Summary
Arzneimittelinduzierte Leberschäden (DILI) sind eine Hauptursache für Arzneimittelversagen. Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die DILI-Haftung einer Verbindung unter Verwendung eines mikrophysiologischen Lebersystems (MPS) genau vorherzusagen. Das Lebermodell nutzt die Kokultur von primären Leberzellen und translational relevanten Endpunkten, um das zelluläre Ansprechen auf die Behandlung zu bewerten.
Abstract
DILI ist eine Hauptursache für Fluktuation in der Arzneimittelentwicklung mit über 1000 FDA-zugelassenen Medikamenten, von denen bekannt ist, dass sie DILI beim Menschen verursachen. Leider wird DILI oft erst erkannt, wenn Medikamente klinische Stadien erreicht haben, was die Sicherheit der Patienten gefährdet und zu erheblichen Verlusten für die Pharmaindustrie führt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Standard-2D-Modelle Einschränkungen bei der Erkennung von DILI haben, ist es wichtig, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die prädiktiver sind, um die Datenübersetzbarkeit zu verbessern. Um Kausalität und mechanistische Aspekte von DILI im Detail zu verstehen, wurde ein humanes Leber-MPS entwickelt, das aus humanen primären Leberparenchym- und Nicht-Parenchymzellen (NPCs) besteht und in 3D-Mikrogeweben auf einem künstlichen Gerüst unter Perfusion kultiviert wird. Kryokonservierte primäre humane Hepatozyten (PHHs) und Kupffer-Zellen (HKCs) wurden bis zu zwei Wochen lang als Mikrogewebe in der MPS-Plattform kokultiviert, und jede Verbindung von Interesse wurde in sieben Testkonzentrationen für bis zu vier Tage wiederholt auf Lebermikrogewebe dosiert. Funktionelle leberspezifische Endpunkte wurden analysiert (einschließlich klinischer Biomarker wie Alaninaminotransferase, ALT), um die Leberfunktion zu bewerten. Die akute und chronische Exposition gegenüber Verbindungen verschiedener DILI-Schweregrade kann durch den Vergleich der Reaktionen auf Einzel- und Mehrfachdosen von Mikrogeweben beurteilt werden. Die Methodik wurde mit einer breiten Palette schwerer und leicht hepatotoxischer Verbindungen validiert. Hier zeigen wir die Daten für Pioglitazon und Troglitazon, bekannte hepatotoxische Verbindungen, die vom Markt genommen wurden, um Leberversagen zu verursachen. Insgesamt hat sich gezeigt, dass das Leber-MPS-Modell ein nützliches Werkzeug sein kann, um DILI und seinen Zusammenhang mit Veränderungen der Leberfunktion zu beurteilen. Das Modell kann auch verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich neuartige Verbindungen in verschiedenen Patientenuntergruppen verhalten und wie Toxizitätsprofile durch Lebererkrankungszustände (z. B. Virushepatitis, Fettlebererkrankung) beeinflusst werden können.
Introduction
DILI ist nach wie vor die häufigste Ursache für akutes Leberversagen in den USA und Europa und eine der Hauptursachen für den Abrieb von Wirkstoffen im Arzneimittelentwicklungsprozess1. Fast alle Klassen von Medikamenten können Hepatotoxizität verursachen, wobei Mittel des zentralen Nervensystems und Antibiotika bei weitem die häufigsten Behandlungen sind, die DILI bei Patienten verursachen2. Arzneimittelinduzierte Hepatotoxizität wird durch ein komplexes Zusammenspiel von genetischen, nicht-genetischen und Umweltfaktoren verursacht, die zum Tod von Hepatozyten und anderen Leberzelltypen, einschließlich Cholangiozyten und Endothelzellen, führen 1,3.
DILI-Erreger können auf zwei Arten klassifiziert werden: solche, die vorhersagbare dosisabhängige Leberschäden verursachen oder solche, die idiosynkratische DILI verursachen, die selten ist und sich unabhängig von Medikamentendosis, Weg oder Verabreichungsdauer entwickelt, aber für bis zu einem Sechstel aller akuten Leberversagen in den USA verantwortlich ist4. Leider wird DILI oft erst erkannt, wenn Medikamente die klinischen Phasen des Arzneimittelentwicklungsprozesses erreicht haben. Der medikamenteninduzierte Leberverletzungsrang (oder DILIrank) besteht aus mehr als tausend von der FDA zugelassenen Arzneimitteln, die nach ihrem Potenzial zur Entstehung von DILI in vier Klassen unterteilt sind, und ihre Verwendung bei Patienten muss engmaschig überwacht werden5.
Die Untersuchung der Mechanismen der Arzneimittelhepatotoxizität bleibt eine große Herausforderung, und daher wurden viele präklinische Modelle entwickelt, um die Mechanismen von DILI zu untersuchen. Aktuelle In-vitro- und In-vivo-Modelle, die zur Vorhersage von DILI in der präklinischen Entwicklung verwendet werden, haben mehrere Einschränkungen, um Einblicke in die komplexen, facettenreichen Interaktionen in einem lebenden menschlichen Körper zu geben. Krebsartige Leberzelllinien (d. h. HepG2, HepaRG), die in 2D kultiviert werden, werden immer noch in den frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung zur Bewertung der Toxizität von Kandidatenverbindungen verwendet6. Dennoch stammen diese Zelllinien von Einzelspendern und zeigen eine abnormale Leberfunktion und zeigen nicht immer eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis von DILI 7,8. Als Alternative zu krebsartigen Leberzelllinien repräsentieren PHHs die menschliche Leberphysiologie besser, wenn sie in vitro entsprechend kultiviert werden, obwohl mehrere Einschränkungen mit ihrer Kultur bestehen, wie kurze Inkubationszeit mit Medikamenten, relativ kurze Lebensdauer, Verlust der hepatischen Genexpression und Veränderungen der metabolischen Funktionen des Arzneimittels 9,10,11 . PHHs können auf extrazellulären Matrixproteinen in Standard-2D-Zellkulturplatten kultiviert werden, aber als Nachteil bedeutet der schnelle Rückgang ihrer Funktion, dass sie eine geringe Empfindlichkeit (<50%) für die DILI-Vorhersage12 haben.
Auf der anderen Seite ist das Testen an Tiermodellen langsam, teuer und erfordert eine artübergreifende Übersetzung, um die Vorhersage auf den Menschen zu extrapolieren. Die meisten neu entwickelten Medikamente erhalten keine Zulassung, was diesen Prozess kostspielig und riskant macht5. Darüber hinaus sind Tiermodelle für die Erprobung neuer humanspezifischer Modalitäten aufgrund von Gensequenz- oder immunologischen Reaktionsunterschieden im Vergleich zum Menschen weniger geeignet13.
