar PHH bättre mänsklig leverfysiologi om de odlas på lämpligt sätt in vitro, även om det finns flera begränsningar med deras kultur, som kort inkubationstid med läkemedel, relativt kort livslängd, förlust av levergenuttryck och förändringar av läkemedelsmetaboliska funktioner 9,10,11 . PHH kan odlas på extracellulära matrisproteiner i vanliga 2D-cellodlingsplattor, men som en nackdel innebär den snabba nedgången i deras funktion att de har låg känslighet (<50%) för DILI-förutsägelse12.
Å andra sidan är testning på djurmodeller långsam, dyr och behöver en översättning mellan arter för att extrapolera förutsägelse till människor. De flesta nyutvecklade läkemedel misslyckas med att få godkännande vilket gör denna process kostsam och riskabel5. För att testa nya människospecifika modaliteter är dessutom djurmodeller mindre lämpliga på grund av skillnader i gensekvens eller immunologisk respons jämfört med människor13.
Följaktligen har intresset för mer avancerade tredimensionella (3D) in vitro-levermodeller ökat exponentiellt. Odling av PHH som sfäroida strukturer som genereras av gravitationsaggregering i hängande droppar eller på ultralåga fästytor representerar en metod med hög genomströmning för att bedöma sammansatta skulder14. PHH-sfäroider har använts för att bedöma DILI i en sjuk bakgrund (t.ex. steatos och kolestas)15. En mängd olika modeller har utvecklats för att inkludera pläterade mikromönstrade cokulturer av hepatocyter med stromala fibroblaster16, 3D-biotryckta levervävnader 17, 3D-sfäroidkulturer med eller utan leverfria icke-parenkymala celler15. Alla dessa metoder har dock fortfarande nackdelar, och odling av PHH i en mer fysiologiskt relevant mikromiljö skulle kunna ge dem högre funktionalitetsnivåer under längre tidsperioder för att möjliggöra undersökning av långvarig exponering för potentiella hepatotoxiska ämnen. För att förbättra den translationella relevansen av en avancerad in vitro-PHH-odling måste dessutom kliniskt relevanta funktionella endpoints eller biomarkörer för toxicitetsproduktion användas för att data ska kunna jämföras in vivo eller kliniska scenarier18.
I denna studie bedömde vi om en MPS, även känd som en organ-on-a-chip (OOC), in vitro-levermodell kunde användas för att förstå de detaljerade mekanistiska aspekterna av levertoxicitet. MPS har tidigare visat sig upprätthålla mycket funktionella 3D-levermikrovävnader, under flöde, i upp till 4 veckor19. Systemet har nyligen testats av FDA och visat sig ha hög reproducerbarhet vid utförande av läkemedelstoxicitet, metabolism och intracellulär ackumulering20. Dessutom, jämfört med sfäroider och sandwichkulturer, hade systemet en mer stabil funktion och högre känslighet för att detektera toxiciteten hos flera läkemedel20. Hittills har MPS använts i ett brett spektrum av applikationer som täcker ADME21, sjukdomsmodellering (HBV22, NAFLD 23,24,25) och läkemedelsinteraktioner 26, vilket potentiellt gör den mycket lämpad för att bedöma akut och kronisk DILI. Tekniken som presenteras här erbjuder ett alternativ för att stänga klyftan mellan mer traditionella cellkulturer och djurmodeller och kliniska prövningar på människa, och avancerar mot simulering av humanbiologiska förhållanden för att stödja bedömningen av kandidatföreningars levertoxicitet i prekliniska stadier av läkemedelsutvecklingsprocessen.
