Summary
薬物誘発性肝障害(DILI)は、薬物不全の主な原因です。肝臓微小生理学的システム(MPS)を使用して化合物のDILI負債を正確に予測するためのプロトコルが開発されました。肝臓モデルは、初代肝細胞と翻訳関連エンドポイントの共培養を使用して、治療に対する細胞応答を評価します。
Abstract
DILIは医薬品開発における消耗の主な原因であり、1000を超えるFDA承認薬がヒトにDILIを引き起こす可能性があることが知られています。残念ながら、DILIは医薬品が臨床段階に達するまで検出されないことが多く、患者の安全を危険にさらし、製薬業界に大きな損失をもたらします。標準的な2DモデルにはDILIの検出に制限があることを考慮すると、データの翻訳可能性を向上させるために、より予測性の高いin vitroモデルを開発することが不可欠です。DILIの因果関係と機構を詳細に理解するために、ヒト初代肝実質細胞と非実質細胞(NPC)で構成され、灌流下で操作された足場上の3D微小組織で培養されたヒト肝臓MPSが開発されました。凍結保存された初代ヒト肝細胞(PHH)とクッパー細胞(HKC)をMPSプラットフォームで微小組織として最大2週間共培養し、目的の各化合物を7つの試験濃度で肝臓の微小組織に最大4日間繰り返し投与しました。肝機能を評価するために、機能的な肝臓特異的エンドポイント(アラニンアミノトランスフェラーゼ、ALTなどの臨床バイオマーカーを含む)を分析しました。さまざまなDILI重症度の化合物への急性および慢性曝露は、単回投与および複数回投与された微小組織に対する反応を比較することによって評価できます。.この方法論は、重度で軽度の肝毒性化合物の幅広いセットで検証されています。ここでは、肝不全を引き起こすために市場から撤退した有名な肝毒性化合物であるピオグリタゾンとトログリタゾンのデータを示します。全体として、肝臓MPSモデルは、DILIとその肝機能の変化との関連を評価するための有用なツールになり得ることが示されています。このモデルはさらに、新規化合物が異なる患者のサブセットでどのように振る舞うか、および毒性プロファイルが肝疾患の状態(ウイルス性肝炎、脂肪肝疾患など)によってどのように影響を受けるかを評価するために使用できます。
Introduction
DILIは、米国とヨーロッパで急性肝不全の最も一般的な原因であり、医薬品開発プロセスにおける化合物の消耗の主な原因です1。ほぼすべてのクラスの薬物が肝毒性を引き起こす可能性があり、中枢神経系の薬剤と抗生物質は、患者にDILIを引き起こす最も一般的な治療法です2。薬物誘発性肝毒性は、遺伝的要因、非遺伝的要因、および環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされ、肝細胞および胆管細胞および内皮細胞を含む他の肝細胞タイプの死につながります1,3。
DILI原因物質は2つの方法で分類できます:予測可能な用量依存性肝障害を引き起こすもの、またはまれで薬物用量、経路、または投与期間とは無関係に発症する特異体質DILIを引き起こすものの、米国のすべての急性肝不全の最大6分の1の原因となります4。残念ながら、DILIは、医薬品が医薬品開発プロセスの臨床段階に達するまで検出されないことがよくあります。薬物誘発性肝障害ランク(またはDILIrank)は、DILIを引き起こす可能性に応じて4つのクラスに分けられる1,000を超えるFDA承認薬で構成されており、患者での使用を注意深く監視する必要があります5。
薬物肝毒性のメカニズムの研究は依然として非常に困難であり、したがって、DILIのメカニズムを探索するために多くの前臨床モデルが開発されています。前臨床開発におけるDILIの予測に使用される現在のin vitroおよびin vivoモデルには、生体内の複雑で多面的な相互作用に関する洞察を提供する上でいくつかの制限があります。2Dで培養された癌性肝細胞株(すなわち、HepG2、HepaRG)は、候補化合物の毒性を評価するために、医薬品開発の初期段階で依然として使用されています6。それでも、これらの細胞株は単一ドナーからのものであり、異常なレベルの肝機能を示し、DILI 7,8の検出に対して常に高い感度を示すとは限りません。癌性肝細胞株の代替として、PHHは、in vitroで適切に培養すればヒトの肝臓生理機能をよりよく表しますが、薬物との短いインキュベーション時間、比較的短い寿命、肝遺伝子発現の喪失、薬物代謝機能の変化など、培養にはいくつかの制限があります9,10,11。.PHHは、標準的な2D細胞培養プレートの細胞外マトリックスタンパク質上で培養できますが、欠点として、機能が急速に低下するため、DILI予測に対する感度が低い(<50%)12。
一方、動物モデルでの試験は時間がかかり、費用がかかり、予測を人間に外挿するには種間の翻訳が必要です。新しく開発された医薬品のほとんどは承認を得ることができず、このプロセスには費用とリスクが伴います5。さらに、新しいヒト特異的モダリティを試験する場合、動物モデルは、遺伝子配列または免疫学的応答がヒトと異なるため、あまり適していません13。