Folglich ist das Interesse an fortgeschritteneren dreidimensionalen (3D) In-vitro-Lebermodellen exponentiell gewachsen. Die Kultivierung von PHHs als sphäroidale Strukturen, die durch gravitative Aggregation in hängenden Tropfen oder auf extrem niedrigen Befestigungsflächen erzeugt werden, stellt eine Hochdurchsatzmethode zur Bewertung von zusammengesetzten Verbindlichkeiten dar14. PHH-Sphäroide wurden verwendet, um DILI in einem erkrankten Hintergrund (z. B. Steatose und Cholestase) zu beurteilen15. Eine Vielzahl von Modellen wurde entwickelt, um plattierte mikrostrukturierte Kokulturen von Hepatozyten mit Stromafibroblasten16, 3D-biogedrucktes Lebergewebe 17, 3D-Sphäroidkulturen mit oder ohne hepatische nicht-parenchymale Zellen15 einzubeziehen. Alle diese Methoden haben jedoch immer noch Nachteile, und die Kultivierung von PHHs in einer physiologisch relevanteren Mikroumgebung könnte ihnen über längere Zeiträume ein höheres Maß an Funktionalität verleihen, um die Untersuchung einer längeren Exposition gegenüber potenziellen Hepatotoxinen zu ermöglichen. Um die translationale Relevanz einer fortgeschrittenen In-vitro-PHH-Kultur zu verbessern, müssen darüber hinaus klinisch relevante funktionelle Endpunkte oder Toxizitäts-Output-Biomarker verwendet werden, um Daten in vivo oder klinischen Szenarien vergleichen zu können18.
In dieser Studie untersuchten wir, ob ein MPS, auch bekannt als Organ-on-a-Chip (OOC), In-vitro-Lebermodell verwendet werden kann, um die detaillierten mechanistischen Aspekte der Lebertoxizität zu verstehen. Es wurde bereits gezeigt, dass das MPS hochfunktionelle 3D-Lebermikrogewebe bis zu 4 Wochen lang im Fluss hält19. Das System wurde kürzlich von der FDA getestet und hat nachweislich eine hohe Reproduzierbarkeit bei der Durchführung von Arzneimitteltoxizität, Metabolismus und intrazellulärer Akkumulation20. Darüber hinaus hatte das System im Vergleich zu Sphäroiden und Sandwichkulturen eine stabilere Funktion und eine höhere Empfindlichkeit beim Nachweis der Toxizität mehrerer Wirkstoffe20. Bisher wurde das MPS in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, die ADME21, Krankheitsmodellierung (HBV22, NAFLD 23,24,25) und Arzneimittelwechselwirkungen 26 abdecken, wodurch es möglicherweise sehr gut für die Beurteilung akuter und chronischer DILI geeignet ist. Die hier vorgestellte Technologie bietet eine Alternative, um die Lücke zwischen traditionelleren Zellkulturen und Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen zu schließen und die Simulation menschlicher biologischer Bedingungen voranzutreiben, um die Bewertung der Lebertoxizität der Kandidatenverbindungen in präklinischen Phasen des Arzneimittelentwicklungsprozesses zu unterstützen.
Protocol
Alle Arbeiten wurden im Labor nach strengen Gesundheits- und Sicherheitsverfahren und in Übereinstimmung mit den eigenen Laborrisikobewertungen und SOPs durchgeführt. Alle verwendeten Geräte werden gemäß den Richtlinien des Herstellers gewartet. Mikrobiologische Sicherheitswerkbänke (MBSCs) werden jährlich gewartet und Ki-Discus (Kaliumjodid) nach britischen Standards getestet. Das Protokoll folgt dem Verhaltenskodex und den Richtlinien der United Kingdom Human Tissue Authority (HTA) und verwendet ethisch einwandfreie primäre menschliche Zellen, die von Anbietern geliefert werden, die die allgemeinen Anforderungen an die Einwilligung nach Aufklärung (45 CFR §46.116 und §46.117) und die Gute Klinische Praxis (GLP) (ICH E6) sowie Regulierungs- und Ethikkommissionen vollständig erfüllen.
1. Vorbereitung von Zellkulturmedien
HINWEIS: Seeding Advanced DMEM-Medium am Tag -1 vorbereiten und bei 4 °C lagern. Maintenance Advanced DMEM medium an Tag 1 vorbereiten und bis zu 1 Woche bei 4 °C lagern.
- Seeding Advanced DMEM-Medium für PHHs und HKCs-Kokultur: Ergänzen Sie eine Flasche 500 ml Advanced DMEM-Medium (Table of Materials) mit 18 mL Cocktail A (Endkonzentration von 3,6%) und mit 25 ml FBS (Endkonzentration 5%).
- Maintenance Advanced DMEM-Medium für PHHs und HKCs-Kokultur: Ergänzen Sie eine Flasche 500 mL Advanced DMEM-Medium (Table of Materials) mit 20 mL Cocktail B (Endkonzentration von 4%) und 500 nM Hydrocortison.
HINWEIS: Hydrocortison wird am Tag der Anwendung frisch hergestellt, und die Schritte zur Herstellung der Stammlösung und der erforderlichen Verdünnungen sind unten aufgeführt. - Herstellung von 500 nM Hydrocortison in Maintenance Advanced DMEM Medium
- Herstellung der Ausgangslösung (20 mM): 7,24 mg Hydrocortison (Table of Materials) werden in eine 1 ml Glasdurchstechflasche eingewogen. Erfassen Sie die genaue Menge an gewogenem Hydrocortison und bestimmen Sie das Volumen von Dimethylsulfoxid (DMSO) anhand der folgenden Berechnung:
- Herstellung der 100 μM Hydrocortison-Stammlösung: 5 μL der Ausgangs-20 mM-Stammlösung zu 995 μL Advanced DMEM geben.
HINWEIS: Die Verdünnung von 25 μL der DMSO-Lösung aus Schritt 1 in Wasser oder Medien führt zu einer DMSO-Konzentration von 0,5%. In der beträgt die DMSO-Konzentration 0,0025%. In diesem Fall führt das zusätzliche Volumen von 5 μL zu einer unbedeutenden Veränderung des Gesamtvolumens. - Herstellung der 500 nM Hydrocortisonlösung in Advanced DMEM: Zur Herstellung von 1 ml 500 nM Hydrocortisonlösung in Advanced DMEM werden 5 μL der Stammlösung von 100 μM Hydrocortison zu 995 μL des Maintenance Advanced DMEM-Mediums gegeben.
- Herstellung der Ausgangslösung (20 mM): 7,24 mg Hydrocortison (Table of Materials) werden in eine 1 ml Glasdurchstechflasche eingewogen. Erfassen Sie die genaue Menge an gewogenem Hydrocortison und bestimmen Sie das Volumen von Dimethylsulfoxid (DMSO) anhand der folgenden Berechnung:
2. MPS-Einrichtung und Grundierung (Tag -1)
- Schließen Sie den Controller in einem Zellkulturinkubator an das Dockingstationshaus an und stellen Sie sicher, dass frisches Trockenmittel (Table of Materials) in das Trockenmittelglas auf der Rückseite des Controllers gegeben wird.
HINWEIS: Die Steuereinheit zieht im Laufe der Zeit Feuchtigkeit aus dem Inkubator und wird mit frischem Trockenmittel trocken gehalten. - Schalten Sie den Controller ein, indem Sie den dahinter liegenden Bootswippschalter drücken und 5 Minuten warten , bis sich das System stabilisiert und Druck erreicht hat. Überprüfen Sie dann den Bildschirm für den pneumatischen Bericht, um sicherzustellen: (i) Der Druckbehälterausgang erreichte ~ 2000 mBar und (ii) Der Vakuumbehälterausgang erreichte ~ 850 mBar.
- Nehmen Sie jede Platte aus der Verpackung und untersuchen Sie jeden Brunnen visuell auf mögliche Mängel (fehlende Gerüste, Risse usw.).
- Setzen Sie einen Treiber (mit aufgesetzter Platte) in die Dockingstation ein, um zu überprüfen, ob der Treiber von der Dockingstation und dem Controller erkannt wird. Überprüfen Sie, ob die Druckbehälterleistung um weniger als 100 mBar gesunken ist und die Vakuumbehälterleistung um weniger als 500 mBar gestiegen ist.
- Bereiten Sie jede Vertiefung vor, indem Sie 500 μL Seeding Advanced DMEM-Medium (vorgewärmt auf 37 °C) auf der Reservoirseite hinzufügen.
- Wählen Sie das Prime-Programm auf dem Bildschirm des Reglers (Aufwärtsdurchfluss für 3 min bei 2,5 μL/s), bis die Flüssigkeit durch die Filterhalterungen kommt. HINWEIS: "Up-Flow" ist eine Einstellung am Controller, die es ermöglicht, Medien vom Behälter nach oben durch die Gerüste in der LC12-Platte zu fließen.
- Füllen Sie alle Vertiefungen mit weiteren 1,1 ml Seeding Advanced DMEM-Medium, um den Oberflächenkanal abzudecken. Alle Bohrlöcher werden dann ihr volles Arbeitsvolumen von 1,6 ml erreichen.
- Platzieren Sie die Treiber mit Platten in einem 37 °C und 5% CO2 Inkubator, schließen Sie sie an die Dockingstation an und führen Sie das Incubate-Programm aus.
HINWEIS: Alle im Experiment verwendeten Programme (Prime, Incubate, Seed, Media Change) sind im MPS-System voreingestellt. Bereiten Sie die Platten im Inkubator vor, bis sie säfertig sind.
3. Aussaat von Leberzellen in MPS (Tag 0)
- Validieren Sie alle PHHS und HKCs vorab. Alle PHHs und HKCs Lots werden intern vor der Durchführung des Zellkulturexperiments vorvalidiert (siehe Ergänzungsmaterial).
- Auftauen von Fläschchen mit PHHs und HKC-Zellen (Table of Materials), indem Sie die Fläschchen gleichmäßig in einem 37 °C warmen Wasserbad halten, bis nur noch ein kleiner Eissplitter übrig bleibt.
- PHHs werden direkt in ein Röhrchen mit vorgewärmtem (37 °C) kryokonserviertem Hepatozyten-Recovery Medium CHRM-Medium pipettiert (maximal zwei Fläschchen pro Röhrchen).
- Pipetten Sie die Zellen vorsichtig und verwenden Sie dann 1 ml CHRM, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kryoröhrchen zu waschen. Seien Sie sehr schonend mit Zellen beim Auftauen und Übertragen in ein konisches Röhrchen.
VORSICHT Rühren Sie die Durchstechflaschen während des Auftauens nicht und pipetten Sie ihren Inhalt nicht nach oben und unten. - Pipettieren Sie HKC-Zellen vorsichtig aus dem Kryoröhrchen in 10 ml eiskaltes Seeding Advanced DMEM-Medium in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Bis zu 2 Durchstechflaschen mit HKCs können kombiniert werden. - Zentrifugieren Sie beide Zelltypen bei Raumtemperatur (RT) bei 100 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die PHHs in warmem Seeding Advanced DMEM-Medium und HKCs in eiskaltem Seeding Advanced DMEM-Medium (um die Zellverklumpung zu reduzieren), verwenden Sie 1 ml pro Durchstechflasche mit Zellen, die dem Röhrchen hinzugefügt werden, und legen Sie die Zellen auf Eis. Verwenden Sie eine sanfte Schaukelwirkung, um die Zellen zu resuspendieren.
VORSICHT: PHHs nicht durch Pipettenwirkung resuspendieren, da dies zum Zelltod führen kann. - Kombinieren Sie die Zellsuspensionen aus mehreren Röhrchen (falls zutreffend - d.h. wenn alle PHHs vom selben Spender stammen), aber mischen Sie keine Zelltypen.
- Zellen zählen. Notieren Sie die Lebensfähigkeit (muss für beide Zelltypen, PHHs und HKCs, über 85% liegen) und die Gesamtzahl der Zellen. Wenn die Zelllebensfähigkeit unter 85% fällt, tauen Sie eine neue Durchstechflasche mit Zellen auf und bewerten Sie die Zelllebensfähigkeit neu.
- Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit mit der folgenden Formel:
- Berechnen Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension, um in jede Vertiefung zu säen, und das zusätzliche Volumen des Seeding Advanced DMEM-Mediums, das benötigt wird, um das Gesamtsaatvolumen auf 400 μL zu erhöhen. Zellzahlen pro Vertiefung: 0,4 x 10 6 PHHs und 0,04 x 10 6 HKCs pro Vertiefung und Zelldichte von 0,25 x 106 PHHs/ml, bzw. 0,025 x 106 HKCs/ml.
- Trennen Sie den Treiber von der Dockingstation, und setzen Sie ihn in den MBSC ein.
- Saugen Sie die Medien vom obigen Gerüst zum Haltepunkt (die tiefe Kerbe am Sicherungsring hinunter), Kanal und Reservoir ab. Lassen Sie ein "Totvolumen" von 0,2 ml in der Kulturmulde, das knapp über das Gerüst reicht. Es muss darauf geachtet werden, das gesamte Medium nicht von oberhalb des Gerüsts zu entfernen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Geben Sie 400 μL Seeding Advanced DMEM-Medium in die Bohrlochkammer, setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Media Change-Programm 3 Minuten lang aus. Das Programm pausiert automatisch nach 3 min.
- Wenn Sie fertig sind, trennen Sie den Treiber von der Dockingstation, und setzen Sie ihn wieder in den MBSC ein.
- Saugen Sie die Medien vom obigen Gerüst bis zum Haltepunkt und am Ende jedes Bohrlochs ab.
- Resuspendieren Sie die PHHs vorsichtig, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schaukeln, und fügen Sie dann das erforderliche Volumen der Zellsuspension zu jeder Kulturmulde hinzu. Pipetten Sie vorsichtig die Zellsuspension und stellen Sie sicher, dass sich die Zellen gleichmäßig über das Gerüst der Platte verteilen.
HINWEIS: Um eine gute Abdeckung im gesamten Gerüst zu gewährleisten, verwenden Sie eine langsame wirbelnde Bewegung, um die Zellen auf das Gerüst zu pipettieren. - In ähnlicher Weise sollten Sie HKCs vorsichtig resuspendieren und die Zellsuspensionen zu jeder Kultur hinzufügen.
HINWEIS: Verwenden Sie eine langsame Wirbelbewegung, um HKCs zu säen, um eine gute Abdeckung im gesamten Gerüst zu gewährleisten. Die beiden Seeding-Teilschritte können getrennt werden, oder die beiden Zelltypen können in geeigneter Dichte vorgemischt und gleichzeitig ausgesät werden. - Sobald alle Vertiefungen beide Zelltypen enthalten, platzieren Sie den MPS-Treiber auf der Dockingstation im Inkubator, ohne ihn physisch zu verbinden, und lassen Sie ihn 1 Stunde stehen.
- Nach 1 h füllen Sie jede Vertiefung mit dem erforderlichen Volumen an zusätzlichem Seeding Advanced DMEM-Medium, um 400 μL zu erreichen, und führen Sie das Seed-Programm aus.
- Nach 2 Minuten pausiert das Programm automatisch, entfernt den Treiber aus dem Inkubator und gibt langsam 1000 μL des Seeding Advanced DMEM-Mediums in den Kanal (näher am Reservoirende als an der Bohrlochkammer), um ein Gesamtvolumen von 1,4 ml zu erreichen (mit weiteren 200 μL Totvolumen in den Kanälen).
- Bewegen Sie die Platten in den Inkubator und führen Sie den Rest des Seed-Programms für 8 h aus.
HINWEIS: Flow schaltet nach 8 h automatisch auf das Inkubationsprogramm um.
4. Medienwandel (Tag 1)
- Trennen Sie den Treiber von der Dockingstation, und setzen Sie ihn in den MBSC ein.
- Führen Sie einen Medienwechsel durch, indem Sie das DMEM-Medium Seeding Advanced in der Bohrlochkammer bis zum Haltepunkt entfernen.
- Geben Sie 400 μL des Maintenance Advanced DMEM-Mediums in die Bohrlochkammer, setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Medienwechselprogramm 3 Minuten lang aus. Das Programm pausiert automatisch nach 3 min.
- Trennen Sie den Treiber von der Dockingstation, und saugen Sie im MBSC Medien aus der Behälterkammer, dem Kanal und dem Haltepunkt über dem Gerüst ab. An diesem Punkt wird der Kulturbrunnen in das tote Volumen zurückgeführt.
- Füllen Sie die Behälterkammer mit 1,4 ml frischem, vorgewärmtem (37 °C) Maintenance Advanced DMEM-Medium auf.
- Setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein, und führen Sie das Incubate-Programm aus.
5. Qualitätskontrolle des Lebermikrogewebes (QC), Mediensammlung, Medienwechsel und Medikamentendosierung (Tag 4)
- Führen Sie an Tag 4 einen Medienwechsel mit dem Maintenance Advanced DMEM-Medium und QC-Prüfungen durch, um sicherzustellen, dass die Aussaat erfolgreich war.
HINWEIS: QC ist ein Verfahren zur Überprüfung der Gesundheit der gebildeten Mikrogewebe durch Messung der Laktatdehydrogenase (LDH) und Harnstoff. - Bevor Sie die QC ausführen, bereiten Sie frische Stammlösungen für jede zu testende Verbindung vor (entweder in Maintenance Advanced DMEM-Medium oder Maintenance Advanced DMEM-Medium mit 0,1% DMSO, abhängig von der Löslichkeit jeder Verbindung). Bereiten Sie die Verdünnungen entsprechend vor, um Testkonzentrationen für jede Verbindung zu erhalten.
- Trennen Sie den Treiber und die Platte von der Dockingstation, und übertragen Sie sie auf ein MBSC.
- Übertragen Sie 50 μL Medien aus jeder Vertiefung mit einer Pipette auf eine 96-Well-Platte, um vor der Probenahme einen LDH-Assay (Table of Materials) durchzuführen, und 25 μL für einen Harnstofftest (Table of Materials).
HINWEIS: LDH- und Harnstofftests werden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. - Setzen Sie das Experiment nach der QC fort, wenn die LDH-Werte niedriger als 2 AU/10 6 Zellen und der Harnstoff über 40 μg/Tag/106 Zellen liegt.
HINWEIS: Albumin wird nicht als QC verwendet, da es sich um einen langwierigen Test handelt, der an diesem Tag durchgeführt wird und später analysiert wird, sobald das Experiment aus den am Tag 4 entnommenen Proben abgeschlossen ist. - Wenn Bohrlöcher QC versagen, entfernen Sie sie aus dem experimentellen Design.
- Sobald das experimentelle Layout bestätigt ist, beproben Sie die verbleibenden Medien aus jeder Vertiefung und stellen Sie sicher, dass die Zellkultur nicht durch Berühren des Gerüsts gestört wird. Lagern Sie die gesammelten Medien (gekennzeichnet als Vordosisproben) bei -80 °C für spätere Assays.
- Führen Sie einen Medienwechsel in einem MBSC aus, indem Sie die Schritte 4.3-4.5 ausführen. Ändern Sie die Vertiefungen auf Maintenance Advanced DMEM-Medium mit der richtigen Arzneimittelkonzentration gemäß dem experimentellen Design.
- Wenn Sie fertig sind, setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Incubate-Programm aus.
6. Mediensammlung, Medienwechsel und Medikamentendosierung (Tag 6)
- Bereiten Sie frische Stammlösungen für jede zu testende Mischung vor (entweder in Maintenance Advanced DMEM-Medium oder Maintenance Advanced DMEM-Medium mit 0,1% DMSO, abhängig von der Löslichkeit jeder Verbindung). Bereiten Sie die Verdünnungen entsprechend vor, um Testkonzentrationen für jede Verbindung gemäß dem Plattenplan zu erhalten.
- Trennen Sie den Treiber und die Platte von der Dockingstation und übertragen Sie sie auf ein MBSC.
- Sammeln Sie Medien aus jeder Vertiefung (~ 1 ml) manuell mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass die Zellkultur nicht gestört wird, indem Sie das Gerüst berühren, Assay für LDH und Harnstoff. Lagern Sie den Rest der gesammelten Medien bei -80 °C für spätere Assays und kennzeichnen Sie sie 48 h nach der Verabreichung.
- Wiederholen Sie jede Vertiefung mit der gleichen Arzneimittelkonzentration wie an Tag 4 und gemäß dem Plattenplan, indem Sie den Medienwechsel gemäß den Schritten 4.3-4.5 durchführen.
- Wenn Sie fertig sind, setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Incubate-Programm aus.
7. Das Experiment beenden (Tag 8)
- Trennen Sie den Treiber und die Platte von der Dockingstation und übertragen Sie sie auf ein MBSC.
- Probenahme von Medien aus jeder Vertiefung manuell mit einer Pipette, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellkultur nicht durch Berühren des Gerüsts gestört wird.
- Untersuchen Sie die entnommenen Medien auf LDH und Harnstoff und lagern Sie den Rest der gesammelten Medien bei -80 °C für spätere Untersuchungen.
- Ausführender CYP3A4-Glo-Assay.
- Messen Sie die Auswirkungen der getesteten Medikamente auf die Cytochrom P450 CYP3A4-Aktivität in PHHs am Ende des Experiments mit diesem Assay.
- Rekonstituieren Sie das Detektionsreagenz (für den CYP3A4-Assay siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn das Detektionsreagenz zuvor rekonstituiert und eingefroren wurde, nehmen Sie es aus dem -20 °C Gefrierschrank und lassen Sie es bei RT auftauen.
- Bereiten Sie 20 mM Vorrat D-Luciferin Standard nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Sie das funktionierende luminogene Substratmedium mit einer 1:1000-Verdünnung von Luciferin IPA in Maintenance Advanced DMEM-Medium (2 ml luminogenes Substratmedium pro Well) vor.
- Führen Sie einen Medienwechsel wie in den Schritten 4.3-4.5 beschrieben mit einem luminogenen Substratmedium durch. Speichern Sie 500 μL des luminogenen Substratmediums in einem 1,5 mL Glasfläschchen (Table of Materials) als Eingangsmaterial.
- Setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Incubate-Programm 1,5 h lang aus.
- Bereiten Sie die D-Luciferin-Standardkurve in Kulturmedium in 1,5-ml-Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und pipettieren Sie 50 μl jedes Standards in zweifacher Ausfertigung auf einer weißen, opaken 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle) unter Verwendung des Kulturmediums als Rohling oder 0 μM.
- Sobald die Zeit abgelaufen ist, entfernen Sie den Treiber aus der Dockingstation und probieren Sie die Medien für den CYP3A4-Test gemäß den Schritten 7.4.9-7.4.13 aus.
- Nach der Inkubation werden 50 μL des Probenmediums aus jeder Vertiefung und jedem Eingangsmaterial in die 96-Well-opake weiße Luminometerplatte mit Standards überführt. Achten Sie darauf, mindestens zwei leere Reihen auf der undurchsichtigen Platte zwischen den Standards und den Proben zu belassen, um eine leichte Verschleppung zwischen den oberen Standards und den Messwerten der Proben zu vermeiden.
- Fügen Sie 50 μL Luciferin Detection Reagenz in jede Vertiefung hinzu, um eine Lumineszenzreaktion auszulösen.
- Inkubieren Sie die Platte bei RT auf einem Plattenschüttler für 20 Minuten im Dunkeln, um das Lumineszenzsignal zu stabilisieren.
- Zeichnen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer oder einer CCD-Kamera auf.
- Zeichnen Sie die Standardkurve, indem Sie den Mittelwert jedes Punktes nehmen und dann den Mittelwert der Leerzeichen subtrahieren. Verwenden Sie die Gleichung der Linie, um die Stoffwechselrate (pmol/min/106 Zellen) in den übrigen Proben zu berechnen, wobei Sie daran denken, alle durchgeführten Verdünnungen einzubeziehen.
- Entfernen Sie die Gerüste mit einer Pinzette von den Platten und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit 500 μL D-PBS (ohne Ca++ und Mg++) in jeder Vertiefung, wobei Sie darauf achten, das Mikrogewebe nicht zu stören.
- Machen Sie Schnappschüsse von jedem Gerüst mit einem Inverslichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
- Durchführung des ATP-Assays (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers:
- Das Reagenz bei RT auftauen.
- Waschen Sie die Gerüste zweimal mit 500 μL D-PBS (ohne Ca++ und Mg++) für jeden Waschschritt.
- Fügen Sie 120 μL Reagenz und 120 μL PBS zu jedem Gerüst und die gleichen Volumina in eine leere Vertiefung (dies dient als leer). Legen Sie die mit Aluminiumfolie bedeckte Platte auf einen Shaker und schütteln Sie sie kräftig (500 U/min) für 5 Minuten, gefolgt von 30 Minuten Inkubation, um das Lumineszenzsignal zu stabilisieren.
- 100 μL der lysierten Proben werden zur Messung in zweifacher Ausfertigung auf eine klare 96-Well-Assay-Platte mit flachem Boden überführt. Stellen Sie sicher, dass die leeren Vertiefungen nicht neben den anderen Messtöpfen mit hoher Lumineszenz platziert werden.
- Erfassen Sie die Lumineszenz mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät.
- Vergleichen Sie die Lumineszenz der Proben mit der Lumineszenz der Standards, um das vom Reagenz in den Proben nachgewiesene ATP zu bestimmen.
Representative Results
Das Manuskript beschreibt ein Leber-MPS-Modell, das zur Beurteilung von DILI verwendet wird. Das MPS ermöglicht die Erzeugung von 3D-Lebermikrogeweben, die bis zu 4 Wochen lang hochfunktionell im Fluss gehalten werden. PHHs/HKCs werden auf kollagenbeschichtete Gerüste gesät, um Lebermikrogewebe zu bilden, die mit einem Wachstumsmedium durchblutet und nach bestandener QC-Prüfung mit Verbindungen dosiert werden. Hier zeigen wir Daten für Troglitazone und Pioglitazon, zwei strukturell ähnliche Verbindungen, aber mit unterschiedlichen DILI-Schweregraden.
An Tag 4, vor der Medikamentendosierung, wird eine QC-Überprüfung der gebildeten Lebermikrogewebe bewertet und besteht aus LDH-Freisetzung und Harnstoffsynthese (Abbildung 1A). Die QC zielt darauf ab, zu bestätigen, dass das Leber-MPS sehr konsistente und funktionierende Lebermikrogewebe produziert. Die hier vorgestellten Daten stammen aus drei Experimenten und zeigen eine gute Reproduzierbarkeit mit geringer Variabilität innerhalb und zwischen Studien. Nach einer 8-tägigen Kultur werden mehrere Gesundheits- und Lebermetriken (Albumin, Harnstoff, CYP3A4, ATP) bewertet und Kontrollmikrogewebe zeigen ein hohes Maß an Leberfunktionalität und Reproduzierbarkeit (Abbildung 1B,C). Die Kontrastphasenmikroskopie und IF-Färbung der Lebermikrogewebe (siehe Ergänzungsmaterial) zeigt eine hohe Seeding-Konsistenz über die Mikrokanäle des Gerüsts und zeigt die Verteilung von HKCs in den PHH-Mikrogeweben (Abbildung 1D)
Abbildung 1: Leber-MPS produziert hochreproduzierbare Daten und konsistente Mikrogewebe. (A) 3D-Lebermikrogewebe-QC-Metriken an Tag 4 und Funktionsbewertung am Ende der Studie an Tag 8 -(B) Albumin und Harnstoff, (C) CY3A4 und ATP). Die Daten stammen aus 3 Experimenten; In jedem Experiment gab es 3 Fahrzeugsteuerungsreplikate. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD, N = 9. (D) Phasenkontrastmikroskopie (10x und 20x) und IF von 3D-Lebermikrogeweben, die durch Kokulturierung von PHHs und HKCs in der Leber-MPS-Plattform zur Beurteilung von DILI erzeugt werden. Um die HKCs zu visualisieren, wurden HKCs vor der Aussaat mit einem adenoviralen Vektor transduziert, der eGFP exprimiert (siehe Ergänzungsmaterial). Gezeigt werden repräsentative Mikrofotoaufnahmen. Die Transduktion und Bildgebung wurden als eigenständiges Experiment durchgeführt, um die Zelllokalisierung zu demonstrieren, und nicht mit dem beschriebenen DILI-Protokoll. HKC-Zellen werden vor der Verwendung in experimentellen Zellkulturen intern vorvalidiert und müssen eine geringe Aktivierung nach dem Auftauen aufweisen. Dies wird durch die Messung der Biomarker IL-6 und TNF-alpha bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es ist bekannt, dass Troglitazone schwere DILI verursacht; Nach seiner Zulassung zur Behandlung von Typ-2-Diabetes wurde es von der FDA nach 3 Jahren auf dem Markt wegen der Häufigkeit von Leberschäden im Zusammenhang mit seiner Verwendung zurückgezogen. Bisher konnten veröffentlichte Tierstudien das Potenzial von Troglitazon, schwere Leberschäden zu verursachen, nicht vorhersagen. Die Toxizität dieser Verbindung wurde auch in Standard-In-vitro-2D-Lebertests nicht nachgewiesen14.
Lebermikrogewebe im MPS wurden 96 h lang mit Troglitazone dosiert, und es verursachte eine akute toxische Reaktion, Cmax getrieben, die durch ALT- und LDH-Freisetzung und eine schnelle Verringerung der Albumin- und Harnstoffproduktion bei etwa 15 x Cmax nach akuter Exposition gegenüber Troglitazone nachgewiesen wurde (Abbildung 2A). Der zelluläre Endpunkt (ATP-Gehalt) und die CYP3A4-Aktivität (zur Beurteilung der metabolischen Biotransformation), die nach 96-stündiger Exposition entnommen wurden, bestätigten die durch Troglitazone verursachte Toxizität und die EC:50-Werte waren mit anderen Endpunkten in hohem Maße vergleichbar (Abbildung 2B). Hellfeldmikroskopie-Bilder, die nach 8-tägiger Kultur im MPS aufgenommen wurden, zeigen ein gesundes Lebermikrogewebe, das gleichmäßig im gesamten Gerüst ausgesät ist (Vehikelkontrolle), im Gegensatz zu generalisiertem Gewebetod/-abbau, wie er bei den mit Positivkontrolle behandelten Replikaten und Troglitazone bei den oberen beiden Testkonzentrationen beobachtet wurde (Abbildung 2C).
Abbildung 2: Bestimmung des DILI-Risikos von Troglitazone unter Verwendung mehrerer hepatotoxischer Endpunkte. Lebermikrogewebe wurden 96 h lang sieben Testkonzentrationen von Troglitazone ausgesetzt und hinsichtlich (A) LDH-Freisetzung, ALT-Freisetzung, Albuminproduktion, Harnstoffsynthese, CYP3A4-Aktivität und ATP-Gehalt verglichen. Blaue Linien - 48 Stunden Exposition (nur Medienendpunkte), rote Linien - 96 Stunden Belichtung. Die Positivkontrolle betrug 100 μM Chlorpromazin. Alle Endpunkte werden aus denselben Leber-MPS-Kulturen gemessen. Die angegebenen Daten sind Mittelwert ± SD, N = 3. (B) Zusammenfassung der aus den Daten generierten E:50-Zahlen. N.D. = Daten nicht plottbar. Linie = nicht untersucht. (C) Repräsentative Hellfeldmikroskopie von Lebermikrogeweben nach 8-tägiger Kultur (10-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Lebertoxizität nach Exposition gegenüber Pioglitazon wurde ebenfalls untersucht. Pioglitazon ist eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie von geringer DILI-Besorgnis4 ist und in klassischen 2D-Primärhepatozytenkulturen und sogar in einigen fortgeschritteneren 3D-Modellen keine Hepatotoxizität ausübte10,11. Leichte hepatotoxische Wirkungen wurden zu beiden getesteten Zeitpunkten beobachtet (Abbildung 3). Es wurde keine LDH- oder ALT-Freisetzung festgestellt; Nach 48 h wurde jedoch eine leichte Verringerung der Albumin- und Harnstoffproduktion bei ca. 25xC max beobachtet (Abbildung 3A). Eine sehr geringe Verringerung des ATP-Gehalts wurde auch bei hohen Pioglitazon-Konzentrationen beobachtet, was jedoch nicht signifikant war. EC:50-Werte, die aus Dosis-Wirkungs-Kurven generiert werden, sind in Abbildung 3B dargestellt. Die Mikroskopie zeigte eine leichte Veränderung des Mikrogewebes nach 96 h Exposition bei Pioglitazon bei den beiden höchsten getesteten Konzentrationen (Abbildung 3C). Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Leber-MPS, die Toxizität von Verbindungen mit leichter DILI-Besorgnis nachzuweisen.
Abbildung 3: Bestimmung des DILI-Risikos von Pioglitazon unter Verwendung mehrerer hepatotoxischer Endpunkte. Lebermikrogewebe wurden 96 h lang sieben Testkonzentrationen von Pioglitazon ausgesetzt und hinsichtlich (A) LDH-Freisetzung, ALT-Freisetzung, Albuminproduktion, Harnstoffsynthese, CYP3A4-Aktivität und ATP-Gehalt verglichen. Blaue Linien - 48 Stunden Exposition (nur Medienendpunkte), rote Linien - 96 Stunden Belichtung. Die Positivkontrolle betrug 100 μM Chlorpromazin. Alle Endpunkte werden aus denselben Leber-MPS-Kulturen gemessen. Die angegebenen Daten sind Mittelwert ± SD, N = 3. (B) Zusammenfassung der aus den Daten generierten EG:50-Zahlen. N.D. = Daten nicht plottbar. Linie = nicht untersucht. (C) Repräsentative Hellfeldmikroskopie von Lebermikrogeweben nach 8-tägiger Kultur (10-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Durch die Bewertung aller funktionellen Endpunkte und Toxizitäts-Biomarker, die In-vivo - oder klinische Szenarien darstellen könnten (LDH-Freisetzung, Harnstoffsynthese, Albuminproduktion, CYP3A4-Aktivität, ATP-Gehalt, ALT-Freisetzung) und Bestätigung der Daten, die für beide getesteten Verbindungen generiert wurden, die in einem Sieben-Punkte-Dosisbereich für 48 h und 96 h dosiert wurden, wurde eine Heatmap erstellt, die eine "Signatur der Hepatotoxizität" liefert. hilft bei der Identifizierung von Verbindungen mit unterschiedlichem Grad an DILI-Bedenken (Abbildung 4).
Abbildung 4: Bestimmung der "Toxizitätssignatur" mit Leber-MPS. Heatmap von Troglitazone und Pioglitazon von sechs funktionellen leberspezifischen Endpunkten (LDH-Freisetzung, Harnstoffsynthese, Albuminproduktion, ALT-Freisetzung, CYP3A4-Aktivität und ATP-Gehalt) nach 48 h und 96 h Exposition im Sieben-Punkte-Dosisbereich. Jeder Wert wird als Mittelwert, N = 3, generiert und normalisiert, um Stichproben zu steuern. Die Werte auf den Farbbalken stellen eine Faltungserhöhung gegenüber Baseline-Steuerelementen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsmaterial: Fluoreszierende mikroskopische Bildgebung von Mikrogeweben und Präqualifizierung von Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
MPS wurden entwickelt, um funktionelle Einheiten menschlicher Organe in vitro zu rekapitulieren und wurden entwickelt, um die Einschränkungen herkömmlicher 3D-Zellkulturmodelle zu überwinden27. Die Leber ist eines der am meisten modellierten Organe mit MPS, und eine Vielzahl von Systemen wurde entwickelt. Die menschliche Leber ist verantwortlich für den Arzneimittelstoffwechsel und die Erzeugung toxischer Arzneimittelmetaboliten, und ihre Funktion ist ein Schlüsselelement für das Modell für die Arzneimittelentwicklung, einschließlich der Bewertung der DILI-Haftung von Verbindungen28. Hier haben wir eine neue Methode zur Beurteilung von DILI mit einem Leber-MPS eingeführt; Das Protokoll ermöglicht es, mechanistische Erkenntnisse für jede untersuchte Verbindung zu gewinnen, um zu bestimmen, wie sie DILI verursachen kann, und es handelt sich um einen hochempfindlichen und robusten Assay. Lebermikrogewebe werden in den MPS-Platten gebildet, die eine Kokultur von PHH und HKCs sind und im Vergleich zu Standard-In-vitro-Lebermodellen hochfunktionell mit hoher Albumin- und Harnstoffproduktion sowie hoher CYP3A4-Aktivität sind20.
Obwohl das hier beschriebene DILI-Modell als nützliches Werkzeug in späteren Phasen der präklinischen Prüfung im Arzneimittelentwicklungsprozess dienen kann, hat es auch einige Einschränkungen. Wie die Mehrheit der MPS, die derzeit auf dem Markt erhältlich sind, ist es eine Plattform mit niedrigem Durchsatz und daher schwieriger für groß angelegte Drogenscreening-Aktivitäten zu verwenden. Das DILI-Modell, das aus Mikrogeweben besteht, die durch die Kokulturierung von PHHs und HKCs gebildet werden, kann auch die Komplexität der menschlichen Leber nicht vollständig erfassen, und eine weitere Optimierung durch die Einbeziehung verschiedener Zelltypen (z. B. Immunzellen) wäre vorteilhaft, um dem bestehenden Modell einen Mehrwert zu verleihen. Dieses Einzelorgan-MPS könnte auch mit anderen Organplattformen kombiniert werden, die ein gemeinsames Medium teilen und Organübersprechen auf zellulärer oder endokriner Ebene ermöglichen und dazu beitragen können, die mechanistischen Erkenntnisse der Toxizität besser zu verstehen, die nicht nur auf die Leber selbst beschränkt sind. Darüber hinaus könnte sie, wie jede relativ neue Technologie, als kostspielig und daher als nur begrenzt zugänglich angesehen werden.
MPS ist eine Plattform zur Entwicklung organotypischer Modelle von einzel- oder mehrmenschlichem Gewebe. Das System besteht aus einem Controller, einem Nabelkabel und einem MPS-Treiber, in den die Platte eingesetzt wird (Abbildung 5A). Jede Leber-MPS-Platte verfügt über 12 unabhängige offene Vertiefungen für die Kultivierung primärer Leberzellen in 3D auf technischen Gerüsten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das System QC-geprüft wird, und die Platten werden an Tag -1 grundiert, die PHHs und HKCs werden am Tag Null auf die Platten gesät (Abbildung 5B, siehe 1). Eingebettete Mikropumpen erleichtern die Zirkulation von Zellkulturmedien durch die Gerüste, um die Bildung von 3D-Mikrogeweben zu erleichtern (Abbildung 5B, siehe 2). Gebildete Mikrogewebe werden an Tag 4 mit QC behandelt, 4 Tage lang alle 48 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen jeder Verbindung dosiert und an Tag 8 auf Endpunkt-Biomarker untersucht (Abbildung 5C). Der experimentelle Zeitplan des DILI-Assays in der MPS-Platte ist in Abbildung 5D dargestellt.
Abbildung 5: Das mikrophysiologische System und die experimentelle Zeitleiste eines Standard-DILI-Assays. (A) Das mikrophysiologische System mit seinen Komponenten: Controller (1), Nabelkabel (2), Dockingstation (3), MPS-Treiber (4) und LC12-Platte (5). (B) Die Aussaat von PHHs und HKCs auf LC12-Platten am Tag 1 (1) und eingebettete Mikropumpen erleichtern die Zirkulation von Zellkulturmedien mit einstellbaren Flussraten durch die auf den Gerüsten ausgesäten 3D-Mikrogewebe (2). (C) Abbau der Gerüste am Ende der Studie. (D) Experimenteller Zeitplan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Bei der Durchführung des Protokolls ist es wichtig, dass vor dem Start eine robuste System-QC-Prüfung durchgeführt wird, um zu überprüfen, ob das System pneumatisch korrekt funktioniert und die Verschleißplatten visuell geprüft und effizient grundiert werden, um eine gleichmäßige Funktionalität über alle Bohrlöcher hinweg sicherzustellen. Qualitativ hochwertige primäre menschliche Zellen sind für dieses Protokoll unerlässlich, wobei Hepatozyten bekanntermaßen in Zellkulturexperimenten konsistent haften und 3D-Wechselwirkungen bilden. Das Auftauen dieser Zellen ist ebenfalls ein kritischer Schritt, da primäre Hepatozyten nicht durch Pipettieren resuspendiert werden sollten, da dies schnell zum Zelltod führen kann. Eine Zelllebensfähigkeit von über 85% ist entscheidend für eine erfolgreiche Aussaat, da große Mengen an Zelltrümmern die Bildung von 3D-Mikrogewebe beeinträchtigen. Die QC-Überprüfung von gebildetem Lebermikrogewebe an Tag 4 ist ebenfalls wichtig, und der Benutzer muss sicherstellen, dass akzeptable LDH- und Harnstoffwerte gemessen werden, da Parameter außerhalb des Bereichs auf eine schlechte Gewebebildung hinweisen und eine einfache Fehlerbehebung ermöglichen können. Schließlich muss das in den Zellkulturmedien verwendete Hydrocortison am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden, um einen unerwünschten Abbau zu vermeiden, der die Zellkulturfunktionalität beeinträchtigen könnte, da es zur Aufrechterhaltung der metabolischen Funktionalität der Hepatozyten erforderlich ist.
Trotz erheblicher Komplexität enthält das Leber-MPS nicht alle Zelltypen der menschlichen Leber. Es ist möglich, dem Modell24,29 weitere Zelltypen hinzuzufügen, um die physiologische Relevanz zu erhöhen, aber diese sollten nur mit einer klaren Begründung für den Anwendungskontext hinzugefügt werden. Für die Untersuchung von DILI sind PHH der Schlüsselzelltyp, und die Einbeziehung von HKCs in dieses Modell ermöglicht es, einige immunologische Reaktionen zu bestimmen. Es sollte auch beachtet werden, dass PHHs, die aus menschlichen Lebern isoliert wurden, und kommerziell erhältliche kryokonservierte PHHs dazu neigen, einige Variationen von Charge zu Charge zu zeigen. Wir haben hier gezeigt, dass dieses Protokoll reproduzierbare Ergebnisse liefert, wenn es mit hochwertigen Zellpräparaten verwendet wird. Es wäre jedoch eine gewisse Los-Los-Variation zu erwarten, und dies könnte durch die Verwendung von gepoolten Losen mehrerer Spender weiter überwunden werden. Diese Einschränkungen könnten durch die Verwendung von hepatozytenähnlichen Zellen überwunden werden, die sich von iPSC unterscheiden und viele funktionelle Eigenschaften von PHHs rekapitulieren und die im Arzneimittelentwicklungsprozess verwendet wurden30. HKCs zeigen auch eine große Variabilität und ein hohes Maß an Aktivierung beim Auftauen; Daher werden HKC-Spender vor der Verwendung in experimentellen Zellkulturen (Kokultur mit validierten PHHs) intern vorvalidiert und müssen eine geringe Aktivierung nach dem Auftauen aufweisen. dies wird durch die Messung der Biomarker IL-6 und TNF-alpha beurteilt (siehe Ergänzungsmaterial).
Die hier vorgestellten Daten bestätigen, dass der Assay DILI genau nachweisen kann, was dazu beiträgt, hepatotoxische Substanzen zu identifizieren, die von 2D10,11 und sogar einigen 3D-Modellen möglicherweise nicht erkannt werden. Aus MPS generierte Daten werden von der pharmazeutischen Industrie aufgrund fehlender Prozessstandardisierung und -harmonisierung, einschließlich der Reproduzierbarkeit zwischen Standorten, immer noch nicht als Standard für Zulassungsanträge oder Arzneimittelscreenings verwendet20. Die hier gezeigten Daten und experimentellen Ansätze adressieren dies und zeigen, dass das Lebermodell routinemäßig und robust in DILI-Screens verwendet werden kann, um die Haftung neuartiger Verbindungen genau vorherzusagen.
Durch die Messung einer Reihe von Endpunkten zur Erzeugung einer "Signatur der Hepatotoxizität", die dazu beiträgt, Verbindungen mit unterschiedlichen DILI-Bedenken (einschließlich Verbindungen, die mit anderen In-vitro-Methoden nicht nachweisbar sind) zu identifizieren und ihre Toxizitätsmechanismen aufzudecken. Diese Technologie kann die Lücke zwischen traditionellen Zellkultur- und Tiermodellen auf der einen Seite und klinischen Studien am Menschen schließen und sich in Richtung Simulation menschlicher biologischer Bedingungen für die präklinische Bewertung der Lebertoxizität als Teil des Arzneimittelentwicklungsprozesses entwickeln.
Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter von CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. finanzierte diese Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
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