MPS är utformade för att rekapitulera funktionella enheter av mänskliga organ in vitro och har utvecklats för att hantera begränsningarna hos konventionella 3D-cellodlingsmodeller27. Levern är ett av de mest modellerade organen som använder MPS, och en mängd olika system har utvecklats. Den mänskliga levern är ansvarig för läkemedelsmetabolism och generering av toxiska läkemedelsmetaboliter, och dess funktion är ett nyckelelement för modell för läkemedelsutveckling, inklusive bedömning av DILI-ansvar för föreningar28. Här har vi introducerat en ny metod för att bedöma DILI med hjälp av en lever-MPS; protokollet gör det möjligt att söka mekanistiska insikter för varje förening som analyseras för att avgöra hur det kan orsaka DILI samt att vara en mycket känslig och robust analys. Levermikrovävnader bildas i MPS-plattorna, som är en samkultur av PHH och HKC och är mycket funktionella med höga nivåer av albumin- och ureaproduktion samt hög CYP3A4-aktivitet jämfört med standard in vitro-levermodeller 20.
Även om DILI-modellen som beskrivs här kan fungera som ett användbart verktyg i senare skeden av preklinisk testning i läkemedelsutvecklingsprocessen, har den också flera begränsningar. Eftersom majoriteten av MPS för närvarande finns på marknaden är det en plattform med låg genomströmning och därför svårare att använda för storskalig läkemedelsscreening. Bestående av mikrovävnader som bildas genom kokulturering av PHH och HKCs kan DILI-modellen inte heller helt fånga komplexiteten hos den mänskliga levern, och ytterligare optimering genom att införliva olika typer av celler (t.ex. immunceller) skulle vara fördelaktigt för att tillföra värde till den befintliga modellen. Denna enorganiga MPS kan också kombineras med andra organplattformar som kan dela ett gemensamt medium och tillåta organöverhörning på cellulär eller endokrin nivå, och det kan hjälpa till att bättre förstå de mekanistiska insikterna om toxicitet som inte bara är begränsade till själva levern. Dessutom kan den, som all relativt ny teknik, anses kostsam och därmed ha begränsad tillgänglighet.
MPS är en plattform som används för att utveckla organotypiska modeller av enskilda eller multi- mänskliga vävnader. Systemet består av en styrenhet, navelkabel och MPS-drivrutin i vilken plattan sätts in (figur 5A). Varje lever-MPS-platta har 12 oberoende öppna brunnar för odling av primära leverceller i 3D på konstruerade byggnadsställningar. Sammanfattningsvis är systemet QC-kontrollerat och plattorna grundas vid dag -1, PHH: erna och HKC: erna är sådda på plattorna vid dag noll (figur 5B, se 1). Inbäddade mikropumpar underlättar cirkulationen av cellodlingsmedier genom byggnadsställningarna för att underlätta bildandet av 3D-mikrovävnader (figur 5B, se 2). Formade mikrovävnader är QC’d vid dag 4, doserade med olika koncentrationer av varje förening var 48: e timme i 4 dagar och analyserade för slutpunktsbiomarkörer vid dag 8 (figur 5C). Den experimentella tidslinjen för DILI-analysen i MPS-plattan visas i figur 5D.
Figur 5: Det mikrofysiologiska systemet och den experimentella tidslinjen för en standard DILI-analys. (A) Det mikrofysiologiska systemet med dess komponenter: styrenhet (1), navelkabel (2), dockningsstation (3), MPS-drivrutin (4) och LC12-platta (5). (B) Sådd av PHH och HHKC på LC12-plattan vid dag 1 (1) och inbäddade mikropumpar underlättar cirkulationen av cellodlingsmedier med justerbara flödeshastigheter genom 3D-mikrovävnaderna sådda på byggnadsställningarna (2). (C) Ta ner ställningarna i slutet av studien. (D) Experimentell tidslinje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När du utför protokollet är det viktigt att en robust system-QC-kontroll utförs före start, kontrollera att systemet fungerar pneumatiskt korrekt och förbrukningsplattorna inspekteras visuellt och grundas effektivt för att säkerställa jämn funktionalitet i alla brunnar. Att ha högkvalitativa primära mänskliga celler är viktigt för detta protokoll, med hepatocyter som är kända för att fästa konsekvent i cellodlingsexperiment och bilda 3D-interaktioner. Upptining av dessa celler är också ett kritiskt steg, eftersom primära hepatocyter inte bör återsuspenderas genom pipetterande verkan eftersom detta snabbt kan leda till celldöd. Att ha cellviabilitet över 85% är avgörande för framgångsrik sådd, eftersom stora mängder cellulärt skräp kommer att störa 3D-mikrovävnadsbildning. QC-kontrollen av bildade levermikrotvävnader vid dag 4 är också viktig, och användaren måste se till att acceptabla nivåer av LDH och urea mäts, eftersom parametrar utanför intervallet kan vara en indikation på vävnadsbildning av dålig kvalitet och möjliggöra enkel felsökning. Slutligen måste hydrokortisonet som används i cellodlingsmediet beredas färskt på användningsdagen för att förhindra oönskad nedbrytning som kan påverka cellodlingsfunktionaliteten, eftersom det är nödvändigt för att upprätthålla hepatocyternas metaboliska funktionalitet.