その結果、より高度な3次元(3D)in vitro肝臓モデルへの関心が指数関数的に高まっています。PHHを、吊り下げドロップまたは超低付着面での重力凝集によって生成された回転楕円体構造として培養することは、複合負債を評価するためのハイスループットな方法を表しています14。PHHスフェロイドは、疾患の背景(脂肪症や胆汁うっ滞など)におけるDILIの評価に使用されています15。間質線維芽細胞16を有する肝細胞の播種マイクロパターン共培養16、3Dバイオプリントされた肝臓組織17、肝非実質細胞を有するまたは伴わない3Dスフェロイド培養15を含むように、多種多様なモデルが開発されている。ただし、これらの方法にはまだ欠点があり、より生理学的に関連する微小環境でPHHを培養することで、潜在的な肝毒性物質への長期曝露の調査を可能にするために、長期間にわたってより高いレベルの機能を提供できる可能性があります。さらに、任意の高度なインビトロPHH培養の翻訳関連性を改善するために、臨床的に関連する機能エンドポイントまたは毒性出力バイオマーカーを利用して、データをインビボまたは臨床シナリオで比較できるようにする必要があります18。
この研究では、臓器チップ(OOC)としても知られるMPSのin vitro肝臓モデルを使用して、肝毒性の詳細なメカニズムの側面を理解できるかどうかを評価しました。MPSは、高機能な3D肝臓微小組織をフロー下で最大4週間維持することが以前に示されています19。このシステムは最近FDAによってテストされ、薬物毒性、代謝、および細胞内蓄積を行う際に高い再現性を有することが示されている20。さらに、スフェロイドおよびサンドイッチ培養と比較すると、このシステムは、いくつかの薬物の毒性を検出する際に、より安定した機能とより高い感度を有していました20。現在まで、MPSはADME 21、疾患モデリング(HBV 22、NAFLD23、24、25)、および薬物間相互作用26をカバーする幅広いアプリケーションで使用されており、急性および慢性DILIの評価に非常に適している可能性があります。ここで紹介する技術は、従来の細胞培養と動物モデル、およびヒト臨床試験との間のギャップを埋めるための代替手段を提供し、医薬品開発プロセスの前臨床段階での候補化合物の肝毒性の評価をサポートするために、ヒト生物学的条件のシミュレーションに向けて前進します。
Protocol
すべての作業は、厳格な健康と安全の手順に従って、独自のラボのリスク評価とSOPに従ってラボで実施されました。使用されるすべての機器は、製造元のガイドラインに従って整備されます。微生物学的安全キャビネット(MBSC)は毎年整備され、Ki-Discus(ヨウ化カリウム)は英国規格に準拠してテストされています。このプロトコルは、英国ヒト組織局(HTA)の行動規範および指令に従い、インフォームドコンセント(45 CFR§46.116および§46.117)およびグッドクリニカルプラクティス(GLP)、(ICH E6)、および規制および倫理委員会の一般要件に完全に準拠するベンダーが提供する倫理的に調達された初代ヒト細胞を使用します。
1. 細胞培養培地の調製
注:-1日目にシードアドバンストDMEM培地を準備し、4°Cで保存します。 メンテナンスアドバンストDMEM培地を1日目に調製し、4°Cで最大1週間保存します。
- PHHおよびHKCの共存培養用のアドバンストDMEM培地の播種:500 mLのアドバンストDMEM培地(材料表)1本にカクテルA18 mL(最終濃度3.6%)と25 mLのFBS(最終濃度5%)を補充します。
- PHHおよびHKCの共培養用のメンテナンスアドバンストDMEM培地:500 mLアドバンストDMEM培地(材料表)のボトル1本に、カクテルB20 mL(最終濃度4%)と500 nMヒドロコルチゾンを補充します。
注意: ヒドロコルチゾンは使用日に新鮮になり、ストック溶液と必要な希釈液の調製方法の手順を以下に示します。 - メンテナンスアドバンストDMEM培地における500 nMヒドロコルチゾンの調製
- 出発ストック溶液(20 mM)の調製:7.24 mgのヒドロコルチゾン(材料表)を1 mLのガラスバイアルに計量します。計量したヒドロコルチゾンの正確な量を記録し、次の計算を使用してジメチルスルホキシド(DMSO)の量を決定します。
- 作動用100 μMヒドロコルチゾンストック溶液の調製:開始20 mMストック溶液5 μLを995 μLのアドバンストDMEMに加えます。
注:ステップ1のDMSO溶液25 μLを水または培地で希釈すると、DMSO濃度は0.5%になります。最終溶液では、DMSO濃度は0.0025%になります。この場合、5μLの追加容量は、総容量のわずかな変化をもたらす。 - アドバンストDMEMでの作業用500 nMヒドロコルチゾン溶液の調製:アドバンストDMEMで1 mLの500 nMヒドロコルチゾン溶液を調製するには、100 μMヒドロコルチゾンのストック溶液5 μLをメンテナンスアドバンストDMEM培地995 μLに追加します。
- 出発ストック溶液(20 mM)の調製:7.24 mgのヒドロコルチゾン(材料表)を1 mLのガラスバイアルに計量します。計量したヒドロコルチゾンの正確な量を記録し、次の計算を使用してジメチルスルホキシド(DMSO)の量を決定します。
2. MPSのセットアップとプライミング(-1日目)
- コントローラーを細胞培養インキュベーターのドッキングステーションハウスに接続し、新しい乾燥剤(材料表)がコントローラーの背面にある乾燥剤ジャーに追加されていることを確認します。
注意: コントローラーユニットは、時間の経過とともにインキュベーターから水分を引き出し、新鮮な乾燥剤を使用して乾いた状態に保ちます。 - 後ろにあるボートロッカースイッチを押してコントローラー の電源を入れ 、システムが安定して圧力に達するまで5分間待ちます。次に、空気圧レポートの画面をチェックして、(i)圧力リザーバ出力が~2000mBarに達し、(ii)真空リザーバ出力が~850mBarに達したことを確認します。
- 各プレートをパッケージから取り出し、すべてのウェルを目視検査して、考えられる欠陥(足場の欠落、亀裂など)をチェックします。
- ドライバー(プレートを付けた状態)をドッキングステーションに挿入して、ドライバーがドッキングステーションとコントローラーによって認識されていることを確認します。圧力リザーバー出力が100 mBar未満低下し、真空リザーバー出力が500 mBar未満増加したことを確認します。
- 500 μLのシーディングアドバンストDMEM培地(37°Cに予め加温)をリザーバー側に加えて、各ウェルをプライミングします。
- 流体がフィルターサポートを通過するまで、コントローラー画面で Prime プログラムを選択します(2.5 μL/sで3分間アップフロー)。注意: 「アップフロー」は、LC12プレートの足場を通ってリザーバーから上向きにメディアを流すことを可能にするコントローラーの設定です。
- すべてのウェルにさらに1.1 mLのシーディングアドバンストDMEM培地を充填して、表面チャネルを覆います。その後、すべてのウェルは1.6mLの全作業容量になります。
- プレート付きのドライバーを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れ、ドッキングステーションに接続して 、インキュベート プログラムを実行します。
注意: 実験で使用されるすべてのプログラム(プライム、インキュベート、シード、メディアチェンジ)は、MPSシステムで事前設定されています。播種の準備ができるまでインキュベーター内のプレートをプライミングします。
3. MPSへの肝細胞の播種(0日目)
- すべての PHHS および HKC を事前に検証します。すべてのPHHおよびHKCロットは、細胞培養実験を実施する前に社内で事前検証されています( 補足資料を参照)。
- PHHおよびHKC細胞のバイアル(材料表)を、バイアルを37°Cの水浴中で氷のわずかなスライバーだけが残るまで安定して保持することにより、解凍します。
- PHHを予熱(37°C)凍結保存された肝細胞回収培地CHRM培地(チューブあたり最大2バイアル)のチューブに直接ピペットで入れます。
- 細胞を穏やかにピペットで固定し、1 mLのCHRMを使用して、クライオチューブから残りの細胞を洗い流します。解凍して円錐形のチューブに移すときは、細胞に非常に優しくしてください。
注意 解凍中にバイアルを攪拌したり、内容物を上下にピペットで動かしたりしないでください。 - HKC細胞をクライオチューブから15 mL遠沈管内の10 mLの氷冷シーディングアドバンストDMEM培地に穏やかにピペットします。
注:HKCのバイアルは最大2つまで組み合わせることができます。 - 両方の細胞タイプを室温(RT)で100 x g で10分間遠心分離します。上清を取り除きます。
- チューブに添加した細胞のバイアルあたり1 mLを使用して、PHHを温かいシーディングアドバンストDMEM培地に、HKCを氷冷シーディングアドバンストDMEM培地に再懸濁し(細胞の凝集を減らすため)、細胞を氷上に置きます。穏やかな揺れ作用を使用して、細胞を再懸濁します。
注意: PHHは細胞死につながる可能性があるため、ピペットアクションでPHHを再懸濁しないでください。 - 複数のチューブからの細胞懸濁液を結合しますが(該当する場合-つまり、すべてのPHHが同じドナーからのものである場合)、細胞タイプを混合しないでください。
- セルをカウントします。生存率(細胞タイプ、PHHおよびHKCの両方で85%を超えている必要があります)と細胞の総数を記録します。細胞生存率が85%を下回った場合は、新しいバイアルの細胞を解凍し、細胞生存率を再評価します。
- 次の式を使用して細胞生存率を計算します。
- 各ウェルに播種する細胞懸濁液の希望量と、総播種量を400 μLにするために必要なシーディングアドバンストDMEM培地の追加容量を計算します。 ウェルあたりの細胞数:ウェルあたり0.4 x 10 6 PHHおよび0.04 x 10 6 HKC、および細胞密度0.25 x 10 6 PHHs/mL、 それぞれ0.025 x 106 HKC/mL。
- ドライバをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に挿入します。
- 上記の足場から停止点(保持リングの深いノッチを下る)、チャネル、およびリザーバーまで媒体を吸引します。培養ウェルに0.2 mLの「デッドボリューム」を残し、足場のすぐ上に到達します。気泡が形成されないように、足場の上から全媒体を取り除かないように注意する必要があります。
- 400 μLのシーディングアドバンストDMEM培地をウェルチャンバーに加え、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 培地交換 プログラムを3分間実行します。プログラムは3分後に自動的に一時停止します。
- 完了したら、ドライバーをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に戻します。
- 上記の足場から停止点および各ウェルのリザーバー端まで培地を吸引します。
- チューブを軽く揺らしてPHHを慎重に再懸濁し、必要量の細胞懸濁液を各培養ウェルに加えます。細胞懸濁液を慎重にピペットでピペッティングし、細胞がプレートの足場全体に均等に分散することを確認します。
注意: 足場全体を十分にカバーするには、ゆっくりと旋回する動きを使用して、細胞を足場にピペットで固定します。 - 同様に、HKCを注意深く再懸濁し、細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。
注意: ゆっくりと渦巻く動きを使用してHKCをシードし、足場全体に十分なカバレッジを確保します。2つの播種サブステップを分離することも、2つの細胞タイプを適切な密度で事前に混合して同時に播種することもできます。 - すべてのウェルに両方の細胞タイプが含まれたら、MPSドライバーを物理的に接続せずにインキュベーターのドッキングステーションに置き、1時間放置します。
- 1時間後、各ウェルに必要量の追加のシーディングアドバンストDMEM培地を400 μLに達するまで充填し、 シード プログラムを実行します。
- 2分後、プログラムは自動的に一時停止し、インキュベーターからドライバーを取り外し、1000 μLのSeeding Advanced DMEM培地をチャネル(ウェルチャンバーよりもリザーバー端に近い)にゆっくりと追加して、総容量1.4 mLを達成します(チャネル内のデッドボリュームはさらに200 μLです)。
- プレートをインキュベーターに移動し、 残りのシード プログラムを8時間実行します。
注:フローは8時間後に自動的にインキュベートプログラムに切り替わります。
4. メディア変更(1日目)
- ドライバをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に挿入します。
- ウェルチャンバー内のシードアドバンスドDMEM培地を停止点まで除去して 、培地交換 を実行します。
- 400 μLのメンテナンスアドバンストDMEM培地をウェルチャンバーに加え、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、培地交換プログラムを3分間実行します。プログラムは3分後に自動的に一時停止します。
- ドライバーをドッキングステーションから外し、MBSCで、リザーバーチャンバー、チャネル、および足場の上の停止点からメディアを吸引します。この時点で、培養ウェルはデッドボリュームに戻ります。
- リザーバーチャンバーに、1.4 mLの新鮮な予熱(37°C)メンテナンスアドバンストDMEM培地を補充します。
- ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。
5.肝微小組織の品質管理(QC)、培地収集、培地交換、および薬物投与(4日目)
- 4日目に、メンテナンスアドバンストDMEM培地とQCチェックを使用して 培地交換 を実行し、シードが成功したことを確認します。
注:QCは、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と尿素を測定することにより、形成された微小組織の健康状態をチェックするために使用されるプロセスです。 - QCを実行する前に、テストする各化合物の新鮮なストック溶液を調製します(各化合物の溶解度に応じて、0.1%DMSOを含むメンテナンスアドバンストDMEM培地またはメンテナンスアドバンストDMEM培地のいずれか)。それに応じて希釈液を調製し、各化合物の試験濃度を得ます。
- ドライバーとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。
- 各ウェルから50 μLの培地をピペットを使用して96ウェルプレートに移し、サンプリング前にLDHアッセイ(材料表)を実行し、尿素アッセイ(材料表)に25 μLを移します。
注意: LDHおよび尿素アッセイは、製造元の指示に従って実行されます。 - LDH測定値が2 AU / 10 6細胞未満で、尿素が40 μg/日/ 106細胞を超える場合は、QC後に実験を続行します。
注:アルブミンは、当日の実行に時間がかかるアッセイであり、4日目に採取されたサンプルから実験が完了すると後でアッセイされるため、QCとしては使用されません。 - QCに不合格の井戸がある場合は、実験計画から削除します。
- 実験レイアウトが確認されたら、足場に触れて細胞培養を妨げないようにしながら、各ウェルから残りの培地をサンプリングします。採取した培地(投与前サンプルとしてラベル付け)を-80°Cで保存し、後でアッセイします。
- MBSC で メディアの変更 を実行するには、手順 4.3 から 4.5 を実行します。ウェルを、実験デザインに従って適切な薬物濃度のメンテナンスアドバンストDMEM培地に変更します。
- 完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。
6.メディアの収集、メディアの変更、薬物投与(6日目)
- テストする各化合物の新鮮なストック溶液を調製します(各化合物の溶解度に応じて、0.1%DMSOを含むメンテナンスアドバンストDMEM培地またはメンテナンスアドバンストDMEM培地のいずれか)。プレート計画に従って各化合物の試験濃度が得られるように、それに応じて希釈液を調製します。
- ドライバとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。
- 各ウェル(~1 mL)からピペットで手動で培地を採取し、足場に触れて細胞培養を妨げないようにし、LDHと尿素をアッセイします。採取した培地の残りを後のアッセイのために-80°Cで保存し、投与後48時間のサンプルで標識します。
- 手順4.3〜4.5に従って 培地交換 を実行して、4日目と同じ薬物濃度でプレート計画に従って各ウェルを再投与します。.
- 完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。
7. 実験の終了(8日目)
- ドライバとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。
- ピペットを使用して各ウェルから培地を手動でサンプリングし、足場に触れて細胞培養を妨げないようにします。
- 回収した培地をLDHおよび尿素用にアッセイし、回収した培地の残りを後のアッセイのために-80°Cで保存します。
- CYP3A4-gloアッセイの実行。
- このアッセイを使用して、実験終了時にPHHのシトクロムP450 CYP3A4活性に対して試験された薬物の効果を測定します。
- 製造元の指示に従って、検出試薬を再構成します(CYP3A4アッセイの場合は、 材料の表を参照)。検出試薬を再構成して凍結したことがある場合は、-20°Cの冷凍庫から取り出し、RTで解凍します。
- 製造元の指示に従って、20 mMストックD-ルシフェリン標準を準備します。
- メンテナンスアドバンストDMEM培地(ウェルあたり2 mLの発光基質培地)でルシフェリンIPAを1:1000希釈して、実用的な発光基質培地を準備します。
- 発光性基質培地を使用して、手順4.3〜4.5で説明されている ようにメディア交換 を実行します。500 μLの発光基質培地を、投入材料として1.5 mLガラスバイアル(材料表)に保存します。
- ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを1.5時間実行します。
- 製造元の指示に従って1.5 mLチューブの培地でD-ルシフェリン標準曲線を作成し、ブランクまたは0 μMの培地を使用して、白色不透明な96ウェルプレート( 材料の表を参照)上に各標準物質50 μLを複製してピペットします。
- 時間が経過したら、手順に従って、ドッキングステーションとCYP3A4アッセイ用のサンプルメディアからドライバーを取り外し、手順7.4.9-7.4.13を実行します。
- インキュベーション後、各ウェルおよび投入材料から50 μLのサンプル培地を、標準物質を含む96ウェルの不透明な白色ルミノメータープレートに移します。トップスタンダードとサンプル測定値の間の軽いキャリーオーバーを避けるために、標準とサンプルの間の不透明なプレートに少なくとも2つの空の列を残すように注意してください。
- 50 μLのルシフェリン検出試薬を各ウェルに追加して、発光反応を開始します。
- プレートシェーカーでRTでプレートを暗所で20分間インキュベートし、発光信号を安定させます。
- ルミノメーターまたはCCDカメラを使用して発光を記録します。
- 各点の平均を取り、空白の平均を引くことによって、標準曲線をプロットします。線の式を使用して、残りのサンプルの代謝率(pmol/min/106 細胞)を計算し、行われた希釈を含めることを忘れないでください。
- ピンセットを使用してプレートから足場を取り外し、微小組織を乱さないように注意しながら、各ウェルに500 μLのD-PBS(Ca++およびMg++なし)を含む24ウェルプレートに入れます。
- 倍率10倍の倒立光学顕微鏡を使用して、各足場のスナップショットを撮ります。
- 製造元の指示に従ってATPアッセイ( 材料表を参照)を実行します。
- RTで試薬を解凍します。
- 洗浄ステップごとに、500 μLのD-PBS(Ca++およびMg++なし)で足場を2回洗浄します。
- 各足場に120 μLの試薬と120 μLのPBSを追加し、同じ容量を空のウェルに追加します(これはブランクとして機能します)。アルミホイルで覆われたプレートをシェーカーに置き、5分間激しく振とう(500 rpm)、続いて30分間インキュベートして発光信号を安定させます。
- 溶解したサンプル100 μLを、測定用の透明な平底96ウェルアッセイプレートに二重に移します。ブランクウェルが高発光の他の測定ウェルの隣に配置されていないことを確認してください。
- マイクロプレートリーダーを使用して発光を記録します。
- サンプルの発光と標準の発光を比較して、サンプル中の試薬によって検出されたATPを決定します。
Representative Results
原稿には、DILIの評価に使用される肝臓MPSモデルが記載されています。MPSは、フロー下で最大4週間高機能を維持する3D肝臓微小組織の生成を容易にします。PHH / HKCは、コラーゲンでコーティングされた足場に播種されて肝臓の微小組織を形成し、成長培地で灌流され、QCチェックに合格した後、化合物が投与されます。ここでは、構造的に類似しているがDILI重症度が異なる2つの化合物であるトログリタゾンとピオグリタゾンのデータを示します。
4日目に、薬物投与の前に、形成された肝臓微小組織のQCチェックが評価され、LDH放出と尿素合成で構成されます(図1A)。QCは、肝臓MPSが非常に一貫性があり機能する肝臓微小組織を生成することを確認することを目的としています。ここに示されているデータは3つの実験から生成され、研究内および研究間の変動性が低く、良好なレベルの再現性を示しています。8日間の培養後、複数の健康および肝臓の指標(アルブミン、尿素、CYP3A4、ATP)が評価され、対照の微小組織は高レベルの肝機能と再現性を示します(図1B、C)。肝臓微小組織の造影顕微鏡およびIF染色( 補足資料を参照)は、足場のマイクロチャネル全体で高い播種一貫性を示し、PHH微小組織におけるHKCの分布を明らかにします(図1D)。
図1:肝臓MPSは、再現性の高いデータと一貫した微小組織を生成します。 (A)4日目の3D肝臓微小組織QCメトリック、および8日目の研究終了時の機能評価-(B)アルブミンと尿素、(C)CY3A4とATP)。データは3つの実験から収集されます。各実験では、3つの車両制御の反復がありました。示されているデータは平均±SD、N = 9です。(D)DILIを評価するための肝臓MPSプラットフォームでPHHとHKCを共培養することによって生成された3D肝臓微小組織の位相差顕微鏡(10倍および20倍)およびIF。HKCを可視化するために、HKCを播種する前に、eGFPを発現するアデノウイルスベクターで形質導入した( 補足資料を参照)。代表的な顕微鏡写真を示す。形質導入およびイメージングは、細胞局在を実証するための単独の実験として実施され、記載されたDILIプロトコルでは行われなかった。HKC細胞は、実験的な細胞培養で使用する前に社内で事前に検証されており、解凍後の活性化レベルが低い必要があります。これは、バイオマーカーIL-6およびTNF-αを測定することによって評価される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
トログリタゾンは重度のDILIを引き起こすことが知られています。2型糖尿病の治療のためのライセンスに続いて、その使用に関連する肝障害の頻度のために、市場で3年後にFDAによって撤回されました。現在まで、発表された動物実験では、トログリタゾンが重度の肝障害を引き起こす可能性を予測できませんでした。.この化合物の毒性は、標準的な in vitro 2D肝臓アッセイ14においても検出されなかった。
MPSの肝臓微小組織にトログリタゾンを96時間投与し、トログリタゾンへの急性曝露後、約15 x C maxでALTおよびLDH放出およびアルブミンおよび尿素産生の急速な減少によって検出された急性毒性反応、Cmax駆動を引き起こしました(図2A)。96時間曝露後にサンプリングされた細胞エンドポイント(ATP含量)およびCYP3A4活性(代謝生体内変化を評価するため)は、トログリタゾンおよびEC:50値によって引き起こされる毒性をさらに確認し、他のエンドポイントと非常に同等であった(図2B)。MPSで8日間培養した後に撮影された明視野顕微鏡画像は、ポジティブコントロールとトログリタゾンで処理された反復で見られる一般的な組織の死/分解とは対照的に、足場全体に均一に播種された健康な肝臓微小組織を明らかにします(図2C)。
図2:複数の肝毒性エンドポイントを使用したトログリタゾンのDILIリスクの決定。 肝臓微小組織を7つの試験濃度のトログリタゾンに96時間曝露し、(A)LDH放出、ALT放出、アルブミン産生、尿素合成、CYP3A4活性、およびATP含有量を比較しました。青い線 - 48時間のばく露(メディアエンドポイントのみ)、赤い線 - 96時間のばく露。陽性対照は100μMクロルプロマジンであった。すべてのエンドポイントは、同じ肝臓MPS培養から測定されます。示されているデータはSD±平均値であり、N=3である。(B)データから生成されたE:50番号の要約。N.D. = データはプロットできません。ライン=アッセイされていません。(C)8日間培養後の肝臓微小組織の代表的な明視野顕微鏡(倍率10倍)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ピオグリタゾンへの曝露後の肝毒性も調査されました。.ピオグリタゾンは、DILIの懸念が低いことが知られている化合物であり4、古典的な2D初代肝細胞培養物、さらにはいくつかのより高度な3Dモデルでも肝毒性を発揮しませんでした10,11。軽度の肝毒性効果は、両方の試験時点で観察されました(図3)。LDH または ALT の放出は検出されませんでした。しかし、48時間後、アルブミンと尿素の生成の穏やかな減少が観察され、約25x Cmaxでした(図3A)。ATP含量のごくわずかな減少も高ピオグリタゾン濃度で観察されたが、これは有意ではなかった。用量反応曲線から生成されたEC:50値を図3Bに示します。顕微鏡検査では、2つの最高試験濃度でピオグリタゾンに96時間曝露した後、わずかな微小組織の変化が明らかになりました(図3C)。結果は、軽度のDILI懸念のある化合物の毒性を検出する肝臓MPSの能力を示しています。
図3:複数の肝毒性エンドポイントを使用したピオグリタゾンのDILIリスクの決定。 肝臓微小組織を7つの試験濃度のピオグリタゾンに96時間曝露し、(A)LDH放出、ALT放出、アルブミン産生、尿素合成、CYP3A4活性、およびATP含有量を比較しました。青い線 - 48時間のばく露(メディアエンドポイントのみ)、赤い線 - 96時間のばく露。陽性対照は100μMクロルプロマジンであった。すべてのエンドポイントは、同じ肝臓MPS培養から測定されます。示されているデータはSD±平均値であり、N=3である。(B)データから生成されたEC:50番号の要約。N.D. = データはプロットできません。ライン=アッセイされていません。(C)8日間培養後の肝臓微小組織の代表的な明視野顕微鏡(倍率10倍)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
in vivoまたは臨床シナリオ(LDH放出、尿素合成、アルブミン産生、CYP3A4活性、ATP含量、ALT放出)を表す可能性のあるすべての機能エンドポイントおよび毒性出力バイオマーカーを評価し、48時間および96時間の7点用量範囲で投与された両方の試験化合物について生成されたデータを裏付けることにより、「肝毒性の署名」をもたらすヒートマップが生成されました。 さまざまなレベルのDILI懸念を持つ化合物の特定に役立ちます(図4)。
図4:肝臓MPSによる「毒性の兆候」の決定。 7点線量範囲への48時間および96時間の曝露後の6つの機能的肝臓特異的エンドポイント(LDH放出、尿素合成、アルブミン産生、ALT放出、CYP3A4活性、およびATP含有量)からのトログリタゾンおよびピオグリタゾンのヒートマップ。各値は平均、N = 3として生成され、対照サンプルに正規化されます。カラーバーの値は、ベースラインコントロールに対する倍率の増加を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足資料:微小組織の蛍光顕微鏡イメージングと細胞の事前認定評価。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
MPSは、ヒト臓器の機能単位を in vitroで 再現するように設計されており、従来の3D細胞培養モデルの限界に対処するために開発されました27。肝臓はMPSを用いた最もモデル化された臓器の一つであり、多種多様なシステムが開発されています。ヒトの肝臓は、薬物代謝および毒性薬物代謝物の生成に関与しており、その機能は、化合物28のDILI責任の評価を含む、医薬品開発のモデルにとって重要な要素である。ここでは、肝臓MPSを使用してDILIを評価するための新しい方法を紹介しました。このプロトコルにより、アッセイされた各化合物について機構的な洞察を求め、DILIがどのように引き起こされるかを判断することができ、高感度で堅牢なアッセイでもあります。肝臓微小組織は、PHHとHKCの共培養であるMPSプレートで形成され、標準的な in vitro 肝臓モデルと比較して、高レベルのアルブミンおよび尿素産生および高いCYP3A4活性を備えた高機能です20。
ここで説明するDILIモデルは、医薬品開発プロセスにおける前臨床試験の後期段階で有用なツールとして機能しますが、いくつかの制限もあります。現在市場で入手可能なMPSの大部分として、それは低スループットプラットフォームであり、したがって、大規模な薬物スクリーニング活動に使用することはより困難です。PHHとHKCの共培養によって形成された微小組織で構成されるDILIモデルも、ヒト肝臓の複雑さを完全に捉えることができず、異なる種類の細胞(免疫細胞など)を組み込むことによるさらなる最適化は、既存のモデルに付加価値を与えるのに有益です。この単一臓器MPSは、共通の培地を共有し、細胞レベルまたは内分泌レベルで臓器クロストークを可能にし、肝臓自体に限定されない毒性の機構的洞察をよりよく理解するのに役立つ他の臓器プラットフォームと組み合わせることもできます。さらに、比較的新しいテクノロジーと同様に、コストがかかり、アクセスが制限されていると見なされる可能性があります。
MPSは、単一または複数のヒト組織の有機型モデルを開発するために使用されるプラットフォームです。システムは、コントローラ、アンビリカルケーブル、およびプレートが挿入されるMPSドライバで構成されています(図5A)。各肝臓MPSプレートには、操作された足場上で初代肝細胞を3Dで培養するための12個の独立したオープンウェルがあります。要約すると、システムはQCチェックされ、プレートは-1日目にプライミングされ、PHHとHKCはゼロ日目にプレートに播種されます(図5B、1を参照)。埋め込まれたマイクロポンプは、足場を通る細胞培養培地の循環を促進し、3D微小組織の形成を促進します(図5B、2を参照)。形成された微小組織は4日目にQCされ、48時間ごとに4日間異なる濃度の各化合物を投与され、8日目にエンドポイントバイオマーカーについてアッセイされます(図5C)。MPSプレートにおけるDILIアッセイの実験タイムラインを 図5Dに示す。
図5:標準的なDILIアッセイの微小生理学的システムと実験タイムライン。 (A)マイクロ生理学的システムとそのコンポーネント:コントローラー(1)、アンビリカルケーブル(2)、ドッキングステーション(3)、MPSドライバー(4)、LC12プレート(5)。(B)1日目にLC12プレートにPHHとHKCを播種し(1)、埋め込まれたマイクロポンプにより、足場に播種された3D微小組織を通る調整可能な流速で細胞培養培地の循環が容易になります(2)。(C)研究の最後に足場を降ろす。(D)実験のタイムライン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
プロトコルを実行する際には、起動前に堅牢なシステムQCチェックを実行し、システムが空気圧で正しく機能していることを確認し、消耗プレートを効率的に検査してプライミングして、すべてのウェルで均一な機能を確認することが重要です。このプロトコルには高品質の初代ヒト細胞が不可欠であり、肝細胞は細胞培養実験で一貫して接着し、3D相互作用を形成することが知られています。これらの細胞の融解も重要なステップであり、初代肝細胞は急速に細胞死につながる可能性があるため、ピペッティング作用によって再懸濁されるべきではありません。大量の細胞破片が3D微小組織の形成を妨げるため、播種を成功させるには85%を超える細胞生存率を持つことが重要です。4日目に形成された肝臓微小組織のQCチェックも重要であり、範囲外のパラメータは質の悪い組織形成を示し、簡単なトラブルシューティングを可能にする可能性があるため、ユーザーはLDHと尿素の許容レベルが測定されていることを確認する必要があります。最後に、細胞培養培地に使用されるヒドロコルチゾンは、肝細胞の代謝機能を維持するために必要であるため、細胞培養機能に影響を与える可能性のある望ましくない分解を防ぐために、使用日に新鮮に調製する必要があります。
非常に複雑であるにもかかわらず、肝臓MPSはヒト肝臓のすべての細胞型を含むわけではありません。生理学的関連性を高めるためにモデル24、29にさらに細胞型を追加することは可能ですが、これらは使用の文脈に対する明確な正当化とともにのみ追加されるべきです。DILIを研究するためには、PHHが重要な細胞型であり、このモデルにHKCを組み込むことで、いくつかの免疫学的応答を決定することができます。また、ヒトの肝臓から単離されたPHHおよび市販の凍結保存されたPHHは、ロットごとにいくつかのばらつきを示す傾向があることにも注意する必要があります。ここでは、このプロトコルを高品質の細胞調製物とともに使用すると再現性のある結果が得られることを実証しました。ただし、ロット間の変動が予想され、これは複数のドナーのプールされたロットを使用することでさらに克服できます。これらの制限は、PHHsの多くの機能特性を再現し、医薬品開発プロセスで使用されてきたiPS細胞から分化した肝細胞様細胞を使用することによって克服することができた30。HKCはまた、ロット間の変動性が高く、解凍時に高レベルの活性化を示します。したがって、HKCのドナーは、実験的細胞培養(検証済みのPHHとの共培養)で使用する前に社内で事前に検証されており、解凍後の活性化のレベルが低い必要があります。これは、バイオマーカーIL-6およびTNF-αを測定することによって評価されます(補足資料を参照)。
ここに示されているデータは、アッセイがDILIを正確に検出できることを確認しており、2D10,11、さらには一部の3Dモデルでは検出されない可能性のある肝毒性物質を特定するのに役立ちます。MPSから生成されたデータは、サイト間の再現性を含むプロセスの標準化と調和が不足しているため、規制当局への提出や薬物スクリーニングの目的で製薬業界によって標準としてまだ使用されていません20。ここで示されているデータと実験的アプローチはこれに対処し、肝臓モデルをDILIスクリーニングで日常的かつ堅牢に使用して、新規化合物の責任を正確に予測できることを示しています。
さまざまなエンドポイントを測定して「肝毒性のシグネチャー」を生成することにより、さまざまなレベルのDILI懸念を持つ化合物(他のin vitro方法では検出できない化合物を含む)とその毒性メカニズムを特定するのに役立ちます。この技術は、従来の細胞培養と動物モデル、およびヒト臨床試験との間のギャップを埋めることができ、医薬品開発プロセスの一環として肝毒性の前臨床評価のためのヒト生物学的条件のシミュレーションに向けて前進します。
Disclosures
すべての著者はCN Bio Innovations Limitedの従業員です。
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd.がこの研究に資金を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
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