Trots att den har betydande komplexitet innehåller levern MPS inte alla celltyper i den mänskliga levern. Det är möjligt att lägga till ytterligare celltyper till modell24,29 för att öka fysiologisk relevans, men dessa bör endast läggas till med en tydlig motivering för användningssammanhanget. För att studera DILI PHH är nyckelcelltypen, och införlivandet av HKC i denna modell gör att vissa immunologiska svar kan bestämmas. Det bör också noteras att PHH isolerade från mänskliga lever och kommersiellt tillgängliga kryokonserverade PHH tenderar att visa vissa variationer från parti till parti. Vi har här visat att detta protokoll ger reproducerbara resultat när det används med högkvalitativa preparat av celler. En viss variation av partipartier kan dock förväntas, och detta kan övervinnas ytterligare genom att använda sammanslagna massor av flera givare. Dessa begränsningar kan övervinnas genom att använda hepatocytliknande celler differentierade från iPSC som rekapitulerar många funktionella egenskaper hos PHH och som har använts i läkemedelsutvecklingsprocessen30. HKC visar också mycket till mycket variation och en hög aktiveringsnivå vid upptining; Därför är HKK-givare förvaliderade internt före användning i experimentell cellodling (samodling med validerade PHH) och måste ha låga nivåer av aktivering efter upptining. detta bedöms genom mätning av biomarkörerna IL-6 och TNF-alfa (se Kompletterande material).
De data som presenteras här bekräftar att analysen kan detektera DILI exakt, vilket hjälper till att identifiera levertoxiska ämnen som kanske inte detekteras av 2D10,11 och till och med vissa 3D-modeller. Data som genereras från MPS används fortfarande inte som standard av läkemedelsindustrin för regulatoriska inlämningar eller läkemedelsscreeningsändamål på grund av bristen på processstandardisering och harmonisering, inklusive reproducerbarhet mellan platser20. De data och experimentella tillvägagångssätt som demonstreras här tar upp detta och visar att levermodellen kan användas rutinmässigt och robust i DILI-skärmar för att exakt förutsäga ansvaret för nya föreningar.
Genom att mäta en rad endpoints för att producera en “signatur av levertoxicitet”, hjälpa till att identifiera föreningar med olika nivåer av DILI-oro (inklusive föreningar som inte kan detekteras med andra in vitro-metoder) och deras mekanismer för toxicitet avslöjas. Denna teknik kan stänga klyftan mellan traditionell cellodling och djurmodeller på ena sidan och kliniska prövningar på människa, och avancera mot simulering av humanbiologiska tillstånd för preklinisk bedömning av levertoxicitet som en del av läkemedelsutvecklingsprocessen.
The authors have nothing to disclose.
CN Bio Innovations Ltd. finansierade denna studie.
24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
Class 2 Microbiological Safety Cabinets – Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution – none. Time point Day 4, 6 and 8 |
>Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution – none. Time point Day 8 |
PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
Weighing balance – model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |